，Catalogue No · pfuse_hglfc2)来实现。
[0140] 使编码这些"去免疫化的" Fe融合多肽的基因在单个PFUSE-hIgGl-Fc2载体中于 FreeStyle 293-F细胞（Invitrogen,Paisley，Scotland，Catalogue#R790_07)中进行瞬时 表达。在转染当天，将细胞在FreeStyIe 293培养基（Invitrogen，Catalogue#l2338)中稀释 至1\106/1111^，从而确保>90%的活力。单独地在(^1:;[1116111(111￥；[1：1'08611，03七3108116#31985)中 稀释质粒DNA和聚乙烯亚胺(PEI)，并孵育5分钟，随后将PEI缓慢地添加至DNA，并将DNA/PEI 混合物在室温下孵育5分钟。孵育后，将DNA/PEI混合物逐滴添加至293-F细胞，同时旋转培 养瓶。将转染的培养物在以135rpm旋转的定轨摇床平台上于37°C、8 %⑶2中孵育6-7天，随 后收集它们。
[0141]通过离心收集含有多肽的培养基，并使用IOxPBS调整pH。通过在4°C旋转过夜将蛋 白质结合于蛋白A琼脂糖珠粒(Sigma,Dorset，UK)。用IxPBS洗涤珠粒2次，随后将其转移至 SigmaPrep旋转柱(Sigma)。使用0.1 M甘氨酸pH3.0通过离心洗脱样品，并在收集管中使用1/ 10体积的IM Tris-HCl ρΗ8·0中和所述样品。使用2ml ZebaSpin柱（Pierce,Cramlington, UK，Catalogue#89890)将洗脱物缓冲液交换至IrfBS中。将样品过滤灭菌，并测量每一个样 品的280nm处的吸光度。
[0142] 实施例5:去免疫化的多肽的ABeta结合分析
[0143] A. ABeta(AP)纤维的制备。将AM2( Img，rPeptideA-1002-2)溶解在六氟异丙醇 (HFIP，ImL)中，充分涡旋并于室温下孵育2-18小时直至澄清溶液出现。将等分试样（100μΙ， IOOyg)置于 1.5mL Eppendorf管中，并于真空（speed Vac,Eppendorf ,Concentrator 5301) 下干燥2-3小时。将所得的单体重悬浮于20yL DMSO中，用移液器吸取，并充分涡旋直至完全 溶解。利用260yL的IOmM HCl溶液稀释该溶液(终AM2浓度为80μΜ)，并涡旋20秒。将澄清溶 液在37°C孵育(不振荡)3天以允许聚集。为了在测定中的使用，将来自所得的原液的ΑΜ2纤 维于PBS中稀释50倍至1.6μΜ的终浓度。
[0144] B·ELISA板的制备。向96孔板(F96MAXIS0RPNUNC-IMMUN0PLATE;目录号：442404， Lot 125436和128158;〇61111^迚）的每一个孔添加20(^1^的1%834溶液。将板密封并在7°(3孵 育3小时。随后用PBS(250yL/孔)洗涤板3次。我们向每一个孔添加50yL稀释的AM2纤维溶液 (1.6μΜ)，并在37°C无遮盖孵育过夜，以完成干燥。将I 3BS(50μ1/孔)添加对照孔(无 AM2纤 维）。随后用水洗涤板2次，并用PBS(对于每一次洗涤，使用250μ!7孔)洗涤1次。
[0145] C.ELISA测定。将50yL的不同浓度的每一种多肽（以及SEQ IDN0: 3的多肽）添加至 每一个孔，以及非-AM2纤维涂覆的孔，并在37°C孵育1小时。随后用roS-T(0.05%的I3BS中 的Tween 20)洗涤板3次，并用PBS(对于每一次洗涤，使用250μ!7孔)洗涤3次。我们随后向每 一个孔添加50μ1的以1: 2500(最终0.32yg/mL)稀释于PBS-T+1 %牛奶(Difco?脱脂牛奶， Becton，Dickinson and Company.USA，目录号：232100,批号：7320448)中的缀合有HRP的山 羊抗-人抗Fcy (Jackson Labs，目录号109-035-008,批号：106617)并在37°C孵育40分钟。 