[0095] 在一个实施方案中，本发明的药物组合物或制剂用于在脑中促进淀粉样蛋白清除 的方法。促进淀粉样蛋白清除可预防、治疗或减轻蛋白质错误折叠或神经变性疾病的症状 或严重度。在一个实施方案中，施用途径选自鞘内注射或输注、直接脑室内注射或输注、脑 实质内注射或输注、或静脉注射或输注。
[0096] 在一个实施方案中，本发明的药物组合物或制剂用于在脑中抑制淀粉样蛋白聚集 的方法。在脑中抑制淀粉样蛋白聚集可预防、治疗或减轻蛋白质错误折叠或神经变性疾病 的症状或严重度。在一个实施方案中，施用途径选自鞘内注射或输注、直接心室内注射或输 注、脑实质内注射或输注、或静脉注射或输注。
[0097] 在一个实施方案中，本发明的药物组合物或制剂用于在脑中清除毒性淀粉样蛋白 寡聚物的方法。在脑中清除毒性淀粉样蛋白寡聚物可预防、治疗或减轻蛋白质错误折叠或 神经变性疾病的症状或严重度。在一个实施方案中，施用途径选自鞘内注射或输注、直接心 室内注射或输注、脑实质内注射或输注、或静脉注射或输注。
[0098] 在一个实施方案中，本发明的药物组合物或制剂用于在脑中阻止毒性淀粉样蛋白 寡聚物的形成的方法。在脑中阻止毒性淀粉样蛋白寡聚物的形成可预防、治疗或减轻蛋白 质错误折叠或神经变性疾病的症状或严重度。在一个实施方案中，施用途径选自鞘内注射 或输注、直接心室内注射或输注、脑实质内注射或输注、或静脉注射或输注。
[0099] 在一个实施方案中，本发明的药物组合物或制剂用于保护神经元免受淀粉样蛋白 损伤的方法。保护神经元免受淀粉样蛋白损伤可预防、治疗或减轻蛋白质错误折叠或神经 变性疾病的症状或严重度。在一个实施方案中，施用途径选自鞘内注射或输注、直接心室内 注射或输注、脑实质内注射或输注、或静脉注射或输注。在一个实施方案中，预防性地施予 用于保护神经元免受淀粉样蛋白损伤的本发明的药物组合物或制剂。
[0100] 在一些实施方案中，患者对于与蛋白质错误折叠和/或聚集疾病相关的生物标志 物呈阳性。在一个实施方案中，所述生物标志物为；1^1〇1^)6七3口;[1'(4￥45 31;[1^1150。
[0101] 在一些实施方案中，患者正表现出与淀粉样蛋白的存在相关的神经变性疾病的症 状。在各种实施方案中，所述淀粉样蛋白是fAM2、fasyn、fNM或ftau的任一个。
[0102] 在某些实施方案中，所述神经变性疾病是帕金森氏病、阿尔茨海默病或亨廷顿舞 蹈症。在一个实施方案中，所述神经变性疾病是阿尔茨海默病。在一个实施方案中，所述神 经变性疾病是阿尔茨海默病并且患者表现如通过成像剂fl 〇rbetapir(AV-45，Eli Lilly) 检测到的β-淀粉样蛋白。
[0103] 在一些实施方案中，患者正表现出朊病毒介导的疾病的症状。
[0104] 在某些实施方案中，所述朊病毒介导的疾病选自克雅氏病、库鲁病、致命性家族性 失眠症或格斯特曼-施特劳斯纳综合征。
[0105] 在一些实施方案中，患者正表现出除阿尔茨海默病外的神经退行性τ蛋白病变的 症状。在某些实施方案中，待治疗的疾病选自嗜银颗粒痴呆、皮质基底节变性、拳击员痴呆、 弥散性神经原纤维缠结钙化、唐氏综合征、额颞痴呆，包括与染色体17相关的额颞叶痴呆与 帕金森症、哈勒沃登-施帕茨病、强直性肌营养不良、尼曼-皮克病C型、非关岛运动神经元疾 病与神经原纤维缠结、皮克病、脑炎后帕金森综合征、进行性皮质下胶质增生、进行性核上 性麻痹、亚急性硬化性全脑炎和仅缠结型痴呆。
[0106] 在另一个实施方案中，任何上述疾病病况可通过单独地或与合适的载体(诸如，例 如，脂质纳米颗粒、聚合物载体，或载体诸如病毒载体)结合地向患者直接施用(通过任何合 适的途径，诸如，例如，吸入和静脉内输注)本发明的核酸分子（即，编码显示减小的免疫原 性并且具有结合淀粉样蛋白、解聚淀粉样蛋白斑块和/或阻止淀粉样蛋白的聚集的变体g 3p 的核酸分子）来治疗。适合用于该治疗的编码本发明的变体g3p的核酸分子可以是DNA或 RNA0
