153. 90 (s)，147. 28 (s)，139. 8 1 (s)，139. 19 (s)，136. 14 (s)，134. 34 (s)，130. 77 (s)，128. 43 (s)，128. 01(s)，118. 85 (s)，11 8· 53 (s)，69. 03 (s)，45. 02 (s)，43. 70 (s)，37. 46 (s)，33. 09 (s)，25. 87 (s)，25. 06 (s)，24. 29 ( s)，23. 03 (s)，23. 05 (s)，22. 41 (s) ·
[0029] HRMS(ESI) :m/z[M+H]+calcd for C25H31N2O3:407. 2335 ；found:407. 2331 〇
[0031] 实施例4 Salviskinone A的0-(三唑基）乙基衍生物（IV)的合成
[0032] 将化合物II (209mg，0. 5mmol)溶于20mL乙腈当中，向其中加入无水碳酸钾 (345mg，2. 5mmol)，鹏化钾（84mg，0. 5mmol)和 1，2, 3-三氮挫（2760mg，40mmol)，混合物加热 回流4h。反应结束后将反应液倒入20mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有机相。 依次用水和饱和食盐水洗涤合并之后的有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂 得到产物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯化（流动相为：石油醚/丙酮=100:0.5, v/v)， 收集黄色集中洗脱带即得到化合物IV的黄色粉末（134. 3mg，66% )。
[0033] 1H NMR (500MHz，Chloroform-dl) δ 8. 37 (s，1H)，7. 95 (s，1H)，6. 35 (s，1H)，6. 14 (s， 1Η), 5. 35 (s, 1H), 4. 13 (s, 1H), 4. 42 (d, J = 16. 4Hz, 3H), 3. 71 (s, 1H), 2. 13 (s, 1H), 2. 05 (s, 1H) ,1-81 (s, 1H), I. 63 (s, 1H), I. 30 (s, 3H), I. 08 (s, 6H), 0. 97 (s, 6H).
[0034] 13C NMR (125MHz, DMS0-d6) δ 188. 09 (s)，183. 61 (s)，154. 18 (s)，147. 26 (s)，139. 7 2 (s)，136. 40 (s)，136. 32 (s)，134. 52 (s)，130. 95 (s)，127. 99 (s)，120. 16 (s)，118. 62 (s)，67 ? 14 (s)，46. 27 (s)，45. 18 (s)，37. 69 (s)，33. 32 (s)，26. 14 (s)，25. 01 (s)，24. 41 (s)，23. 23 (s )，23. 06 (s)，22. 47 (s) ·
[0035] HRMS(ESI) :m/z[M+H]+calcd for C24H30N303:408. 2287 ;found:408. 2282。
[0036]
[0037] 实施例5组合物抗急性痛风炎症实验
[0038] 1、溶液配制
[0039] 5g尿酸加 1000 ml蒸馏水煮沸，加5% NaOH溶液调PH 7. 4,搅拌，冷却析晶制成尿 酸钠结晶（MSU)。将制好的MSU IOmg高压灭菌，加不含血清的DMEM培养液10ml，研磨配成 lmg/ml的DMEM溶液。实验时，此溶液再加 DMEM培养液配成不同浓度DMEM的MSU溶液。
[0040] 组合物的制备：将研磨之后过200目网的IOmg化合物III的粉末和研磨之后过 200目网的90mg化合物IV的粉末装入带盖的小管中并用涡轮搅拌仪混合即得到IOOmg组 合物，使用时用水溶解这IOOmg的组合物即得到组合物的溶液。
[0041] 组合物、化合物III或者化合物IV 2. 5mg，用二甲基亚砜（DMSO)溶解，DMSO终浓 度〈0. 02 %，再加无血清的DMEM培养液，配制成浓度25ug/ml。
[0042] 2、血管内皮细胞的体外培养
[0043] 人脐静脉血管内皮细胞HUVEC株由南京中医药大学基础医学院提供，细胞经支原 体检测，无支原体污染，细胞经0. 25 %胰蛋白酶消化，含10 %小牛血清的DMEM培养液中和， 离心（100()以1^11\61^11)，去上清液，加含1()%小牛血清的01^1培养液，移入细胞培养瓶 中，放37 °C、5 % CO2培养箱中传代培养。
[0044] 3、对MSU刺激HUVEC活力的影响
