布在S期的细胞由对照组的15.2%分别增加到29% (8 μ M),35.6% (16 μ Μ)和41.3% (32μΜ)。以上结果说明GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物可以将KYSE-150细胞的周期阻滞在S期。
[0090]实施例10
[0091]本实施例通过流式细胞仪对实施例1所制得的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的结构进行抗癌活性表征。检测GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物对KYSE150细胞线粒体膜电位的影响。
[0092]如图8所示，GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物作用KYSE-150细胞48h后，线粒体膜电位由对照组的85.1%分别降低到80.6% (8μΜ)、75.1% (16 μ Μ)和62.4%(32 μ Μ)。以上结果说明GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物可以破坏KYSE-150细胞的线粒体，弓丨起线粒体膜电位的降低。
[0093]实施例11
[0094]本实施例一种装载有香豆素6的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的制备方法，包括如下步骤:
[0095]按实施例1的方法分别配置50mM的亚砸酸钠溶液、50mM的抗坏血酸溶液、50mM的冬凌草甲素溶液、0.5 %的壳聚糖溶液、500mM的EDC溶液和50mg/ml的GE11多肽溶液，再配制2mg/mL的香豆素6溶液(溶剂为DMS0)。将200 μ L的亚砸酸钠溶液与100 μ L的冬凌草甲素溶液、100 μ L的香豆素6溶液、600uL的壳聚糖溶液混合，随后加入1600 μ L的亚砸酸钠溶液，加入蒸馏水稀释到10mL后，静置于4°C反应12h ;将反应得到的溶液用蒸馏水进行透析，除去体系中多余的反应物，即可得到冬凌草甲素-纳米砸复合物；将40 μ L的EDC溶液与80 μ L的GE11多肽溶液与透析后得到装载有香豆素6的冬凌草甲素-纳米砸复合物静置于4°C反应12h ;将反应得到的溶液用蒸馏水进行透析，除去体系中多余的反应物即可得到装载有香豆素6的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物。随后通过检测细胞内的荧光强度来计算细胞对GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的摄取和内吞。
[0096]如图9所示，KYSE150细胞对于GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的摄取随时间的增多而增大，随剂量的增大而增大，说明KYSE150细胞对于GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的摄取呈时间和剂量依赖。
[0097]实施例12
[0098]本实施例通过对细胞内荧光的检测来计算游离GE11多肽对细胞摄取GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的影响。通过检测细胞对实施例11中制得的装载有香豆素6的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的摄取来检测游离GE11多肽对细胞摄取GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的影响。
[0099]如图10所示，随着游离的GE11多肽量的增加，KYSE150细胞对装载有香豆素6的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的摄逐渐降低，说明游离GE11多肽可以一直被KYSE150细胞对GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物摄取，也说明KYSE150细胞对GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的摄取是受EGFR介导的内吞。
[0100]以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0101]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1.一种GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米硒复合物，其特征在于，该复合物由冬凌草甲素-纳米硒溶液与GE11多肽和羧基活化剂反应制备而成，制备方法包括如下步骤：(1)将硒化合物、冬凌草甲素、还原剂、稳定剂分别配制成溶液后混合，控制混合体系中硒化合物、冬凌草甲素、还原剂、稳定剂的浓度分别为0. l-l〇mM、〇. l-l〇mM、〇. l-50mM、0.01-10wt%，于0-37°C反应5-20h，得到冬凌草甲素-纳米砸溶液；(2)将GE11多肽与羧基活化剂分别配制成溶液后，加入至所述冬凌草甲素-纳米硒溶液中，控制反应体系中GE11多肽和羧基活化剂的浓度分别为0. 1-lOmg/mL和0. Ι-lOmM，于0-37Γ反应5-20h，即得GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米硒复合物溶液。