[0107] 诊断学
[0108] 在本发明的另一个方面，本文所述的多肽和组合物用于与本文所述的各种疾病相 关的诊断应用。例如，当在体内或体外用作成像剂时，本发明的组合物的结合可以是所述蛋 白质错误折叠疾病之一的诊断的部分。当用作诊断剂时，本发明的多肽还可包含可检测的 标记，或可另外地在体内被检测到。可使用用于标记蛋白质的标准技术将各种标记物附接 于诊断组合物的淀粉样蛋白结合组分。标记物的实例包括荧光标记物和放射性标记物。存 在多种可使用的放射性标记物，但一般地所述标记物通常选自放射性标记物，包括，但不限 于， 18F、nC和1231。可使用公知的化学将这些和其它放射性同位素附接于蛋白质。在一个实 施方案中，使用正电子发射计算机断层摄影术(PET)来检测标记物。然而，用于放射性同位 素的检测的任何其它合适的技术也可用于检测放射性示踪剂。
[0109] 可将本发明的多肽和组合物与对于β-淀粉样蛋白是特异的成像剂诸如，例如F18-AV-45，Eli Lilly组合地用作诊断成像剂。由于目前不存在用于非-β-淀粉样蛋白聚集物的 已知成像剂，因此本发明的诊断组合物与淀粉样蛋白-特异性成像剂一起的使用将导致 基于差示检测的非-β_淀粉样蛋白聚集物的检测。因此，在一个实施方案中，将本发明的诊 断组合物与淀粉样蛋白成像剂组合地用作成像剂以检测非-β_淀粉样蛋白聚集物。
[0110] 在另一个实施方案中，将本发明的多肽或组合物用作诊断成像剂来检测CNS(包括 脑）中的淀粉样蛋白。
[0111] 可使用针对治疗性组合物所描述的相同途径来施用本发明的诊断组合物。在一个 实施方案中，施用途径选自鞘内注射或输注、直接心室内注射或输注、脑实质内注射或输 注、或静脉注射或输注。 实施例
[0112] 实施例1: g3p中的⑶4+Τ细胞表位的作图
[0113] 合成87个跨越SEQ ID NO: 1的氨基酸1-240的序列的重叠肽（15个氨基酸长，12个 氨基酸重叠的），并在T细胞表位作图测定中测试来自人CD4+T细胞的响应。在一式六份PBMC 培养物中测试单个肽，并评估T细胞响应以鉴定表位的定位以及它们的相对效力。
[0114]利用Lymphoprep (Axis-shield ,Dundee，UK)密度离心，按照由 Addenbrooke医院当 地研究伦理委员会授权的批准从英国国家输血服务(Addenbrooke医院，Cambridge,UK)获 得的健康社区供血者血沉棕黄层(来自24小时内抽取的血液)分离PBMC(外周血单核细胞）。 使用CD8+RosetteSep?(StemCe 11 Technologies Inc,London,UK)耗竭CD8+T细胞。通过使 用基于HLA SSP-PCR的组织分型试剂盒(Biotest,Solihull,UK)鉴定HLA-DR单元型来表征 供体。还测定T细胞对对照新抗原蛋白（KLH蛋白（Pierce(Perbio) ,Cramlington,UK)和从 IFV和EBV衍生的肽)的响应。随后冷冻PBMC，并将其贮存于液氮中直至需要。
[0115] 一个组群的55个供体被选择用于测定，以最佳地代表在世界人口中表达的HLA-DR 同种异型的数目和频率。在该组群中表达的同种异型针对世界人口中表达的那些同种异型 的分析显示，获得了>80%的覆盖，并且所有主要的HLA-DR等位基因（在世界人口中以>5% 的频率表达的单个同种异型)得到良好代表。个体供体单元型以及世界人口与样品群体中 表达的MHC II类单元型的频率的比较的详细内容分别示于表8和图3中。
[0116]表8.供体详细内容和单元型
[0117]
