【具体实施方式】
[0040]以下结合具体实施例对本发明的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物及其制备方法和应用作进一步详细的说明。
[0041]实施例1
[0042]本实施例一种GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的制备方法，包括如下步骤:
[0043](1)将亚砸酸钠溶于水中，配制成50mM的亚砸酸钠溶液；
[0044](2)将冬凌草甲素溶于甲醇中，配制成50mM的冬凌草甲素溶液；
[0045](3)将抗坏血酸溶于水中，配制成50mM的抗坏血酸溶液；
[0046](4)将壳聚糖溶于体积分数为0.1-1%的醋酸水溶液中，配制成浓度为0.5被％的壳聚糖溶液；
[0047](5)将GE11多肽溶于水中，配制成50mg/mLGEl 1多肽溶液；
[0048](6)将1-(3-二甲基氨丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于水中，配制成500mM的EDC溶液；
[0049](7)将200 μ L的亚砸酸钠溶液与100 μ L的冬凌草甲素溶液、600uL的壳聚糖溶液混合，随后加入1600 μ L的抗坏血酸溶液，加入蒸馏水稀释到10mL后，静置于4°C反应12h ;将反应得到的溶液用蒸馏水进行透析，除去体系中多余的反应物即可得到冬凌草甲素-纳米砸复合物；
[0050](8)将40 μ L的EDC溶液与80 μ L的GE11多肽溶液与透析后得到的冬凌草甲素-纳米砸复合物在4°C静置反应12h ;将反应得到的溶液用蒸馏水进行透析，除去体系中多余的反应物即可得到GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物，所得到的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物既可直接以溶液形式保存在4°C，也可以经过离心或冷冻/真空干燥后以粉末形式保存。
[0051]如图1所示，在反应过程中，抗坏血酸将亚砸酸钠还原形成单质的砸，单质的砸聚集到一起形成纳米砸颗粒，该过程中，壳聚糖分子和冬凌草甲素分子将纳米砸颗粒包裹住，最终形成冬凌草甲素-纳米砸复合物。随后在H)C的作用下，GE11多肽被进一步修饰到冬凌草甲素-纳米砸复合物表面，形成GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物。
[0052]实施例2
[0053]本实施例一种GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的制备方法，包括如下步骤:
[0054](1)将亚砸酸钠溶于水中，配制成40mM的亚砸酸钠溶液；
[0055](2)将冬凌草甲素溶于甲醇中，配制成40mM的冬凌草甲素溶液；
[0056](3)将抗坏血酸溶于水中，配制成40mM的抗坏血酸溶液；
[0057](4)将壳聚糖溶于体积分数为0.1-1%的醋酸水溶液中，配制成浓度为20被％的壳聚糖溶液；
[0058](5)将GE11多肽溶于水中，配制成40mg/mLGEl 1多肽溶液；
[0059](6)将1-(3-二甲基氨丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于水中，配制成400mM的EDC溶液；
[0060](7)将25 μ L的亚砸酸钠溶液与25 μ L的冬凌草甲素溶液、100uL的壳聚糖溶液混合，随后加入250 μ L的抗坏血酸溶液，加入蒸馏水稀释到10mL后，静置于0°C反应20h ;将反应得到的溶液用蒸馏水进行透析，除去体系中多余的反应物即可得到冬凌草甲素-纳米砸复合物；
[0061](8)将2.5 μ L的EDC溶液与25 μ L的GE11多肽溶液与透析后得到的冬凌草甲素-纳米砸复合物静置于0°C反应20h ;将反应得到的溶液用蒸馏水进行透析，除去体系中多余的反应物即可得到GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物。
[0062]实施例3
[0063]本实施例一种GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的制备方法，包括如下步骤:
[0064](1)将亚砸酸钠溶于水中，配制成60mM的亚砸酸钠溶液；
[0065](2)将冬凌草甲素溶于甲醇中，配制成60mM的冬凌草甲素溶液；
[0066](3)将抗坏血酸溶于水中，配制成60mM的抗坏血酸溶液；
[0067](4)将壳聚糖溶于体积分数为0.1-1%的醋酸水溶液中，配制成浓度为20被％的壳聚糖溶液；
[0068](5)将GE11多肽溶于水中，配制成60mg/mLGEl 1多肽溶液；
[0069](6)将1-(3-二甲基氨丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于水中，配制成600mM的EDC溶液；
[0070](7)将1667 μ L的亚砸酸钠溶液与1667 μ L的冬凌草甲素溶液、5000uL的壳聚糖溶液混合，随后加入3333 μ L的抗坏血酸溶液，静置于37°C反应5h ;将反应得到的溶液用蒸馏水进行透析，除去体系中多余的反应物即可得到冬凌草甲素-纳米砸复合物；
[0071 ] (8)将166.7 μ L的EDC溶液与1667 μ L的GE11多肽溶液与透析后得到的冬凌草甲素-纳米砸复合物静置于37°C反应5h ;将反应得到的溶液用蒸馏水进行透析，除去体系中多余的反应物即可得到GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物。