2.根据权利要求1所述的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米硒复合物，其特征在于，步骤（1)所述混合体系中硒化合物、冬凌草甲素、还原剂、稳定剂的浓度分别为〇.5-2mM、0.l-2mM、5-10mM、0. 01-0. lwt% ;步骤⑵所述反应体系中GE11多肽和羧基活化剂的浓度分别为 〇. l_2mg/mL 和 l_5mM。3.根据权利要求1所述的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米硒复合物，其特征在于，所述GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米硒复合物的平均ZETA电位为30-60mV，平均粒径为50_90nm〇4.根据权利要求1所述的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米硒复合物，其特征在于，所述羧基活化剂为1-(3-二甲基氨丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。5.根据权利要求1-4任一项所述的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米硒复合物，其特征在于，所述硒化合物为亚硒酸钠，所述还原剂为抗坏血酸；所述稳定剂为壳聚糖。6.根据权利要求1-4任一项所述的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米硒复合物，其特征在于，将硒化合物配制成溶液的方法为：将硒化合物溶于水中，配制成Ι-lOOmM的亚硒酸钠溶液；将冬凌草甲素配制成溶液的方法为：将冬凌草甲素溶于甲醇中，配制成40-60mM的冬凌草甲素溶液；将还原剂配制成溶液的方法为：将还原剂溶于水中，配制成Ι-lOOmM的还原剂溶液；将稳定剂配制成溶液的方法为：将稳定剂溶于体积分数为0. 1-1%的醋酸水溶液中，配制成浓度为〇. l_20wt%的稳定剂溶液；将GE11多肽配制成溶液的方法为：将GE11多肽溶于水中，配制成1-lOOmg/mLGEll多肽溶液；将羧基活化剂配制成溶液的方法为：将羧基活化剂溶于水中，配制成l〇-l〇〇〇mM的羧基活化剂溶液。7.权利要求1-6任一项所述的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米硒复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：⑴将硒化合物、冬凌草甲素、还原剂、稳定剂分别配制成溶液后混合，按所述硒化合物、冬凌草甲素、还原剂、稳定剂的浓度控制混合体系中硒化合物、冬凌草甲素、还原剂、稳定剂的量，于〇_37°C反应5-20h，得到冬凌草甲素-纳米硒溶液；(2)将GE11多肽与羧基活化剂分别配制成溶液后，加入至所述冬凌草甲素-纳米硒溶液中，按所述GE11多肽和羧基活化剂的浓度控制反应体系中GE11多肽和羧基活化剂的量，于0-37°C反应5-20h，即得GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物溶液。8.根据权利要求7所述的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的制备方法，其特征在于，对步骤(1)得到的所述冬凌草甲素-纳米砸溶液和/或步骤(2)得到的所述GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物溶液进行纯化，纯化的方法为:用水进行透析，去除未反应的原料。9.权利要求1-6任一项所述的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物在制备具有EGFR靶向、抑制癌细胞增殖或抑制血管内皮细胞增殖功能的药物中的应用。10.具有EGFR靶向、抑制癌细胞增殖、抑制血管内皮细胞增殖中一种或多种功能的药物，其特征在于，其活性成分包括权利要求1-6任一项所述的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物。
【专利摘要】本发明涉及一种GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米硒复合物及其制备方法和应用。该复合物的制备方法包括如下步骤：(1)将硒化合物、冬凌草甲素、还原剂、稳定剂分别配制成溶液后混合，于0-37℃反应5-20h，得到冬凌草甲素-纳米硒溶液；(2)将GE11多肽与羧基活化剂分别配制成溶液后，加入至所述冬凌草甲素-纳米硒溶液中，于0-37℃反应5-20h，即得GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米硒复合物溶液。该GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米硒复合物，粒径分布均匀、水溶性好、稳定性佳，经药理研究证明，具有良好的EGFR靶向功能，且能够有效抑制癌细胞和血管内皮细胞的增殖。
【IPC分类】A61K33/04, A61K47/48, A61K47/04, A61P35/00, A61K31/352
【公开号】CN105363041
【申请号】CN201510922619
【发明人】皮江, 蔡继业, 金花, 江金环, 杨芬
【申请人】澳门科技大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月10日