[0119] 将来自每一个供体的PBMC解冻，对其进行计数，并评估活力。将细胞在室温 AIM-V?:培养基（Invitrogen，Paisley，UK)中复苏，随后将细胞密度调整至2-3x106PBMC/ ml (增殖细胞原液）。利用游离N末端胺和C末端羧酸以l-3mg的规模合成15个氨基酸长的肽。 将肽溶解在DMSO中至IOmM的浓度，并且在小孔中将制备的肽培养物原液于ΑΓΜ-V?培养 基中稀释至5μΜ的终浓度。对于每一种肽和每一个供体，在平底96孔板中建立一式六份培养 物。也以一式六份测试阳性和阴性对照培养物。对于每一个供体，还包括3个对照(KLH蛋白 和从IFV和EBV衍生的肽）。对于阳性对照，以2.5μg/ml的终浓度使用PHA(Sigma，Dorset， UK) 〇
[0120] 将培养物孵育总共6天，随后向每一个孔添加0.75yCi 3[H]-胸苷（Perkin Elmer?, Beaconsf ield, UK)。将培养于再孵育18小时，随后使用TomTec Mach III细胞收 集器将其收集至滤垫上。通过在Microplate Beta计数器(PerkinBlnie:r?，Beaconsfield， UK)上以paralux低本底计数模式通过MeltilexTM(PerkinE丨meΓ段Beaconsfield，UK)闪烁 计数来测定每一个孔的Cpm。
[0121] 对于数据的分析，使用等于或大于SI 2 2.00的刺激指数(SI)的阈值(考虑边界SI 2 1.90-1.99响应）。阳性响应通过以下统计和经验阈值来定义：
[0122] 1.通过使用不成对双样本学生t检验比较测试孔对比培养基对照孔的cpm产生的 响应的显著性(P〈〇.〇5)。
[0123] 2.大于2.00的刺激指数(SI 2 2.00)，其中SI =测试孔的平均cpm/培养基对照孔的 平均cpm。以该方式提供的数据被表示为SI 2 2.00，p〈0.05。
[0124] 另外，通过计算来自重复培养物的原始数据的CV和SD来评估批内变化。以一式六 份培养物（"非调整的数据"）设置增殖测定。为了确保批内变化低，也在除去最大和最小cpm 值之后分析数据（"调整的数据"），并使用两个数据集比较供体响应的SI。通过对研究中的 所有肽计算阳性响应(上文中定义的）的平均频率(加上SD以提供本底响应率)来鉴定T细胞 表位。诱导在调整和非调整的数据中高于本底响应率的增殖响应的任何肽都被认为含有T 细胞表位。当两个重叠肽诱导增殖响应率时，T细胞表位被认为存在于重叠区域。据此，在所 测试的多肽中鉴定了以下T细胞表位：
[0125] 表位1:C T G D E T Q C Y G T W(SEQ ID NO: 1 的氨基酸46-57)
[0126] 表位 2:T FMFQNNRFRN R(SEQ ID N0:1 的氨基酸 133-144)
[0127] 表位 3:S SKAMYDAYWN G(SEQ ID N0:1 的氨基酸 194-205)
[0128] 表位 4:P VNAGGGSGGG S(SEQ ID N0:1 的氨基酸 214-225)
[0129] 表位 5:S GSGAMVRSDKTHT C(SEQ ID N0:1 的氨基酸 253-267)
[0130] 实施例2:通过计算机模拟分析进行的T细胞表位4和5的突变的设计
[0131]使用iTope?和TCED?计算机模拟技术，利用来自所述表位区的重叠9聚体分析在T 细胞测定中呈阳性的肽的序列。[Perry等，Drugs R D 9(6):385-96(2008)]。针对MHC II类 等位基因（总共34个)的数据库测试每一个9聚体，并基于与MHC II类分子的拟合和相互作 用对其进行评分。另外，将每一个9聚体针对已知的CD4+T细胞表位的数据库进行BLAST搜 索，以鉴定9聚体的序列与来自在先前的T细胞测定中刺激T细胞响应的无关蛋白质的数据 库肽的序列之间的任何高序列同源性。基于来自计算机模拟分析的信息，鉴定了用于从所 述鉴定的表位潜在除去CD4+T细胞表位活性的突变。