随后用PBS-T洗涤板6次，并用PBS(对于每一次洗涤，使用250μ!7孔)洗涤2次。我们随后添加 50μ1/孔OPD溶液（15mg/7 · 5ml0 · 05Μ柠檬酸盐缓冲液pH-5 · 5/3μ1 H2O2)，并使其显色3-6分 钟。我们随后添加25μ1/孔的4Ν HCl溶液以终止反应。读取板在492nm和405nm处的吸光度。 从492nm吸光度扣除405nm吸光度，并将结果作为多肽的浓度的函数绘图。随后计算针于每 一种去免疫化的多肽的结合的IC 5Q，并将其与针于SEQ ID N0:3的多肽计算的IC5q相比较。 结果示于以下的表9中。
[0146] 表9.在表位1、2或3中具有单氨基酸取代的多肽相较于SEQ ID N0:3的多肽的 ABeta结合IC5Q的相对变化
[0148] *编号反映 IC5Q(取代的多肽)/IC5Q(SEQ ID勵:3的多肽）。多个值反映结合测定中 的一式二份测定。
[0149] 实施例6:全蛋白的⑶4+T细胞响应的分析
[0150]为了分析来自本发明的任何多肽相较于SEQ ID NO: 1的⑶4+T细胞响应，进行全蛋 白T细胞测定。从如实施例1中制备的20个健康人供体的血沉棕黄层分离PBMC。将PBMC在 AIM.-V?培养基中从冷冻复苏，并使用Miltenyi CD14微珠和LS柱(Miltenyi Biotech, 0叉【(^(1，1]1〇分离0)14+细胞。将单核细胞重悬浮于补充有10001]/111111^-4和10001]/111161-CSF的/\IM-V? ( "DC培养基"）中至4-6xl06PBMC/ml，随后将其分配在24孔板(2ml的终培养 体积）中。在第2天通过更换一半体积的DC培养基来饲喂细胞。到第3天，单核细胞已分化至 半成熟树突细胞(DC)，用抗原(包括40ug/ml的测试多肽或40ug/ml的SEQ ID NO: 1的多肽和 100μg/ml KLH)或仅用培养基预孵育所述半成熟树突细胞。用抗原孵育半成熟DC 24小时， 随后通过洗涤细胞细胞2次和将其重悬浮于补充有50ng/ml TNF-a(P印rotech，London，UK) 的DC培养基中来除去过量抗原。在第7天，通过更换一半体积的补充有50ng/ml TNFa的DC培 养基来饲喂DC，并且在第8天收集成熟DC。计数收集的成熟DC，并使用台盼蓝染料排除法来 评估活力。随后对DC进行γ -辐照(4000拉德），并将其以2xl05个细胞/ml重悬浮于AIM-V培 养基中，随后在如下的T细胞增殖和ELISpot测定中用于分析。另外，在第8天，还制备新鲜的 CD4+T细胞。为了纯化⑶4+T细胞，将PBMC在AIM-V?培养基中复苏，随后使用Mi I teny i CD4微珠和LS柱(Miltenyi Biotech ,Oxford, UK)分离CD4+细胞并将其以2xl06个细胞/ml重 悬浮于AIM-V?培养基中。
[0151] 在第8天，建立T细胞增殖测定，由此将IxlO5个自体⑶4+T细胞添加至96孔U型底板 中的载有IxlO 4个抗原的DC(10:1的比率），将AIM-V?.培养基添加至终体积200ul/孔。在 第 14天，在25ulAIM-V? 中用IuCi [3H] (Perkin Elmer ,Beaconsf ield,UK)/孔脉冲测定板 6小时，随后使用TomTec Mach III (Hamden CT、USA)细胞收集器将其收集至滤垫(Perkin Elmer)上。以一式六份培养物测试所有多肽。通过在1450Microbeta Wallac Trilux液体闪 烁计数器(Perkin Elmer)上在paralux低本底计数中通过Meltilex?(Perkin Elmer)闪烁 计数测定每一个孔的每分钟计数(cpm)。将每一个抗原的每分钟计数针对仅有AIM-V?培 养基的对照进行标准化。