[0045] HUVEC在培养瓶中培养，待生长至70 %~80 %融合时，以0. 25 %胰蛋白酶消化、离 心，10 %小牛血清DMEM培养液洗涤3次，用10 %小牛血清DMEM培养液调成4 X 104/ml细胞 悬液，植入96孔板（每孔200ul)，培养24小时后轻吸出原培养液，进行以下实验，每组各8 孔，具体分组及加液如下：对照组（200ul DMEM培养液）、模型组（100ug/ml MSU溶液）、干 预组（100ug/ml MSU溶液+25ug/ml的组合物或者化合物），加液后继续放37°C、5% 0)2培 养箱中培养24小时，收集上清液，剩余的HUVEC用于测定细胞活性，每孔再加5mg/ml MTT 液20ul，继续放37°C、5% CO2培养箱中培养4小时后，弃MTT液，加入二甲基亚砜200ul溶 解，震荡，于酶标仪读取吸光度值，波长490nm。
[0046] 数据统计学处理，细胞活力（％)=实验组吸光度值/对照组吸光度值X 100%， 结果见表1。
[0047] 与对照组相比，模型组细胞活力显著减小（Ρ〈0· 05)，组合物干预后细胞活力显著 提高（Ρ〈0. 05)，并强于对照组，而化合物III和化合物IV无此活性。
[0048] 表1组合物对MSU刺激的血管内皮细胞活力的影响（7 )
[0050] 注：与模型组相比，*Ρ〈0. 05 ;与对照组相比，ΛΡ〈0. 05
[0051] 4对ICAM-I表达影响
[0052] 将处于对数生长期的HUVEC用0. 25%的胰蛋白酶消化，轻轻吹打，制成细胞悬液， 调整细胞密度为5 X 109/L，接种于细胞培养瓶中。待细胞长满后（约24h)，弃去上清液，分 为下列组：对照组、模型组（l〇〇ug/ml MSU溶液）、干预组（100ug/ml MSU溶液+25ug/ml组 合物或者化合物），继续培养24小时，PBS收集细胞，离心去上清，加入CD54单克隆抗体， 30min后，PBS洗涤，重悬细胞，应用流式细胞仪检测其阳性细胞百分率（η = 10000)，重复3 次，结果见表2。
[0053] 表2组合物对MSU刺激的血管内皮细胞ICAM-I表达的影响:(7 )
[0055] 注：与模型组相比，*Ρ〈0. 05 ;与对照组相比，ΛΡ〈0. 05
[0056] 结果显示，空白组HUVEC几乎无 ICAM-I表达，模型组ICAM-I的表达最高，与模型 组相比，组合物对ICAM-I的表达有显著的抑制作用，而化合物III和化合物IV无显著的抑 制作用。
[0057] 结论：用MSU致HUVEC损伤的急性痛风模型评价显示，组合物可保护MSU致HUVEC 损伤，减少细胞凋亡，提高细胞活性，抑制ICAM-I表达，具有抗急性痛风炎症的活性，组合 物可用于制备治疗急性痛风炎症药物。而化合物III和化合物IV不能保护MSU致HUVEC 损伤，不能减少细胞凋亡，不能提高细胞活性，不能抑制ICAM-I表达，不具有抗急性痛风炎 症的活性，不能用于制备治疗急性痛风炎症药物。
[0058] 实施例6本发明所涉及组合物片剂的制备
[0059] 取2克组合物，加入制备片剂的常规辅料18克，混匀，常规压片机制成100片。
[0060] 实施例7本发明所涉及组合物胶囊的制备
[0061] 取2克组合物，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉18克，混匀，装胶囊制成100 粒。
【主权项】
1. 一种组合物，其特征为该组合物由化合物III和化合物IV组成，该组合物中化合物 III和化合物IV的质量百分数分别为10%和90%，2. 如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征为：将化合物III的粉末和化合物 IV的粉末按照质量百分数分别为10%和90%充分混合。3. 如权利要求1所述的一种组合物在治疗急性痛风药物中的应用。4. 如权利要求3所述的组合物在治疗急性痛风药物中的应用，其特征为：所述急性痛 风是由尿酸钠诱导的。5. 如权利要求3所述的组合物在治疗急性痛风药物中的应用，其特征为：组合物减少 人血管内皮细胞的损伤，提高人血管内皮细胞的活性。6. 如权利要求3所述的组合物在治疗急性痛风药物中的应用，其特征为：组合物减少 急性痛风过程中ICAM-1的表达。
【专利摘要】本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及组合物、制备方法及其在制备抗急性痛风药物上的用途。本发明公开了一种组合物及其制备方法。药理学实验表明，本发明的组合物具有抗急性痛风的作用，具有开发抗急性痛风药物的价值。
【IPC分类】A61K31/4192, A61P19/06, A61K31/4164
【公开号】CN105326832
【申请号】CN201510760446
【发明人】王卓婷
【申请人】南京赋海澳赛医药科技有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月10日