包含具有减小的免疫原性的经修饰的噬菌体g3p氨基酸序列的多肽的制作方法
【专利说明】包含具有减小的免疫原性的经修饰的噬菌体G3P氨基酸序列 的多肽
[0001] 本发明涉及多肽，所述多肽包含足以结合和/或解聚淀粉样蛋白的丝状噬菌体基 因3蛋白（g3p)的一部分，例如，g3p的N1-N2部分及其突变体和片段，其中g3p氨基酸序列已 通过氨基酸取代被修饰来当在体内使用时具有比对应的野生型g3p氨基酸序列显著更小的 免疫原性。本发明的多肽保留它们结合和/或解聚淀粉样蛋白的能力。本发明还涉及这些经 修饰的g3p多肽用于治疗和/或预防与淀粉样蛋白的错误折叠或聚集相关的疾病的用途。
[0002] 已证明丝状噬菌体g3p蛋白以及特别地包含g3p的N1-N2区的其多肽部分结合并解 聚各种淀粉样蛋白，诸如淀粉样蛋白、τ蛋白和朊病毒蛋白。参见共同未决的PCT申请PCT/ US2012/066793以及美国临时申请US 61 /801，349和US 61 /801，849，所述每一个申请的公 开内容通过引用并入本文。也参见，R.Krishnan等，J.Mol.Biol. (2014)。尽管存在该功效， 但预期包含g3p或其Ν1-Ν2区的多肽的全身性施用可引起有害的免疫答应。然而，这些教导 都未鉴定导致g3p的免疫原性性质的特定T细胞表位或建议此处提供的减少或消除这些免 疫原性性质的特定修饰。
[0003] 许多重组或另外地非天然治疗性蛋白质或多肽的功效可受患者与所述治疗性蛋 白质或多肽的不希望的免疫反应限制。蛋白质对免疫响应的诱导的主要因素是蛋白质内的 T细胞表位，即可通过在组织相容性复合物(MHC)II类分子上的呈递刺激T细胞的活性的氨 基酸序列的存在。T细胞表位通常被定义为具有结合MHC II类分子的能力的任何氨基酸残 基序列。当结合于MHC分子时，T细胞表位可被T细胞受体(TCR)识别，并可通过衔接T细胞受 体以促进T细胞响应来引起T细胞的活化。然而，通常应理解，结合MHC II类分子的某些T细 胞表位不刺激T细胞响应，因为这些肽在向其施用所述蛋白质的生物体内被识别为"自身 的"。
[0004] -些T细胞表位可在治疗性蛋白质或多肽在细胞内降解过程中被作为肽释放，随 后被MHC的分子呈递以触发T细胞的活化。对于由MHC II类分子呈递的肽，T细胞的此类活化 则可通过直接刺激B细胞产生此类抗体来产生例如所述抗体响应。
[0005] MHC II类分子是一组在辅助T细胞选择和活化中起着中心作用的高度多态的蛋白 质。人白细胞抗原组DR(HLA-DR)是该组蛋白质的占优势的同种型。然而，同种型HLA-DQ和 HLA-DP进行相似的功能。在人中，已知DR同种型的约70种不同的同种异型，对于DQ，存在30 种不同的同种异型以及对于DP，已知47种不同的同种异型。每一个个体具有2至4个DR等位 基因，2个DQ和2个DP等位基因。
[0006] 个体中针对蛋白质或多肽的免疫响应严重受到T细胞表位识别影响，所述T细胞表 位识别是该个体的HLA-DR同种异型的肽结合特异性的函数。为了在全球人口的背景中鉴定 蛋白质或多肽内的T细胞表位，期望考虑尽可能多样的一组HLA-DR同种异型的结合性质，从 而覆盖尽可能高的百分比的世界人口。
[0007] T细胞表位鉴定是表位消除的第一步骤。使得能够检测T细胞表位的方法在本领域 中是已知的并且公开于WO 98/52976、W0 00/34317、US2007/0269435;US 7,208，147、Kern 等，Nature Medicine4:975_978(1998);和Kwok等，Trends in Immunology 22:583-588 (2001)中。在这些方法中，通过在治疗性蛋白质或多肽的一级序列内使用明智的氨基酸取 代来除去预测的或鉴定的T细胞表位。虽然这些参考资料使得能够进行T细胞表位的假定鉴 定，但避免对生物活性的负面影响的氨基酸取代的选择不能被合理地预测。这仅可通过测 试经修饰的多肽的每一个的此类活性来测定。
[0008] 因此，可能期望检查和减小g3p的N1-N2部分的免疫原性而不破坏其淀粉样蛋白-结合/解聚性质，以便可为了治疗和/或诊断目的长期全身性施用包含N1-N2部分的多肽。本 发明通过鉴定N1-N2序列内的潜在T细胞表位来满足该需要。本发明还鉴定了在这些潜在T 细胞表位内的特定氨基酸取代以产生变体N1-N2序列，所述变体N1-N2序列将减少或消除T 细胞表位的免疫原性而不破坏变体N1-N2结合淀粉样蛋白、阻止淀粉样蛋白聚集和/或实现 淀粉样蛋白斑的解聚的能力。
[0009] 在一个实施方案中，本发明还提供了多肽，所述多肽包含N1-N2氨基酸序列的变体 或其突变体或片段，由于一个或多个鉴定的T细胞表位内的一个或多个氨基酸取代而具有 减小的免疫原性。在一个方面，本发明提供了包含与人免疫球蛋白Fc区融合的变体NI -N2序 列的融合蛋白。
[0010] 在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的多肽的药物组合物，以及通过 向患有与错误折叠和/或聚集的淀粉样蛋白蛋白质相关的疾病或对所述疾病易感的受试者 施用此类药物组合物来治疗或预防此类疾病的方法。