[0152] 对于ELISpot测定，用IOOul/孔的PBS中的IL-2捕获抗体(R&D Systems ,Abingdon, UK)涂覆ELISpot板(1^11丨？〇代，1&七€(^(1，1]1〇。随后在1^5中洗涤板2次，在封闭缓冲液（1% PBS中的BSA(Sigma))中孵育过夜，随后在MM-V?培养基中洗涤。第8天，将IxlO5个自体 ⑶4+T细胞添加至96孔ELISpot板中的载有IxlO 4个抗原的DC( 10:1的比率）。以一式六份培养 物测试所有多肽制剂。对于每一个供体PBMC，还包括阴性对照(单独的AIM-V?培养基）、 无细胞对照和PHA( 10ug/ml)阳性对照。
[0153] 在进一步的7天孵育期后，通过在dH20和PBS中进行3次连续洗涤，随后添加 IOOul 的PBS/1 % BSA中的过滤的生物素化的检测抗体(R&D Systerns，Abingdon，UK)来对ELI Spot 板进行显色。在于37°C孵育1.5小时后，将板在I3BS中再洗涤3次，随后添加 IOOul PBS/1 % BSA中的过滤的链霉抗生物素蛋白-AP(R&D Systems )，进行1小时(在室温下孵育）。弃去链 霉抗生物素蛋白-AP，并将板在I3BS中洗涤4次。向每一个孔中添加 BCIP/NBT(R&D Systerns)， 并在室温下孵育30分钟。通过用dH20洗涤孔和孔的背面3次终止斑点显影。将干燥的板在 Immunoscan?分析仪上进行扫描，并使用Immunoscan?第4版软件测定每孔斑点数(spw)。
[0154] 对于增殖和IL_2ELISpot测定，结果表达为刺激指数(SI)，所述刺激指数被定义为 测试多肽相对仅有培养基的对照的cpm(增殖测定)或斑点（ELISpot测定）比率，对于阳性T 细胞响应，使用等于或大于2的SI的阈值(SI 2 2.0)。
[0155] 实施例7: T细胞表位1、2和3的两个或更多个中的双和三突变的设计。
[0156] 基于结合测定的结果，在表位1、2和3处选择以下取代以存在于相较于SEQ ID NO: 3含有2个氨基酸取代的多肽中，每一个取代存在于不同的表位中。
[0157]表10.包含两个表位和三个表位修饰的变体的氨基酸取代。
[0159]通过使用适当的起始DNA的定点诱变(通常为编码如实施例3中所示制备的两个突 变之一的DNA)来制备编码具有2个表10中所示的氨基酸取代(各自在不同的表位中）的Nl-N2人IG Fc融合蛋白的DNA。将所得的编码这些融合蛋白的DNA用于转化细胞且表达，并且如 实施例4中所示纯化所述融合蛋白，以及如实施例5中所示测试其结合。随后基于对两个氨 基酸取代的多肽的结合测定的结果设计在表位1、2和3的每一个中具有一个取代的多肽。测 试在表位1、2和3的每一个中具有一个取代的多肽的ABeta结合以及实施例6中所示的T细胞 响应。具体地，可通过取代如下表11中指定的SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:7中的某些氨基酸 来产生以下双表位变体和三表位变体。
[0160] 表11.本发明的双表位变体和三表位变体多肽。
[0164] 使用实施例5中所示的ELISA测定法测定上文中指定的多肽的对β-淀粉样蛋白的 结合。结果示于表12和13中。相对结合值反映 IC5Q(SEQ ID勵:3的多肽)/1(：5()(所测试的多 肽）（例如，值越低，则所述多肽相较于SEQ ID NO: 3的多肽的结合越大）。多个值反映该结合 测定中的一式两份测试。
[0165] 表12.SEQ ID N0:3的多肽相对本发明的示例性多肽的相对结合值。
[0168]表13.SEQ ID N0:7的多肽相对本发明的示例性多肽的相对结合值。
[0170] 实施例8:酸酸纤维素过滤阻滞测定