[0132] 表位5跨越富含Gly的天然N2-CT接头的C末端、由用于产生SEQ ID NO: 1的N1-N2人 Ig Fc融合蛋白的pFUSE载体的多克隆位点（"MCS"）编码的氨基酸和人Ig Fc区的N末端。计 算机模拟分析将SEQ ID NO: 1的M258和V259视为负责T细胞活性的Pl锚。基于它们在N1-N2 编码区外部的定位，预期除去这两个氨基酸不引起功能的丧失。这两个氨基酸由MCS编码。 因此，使用适当的寡核苷酸引物，通过定点诱变来产生修饰MCS并且消除编码SEQ ID NO: 1 的M258和V259的核苷酸的双链DNA分子。随后，使用MCS中的EcoRI和BglII限制性位点将所 得的诱变的DNA序列重新克隆回pFUSE载体中。所得的成熟(不存在信号序列)融合蛋白省略 了M258和V259。其氨基酸序列示于SEQ ID NO: 2中并由SEQ ID NO: 5编码。该融合蛋白保持 与SEQ ID NO: 1融合蛋白相同的在下述测定中结合Abeta的能力。
[0133] 表位4与N2和天然富含Gly的接头重叠。g3p蛋白的晶体结构（未显示)表明，表位4 位于远离淀粉样蛋白结合区，从而可耐受氨基酸取代而不影响活性。被鉴定为Pl锚的V215 (SEQ ID NO: 2)表面暴露，侧链略微取向朝向蛋白质核心。根据结构分析，表6和7中所示的 V215的任何取代应当除去表位。另外，还应当容纳如表6和7中所示的该表位内的其它氨基 酸的任何取代。使用适当的寡核苷酸引物，通过定点诱变从SEQ ID NO: 5衍生编码包含 V215A取代的Nl-N2-Ig Fc的核酸序列（SEQ ID N0:6)。所得的成熟融合蛋白（SEQ ID N0:3) 在结合测定中显示相较于具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的融合蛋白的增 强的对Abeta的结合。将SEQ ID N0:6的核酸序列用作亲代序列来生成包含表位1、2和3中的 所有修饰的基因。
[0134] 实施例3:通过计算机模拟分析进行的T细胞表位1、2和3的突变的设计
[0135]表位1正好位于N1-N2的假定的Abeta结合部分的C末端。表位1的计算机模拟分析 将SEQ ID NO: 1的氨基酸48-56突出显示为用于氨基酸取代和T细胞表位的去除的区域。基 于现存氨基酸的性质、表面暴露和与g3p的淀粉样蛋白结合区的相互作用(如根据g3p的X射 线晶体结构解释的）将该9聚体内的氨基酸靶向用于取代。具体地，将G48、T51、Y54和T56靶 向利用表1中指定的变化进行的取代。该区域中的其它潜在氨基酸取代示于表2中。
[0136] 表位2的iTope?分析将SEQ ID NO: 1的氨基酸135-143指为用于减小或消除该表位 的靶。基于X射线晶体结构，SEQ ID NO: 1的氨基酸136-139形成环区，该环区与NI-N2的铰链 区形成键，从而对于淀粉样蛋白结合活性可以是重要的。对这些氨基酸的改变是不太优选 的，并且仅示于表2中。更优选的改变是针对M135、R140、F141和N143,并且示于表1中。对该9 个氨基酸的区域的其它潜在改变示于表2中。
[0137] SEQ ID NO: 1的氨基酸173-182通过计算机模拟分析被鉴定为在表位3内，作为用 于取代的靶。表位3位于N2结构域的α螺旋部分中，从而策略是避免引入疏水残基和小的不 带电荷的极性残基。另外，我们希望避免向该表位的C末端引入极性残基、酸性残基。基于X 射线晶体学数据，我们将3173、0174、1176、0178和1182靶向利用表1中指定的变化的取代。 该区域内的其它潜在氨基酸取代示于表2中。
[0138] 实施例4:具有减小的T细胞表位的Ν1-Ν2-人IgG Fc多肽的产生
[0139] 制备各自编码含有表3中所示的不同的单氨基酸取代的Ν1-Ν2-人IgG Fc融合蛋白 的58个不同的核酸分子。这通过使用适当的寡核苷酸引入对SEQ ID Ν0:6进行定点诱变以 引入所需取代，随后将PCR扩增的诱变序列重新克隆入PFUSE-hIgGl-Fc2载体（ invi'OgeiT?, Toulouse，France