[0011]在其它实施方案中，本发明提供了编码本发明的多肽的核酸分子，以及包含那些 核酸分子的载体和具有此类载体的细胞。
[0012] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于产生本发明的多肽的方法。具体地，此类 方法使用所述核酸分子和/或具有包含此类核酸分子的载体的细胞。
[0013] 附图简述
[0014]图1显示具有5个通过粗体和下划线标识的T细胞表位的Nl-N2-hIgGl-Fc融合蛋白 的氨基酸序列（SEQ ID N0:1)。氨基酸1-217构成野生型g3p序列的N1-N2部分。氨基酸218-256代表由存在于M13噬菌体中的野生型g3p的富含甘氨酸的N2-C末端接头组成的接头区。 该区域通过阴影来标识。氨基酸257-261代表由用于构建编码融合蛋白的核酸分子的多克 隆位点编码的氨基酸。蛋白质的IgG-Fc部分始于氨基酸262。
[0015] 图2代表具有4个通过下划线标识的T细胞表位的g3p-hIgGl-FC融合蛋白（SEQ ID NO:2)的替代实施方案的氨基酸序列。已通过删除对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸258至259的 氨基酸来消除第五T细胞表位。
[0016] 图3显示具有3个通过粗体和下划线标识的T细胞表位的g3p-hIgGl-Fc融合蛋白 (SEQ ID勵:3)的另一个替代实施方案的氨基酸序列。已通过￥2154和622(^的取代(相较于 SEQ ID NO: 1)消除了第四T细胞表位，以及已通过删除对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸258和 259的氨基酸消除了第五T细胞表位。
[0017] 图4A显示编码具有N末端哺乳动物信号序列的SEQ ID N0:1的g3p-hIgGl-FC融合 蛋白的DNA序列（SEQ ID NO:4)。图4B显示编码具有N末端哺乳动物信号序列的SEQ ID NO:2 的g3p-hIgGl-Fc融合蛋白的DNA序列（SEQ ID N0:5)。
[0018] 图5显示编码具有N末端哺乳动物信号序列的SEQ ID N0:3的g3p-hIgGl-Fc融合蛋 白的DNA序列（SEQ ID NO:6)。
[0019] 图6提供在实施例1中描述的研究中表达的供体同种异型的频率的比较。
[0020] 图7显示具有3个通过粗体和下划线标识的T细胞表位的g3p-hIgGl-Fc融合蛋白 (SEQ ID N0:7)的另一个替代实施方案的氨基酸序列。已通过V215G取代（如相较于SEQ ID NO: 1)消除第四T细胞表位。
[0021 ]图8显示编码具有N末端哺乳动物信号序列的SEQ ID N0:7的g3p-hIgGl-Fc融合蛋 白的DNA序列（SEQ ID NO:8)。
[0022] 发明详述
[0023]在本申请中，关于参照（未修饰的）氨基酸或核酸序列的术语"经修饰的"（及其同 源词)是指含有一个或多个氨基酸取代或对应的密码子取代的序列。修饰不一定需要参照 序列的物理操作。只要序列含有如相较于参照序列的此类取代，其就可被认为是"经修饰 的"，无论其是如何合成的。术语"变体"是指已被修饰来相较于参照序列减小免疫原性的氨 基酸或核酸序列。如本文中所用，"变体g3p"或"变体N1-N2"是指这样的氨基酸序列(或编码 其的核酸序列），所述序列包含丝状噬菌体g3p蛋白的N1-N2部分(例如，SEQ ID N0:1的氨基 酸1-217)，或(b)结合和/或解聚淀粉样蛋白的该氨基酸序列的突变体或片段(例如，SEQ ID N0:3的氨基酸1-217)，其中所述氨基酸序列(或编码其的核酸序列）已被修饰来相较于参照 (未修饰的)氨基酸序列减小免疫原性；以及其中所述修饰由选自表1、表2、表6或表7的任一 个中所示的氨基酸取代或对应取代的组的1至9个选自氨基酸取代组成。如本文中所用，术 语"对应取代"意指当将此类突变体或片段与SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217比对时，对应于表 1、表2、表6或表7中的等同氨基酸取代的SEQ ID NO: 1的突变体或氨基酸1-217的片段中的 取代。
[0024]结合和/或解聚淀粉样蛋白的SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217的片段的实例包括，但 不限于，包含SEQ ID NO: 1的氨基酸1-67的任何片段。