[0171] 本测定用于监测淀粉样蛋白纤维的去稳定化(解聚)或至非-淀粉样蛋白形成性或 可溶性聚集物的重塑。所述测定主要从Chang,E.和Kuret, J. ,Anal Biochem 373,330-6， (2008)和Wanker,E.E.等，Methods Enzymol 309,375-86,（1999)改造而来。具体地，在37°C 用不同浓度（InM至2μΜ)的本发明的变体融合多肽预孵育2.5μΜ的fAi3淀粉样蛋白纤维的制 剂3天。孵育后，稀释具有和不具有融合多肽的纤维，并将其点在真空印迹上的酸酸纤维素 膜上。用PBS充分洗涤膜，并用对于仙的N末端是特异的抗体探测1小时。将缀合有HRP的第二 Ab用于定量保留在膜上的纤维状聚集物。使用光密度扫描仪分析和数字化斑点颜色。基于 每一个斑点的信号强度相对添加至每一个斑点的融合多肽的浓度计算EC 5Q(半最大有效浓 度)。
[0172] 当在本测定中测试SEQ ID N0:3的多肽时，EC5q经测定大于2μΜ，表明该多肽具有低 解聚活性。也在本测定中测试SEQ ID NO: 1和SEQ ID Ν0:7的多肽，并且每一种多肽显示 IOOnM的EC5Q，这表明显著的解聚活性。基于该结果，使用SEQ ID NO:7的多肽作为待修饰的 起始氨基酸序列来产生在多肽102后的所有随后编号的多肽，包括所有在表位1、2和3的每 一个中含有去免疫化取代的变体多肽。所测试的多肽的EC 5q值示于下面的表14中。
[0173] 表14.本发明的示例性变体多肽的fAi3淀粉样蛋白纤维解聚活性。
[0175] *nd =多肽的浓度范围未被测试来测定EC5Q。在所测试的最高浓度上，这些多肽未 表现显著的EC50。
[0176] 如可从上述实施例看到的，本发明的变体多肽全都显示如通过ELISA测定法测定 的对A邱勺结合。大多数所测试的变体多肽也显示如通过斑点印迹测定法测定的A邱勺解聚。
【主权项】
1.一种多肽，其包含起始氨基酸序列的变体，其中所述起始氨基酸序列选自：SEQ ID N0:1的氨基酸1-217、SEQ ID N0:3的氨基酸1-217、SEQ ID N0:7的氨基酸1-217,和具有以 下修饰的一个或多个的任何上述氨基酸序列的突变体:氨基酸43-45处AAA对VVV的取代;取 代C53W;氨基酸96-103的缺失；氨基酸212-214处AGA对QPP的取代；取代W181A、F190A和 F194A;氨基酸1的缺失;和氨基酸1和2的缺失，其中： (a) 所述多肽结合和/或解聚淀粉样蛋白； (b) 所述多肽相较于包含所述起始氨基酸序列的对应多肽具有减小的免疫原性； (c) 所述变体相较于所述起始氨基酸序列具有1至9个氨基酸取代，其中每一个氨基酸 取代选自下文中所示的氨基酸取代的组： 氨基酸编号1存在于起始氨基酸序列中| 氨基酸取代 __的氨基酸__ 48__G__Η、K、R、S、T、D、P_ 50 __E__G, Hv P, R_ 51 __T__G、H. R、P、Q、N、W 53 __C__F、H、1(、N、Q、R、W、Y 54 __y__G、P_ 56__T__G、Η、K、R、P_ 135. A、D、G. K、Ns T、Hs R、 ___C、E、P、Q、S_ -137 - Q E - -138 N ~~ D, E, G, Η. P. Q, S, T 140. D、E、H、Q、A, G、Μ、N、 _；__P、s、Y_ 141. D、E -143 - N ~A V Q ' ?7? S G, P、1(、D、H, R、T -174 K R -175 I A |G、H> K、Pv R -176 ~ M ~ H：v K, N, R. P, Q. W 178. G、N、Q、S、T、F、Η、K、R、 ___W、Y_ 179 A Η、K、P、R 181. i G、?、K、R、P 和 (d) 当所述起始氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217时，1至9个氨基酸取代的任 一个任选地另外选自下文中所示的氨基酸取代的组： 氨基酸编号I存在于所述起始氨基酸序 氨基酸取代 列中的氨基酸