[0072]实施例4
[0073]本实施例通过紫外分光光度计对实施例1所制得的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的结构进行表征。分别检测GE11多肽、冬凌草甲素、冬凌草甲素-纳米砸复合物和GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的紫外吸收。
[0074]如图2所示，冬凌草甲素-纳米砸复合物和GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物在265nm处有强的紫外吸收，且GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物在222nm处显示了 GE11多肽的特征吸收峰。以上结果说明GE11多肽被成功修饰到了冬凌草甲素-纳米砸复合物上。
[0075]实施例5
[0076]本实施例通过红外光谱检测仪对实施例1所制得的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的结构进行表征。分别检测GE11多肽、冬凌草甲素、纳米砸、冬凌草甲素-纳米砸复合物和GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的红外吸收。
[0077]如图3所示，冬凌草甲素在1709.86cm 1和1457.06cm 1处有特征吸收峰，而GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物在1689.41cm 1和1456.36cm 1处也有特征吸收峰。GE11多肽在1517.03cm 1处有特征吸收峰，而GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物在1523.78cm 1处也有特征吸收峰。以上结果说明冬凌草甲素和GE11多肽都被成功修饰到了纳米砸上形成了 GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物。
[0078]实施例6
[0079]本实施例通过激光纳米粒度仪对实施例1所制得的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的结构进行表征。分别检测冬凌草甲素-纳米砸复合物和GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的粒径和zeta电位分布。
[0080]如图4所示，冬凌草甲素-纳米砸复合物的平均粒径大概为60nm，而GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的平均粒径为70nm，说明GE11多肽的表面修饰GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的粒径增大。冬凌草甲素-纳米砸复合物的平均zeta电位为47mV，而GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的平均zeta电位为48mV，说明GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物表面带正电，且十分稳定。
[0081]实施例7
[0082]本实施例通过透射电子显微镜对实施例1所制得的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的结构进行表征。检测GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的形貌和粒径。
[0083]如图5所示，GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物为球形的颗粒，平均粒径为70nm左右。
[0084]实施例8
[0085]本实施例通过MTT法对实施例1所制得的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的结构进行表征抗癌活性进行表征。检测GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物对癌细胞和血管内皮细胞的增殖抑制作用。
[0086]如图6所示，GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物对HepG2细胞、HUVECs细胞和 MCF-7 细胞的 IC50 值分别为 33.2 ±8.7 μ M、38.6 ± 5.4 μ Μ 和 50.3 ± 11.9 μ M。以上结果说明GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物能有效抑制癌细胞和血管内皮细胞的增殖。
[0087]实施例9
[0088]本实施例通过流式细胞仪对实施例1所制得的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的结构进行抗癌活性表征。检测GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物对KYSE150细胞周期分布的影响。
[0089]如图7所示，GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物作用KYSE-150细胞48h后，分