结合和/或解聚淀粉样蛋白的SEQ ID N0:1的氨基酸1 -217的片段的突变体的实例包括，但不限于：（I)SEQ ID N0: 3的氨基酸1 -217; (2)在氨基酸43-45处具有AAA对VVV的取代的SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217、SEQ ID NO: 3的氨基酸1-217或SEQ ID N0:7的氨基酸1-217; (3)具有取代C53W的SEQ ID NO: 1的氨基酸 1- 217、SEQ ID NO:3的氨基酸 1-217或SEQ ID NO:7的氨基酸 1-217; (4)具有氨基酸96-103 的缺失的SEQ ID N0:1的氨基酸1-217、SEQ ID N0:3的氨基酸1-217或SEQ ID N0:7的氨基 酸1-217; (5)在氨基酸212-214处具有AGA对QPP的取代的SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217、SEQ IDN0:3的氨基酸1-217或SEQIDN0:7的氨基酸1-217;(6)具有取代W181A、F190A和F194A 的SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217、SEQ ID NO: 3的氨基酸1-217或SEQ ID NO: 7的氨基酸1-217;(7)PCT/US2012/066793中公开的其它活性突变体和片段；（8)SEQIDN0:7的氨基酸1-217; (9)SEQ ID NO: 1 的氨基酸2-217、SEQ ID NO:3的氨基酸2-217或SEQ ID NO:7的氨基酸 2- 217;(10)SEQ ID N0:1 的氨基酸3-217、SEQ ID N0:3的氨基酸3-217或SEQ ID N0:7的氨 基酸3-217。
[0025]先前已显示丝状噬菌体g3p蛋白的N1-N2部分具有淀粉样蛋白结合和解聚性质（参 见PCT/US2012/066793)。天然M13噬菌体的N1-N2部分由SEQ ID N0:1的氨基酸1-217代表。 相同的N1-N2氨基酸序列也存在于fd和Π 丝状噬菌体中。应当理解，SEQ ID NO: 1的氨基酸 218-256也是天然g3p序列的部分并且通常被称为将g3p的N2区连接至g3p(CT)的C末端的富 含甘氨酸的接头，也称为N3结构域。SEQ ID NO: 1的氨基酸257-261代表由用于构建编码SEQ ID NO: 1的融合蛋白的核酸分子的多克隆位点编码的氨基酸。
[0026] MX
[0027]因此，在一个实施方案中，本发明提供包含变体g3p或变体N1-N2的多肽。本发明的 更具体的实施方案提供了包含选自SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217、SEQ ID NO: 3的氨基酸1-217和SEQ ID N0:7的氨基酸1-217的起始氨基酸序列的变体的多肽，其中：（a)所述多肽结 合和/或解聚淀粉样蛋白；（b)所述多肽相较于包含起始氨基酸序列的对应多肽具有减小的 免疫原性;和(c)所述变体相较于所述起始氨基酸序列具有1至9个氨基酸取代，其中每一个 氨基酸取代选自表1和表2中所示的氨基酸取代的组。如本文中所用，术语"包含起始氨基酸 序列的对应多肽"意指除取代外具有与包含所述起始氨基酸序列的多肽相同的氨基酸序列 的多肽。
[0028]表1.针对SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:7的氨基酸 1-217 的去免疫化氨基酸取代。
[0030]表2.针对SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:7的氨基酸 1-217 的替代性或另外的去免疫化氨基酸取代。
[0032] *在表1和2中，每一个指定的氨基酸在SEQ ID NOS: 1、3和7中是相同的。
[0033]通过鉴定完全存在于N1-N2氨基酸序列内的T细胞表位来导出表1和2中所示的氨 基酸取代。这通过将N1-N2序列的不同重叠肽部分针对来自一个组群的最佳地代表HLA-DR 同种异型的世界人口的社区供血者的外周血单核细胞(PBMC)进行孵育以鉴定潜在T细胞表 位来进行。随后将该信息经历针对已知T细胞表位的数据库的软件分析以鉴定那些潜在表 位内的最佳氨基酸取代。这些方法详细地描述于实施例中。
[0034] 在这些实施方案的一个方面，1-9个氨基酸取代选自表1中所示的那些氨基酸取 代。在上文所示的实施方案的更具体方面，所述多肽包含仅具有特定的单氨基酸取代的SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217的变体或SEQ ID NO:3的氨基酸1-217的变体或SEQ ID NO:7的氨基 酸1 -217的变体，其中所述取代选自表3中所示的取代之一：
[0035] 表3.SEQ ID N0:1 的氨基酸 1-217、SEQ ID N0:3的氨基酸 1-217或SEQ ID N0:7的 氨基酸1-217中的特定去免疫化单氨基酸取代
[0037] 在一些实施方案中，多肽包含具有2-9个氨基酸取代的SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217的变体或SEQ ID N0:3的氨基酸1-217的变体、或SEQ ID N0:7的氨基酸1-217的变体，其 中所述取代存在于表位1、2和3的至少两个中，并且其中所述取代选自表1和2中所示的那些 表位。在更具体方面，SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217的变体或SEQ ID N0:3的氨基酸1-217的 变体或SEQ ID N0:7的氨基酸1-217的变体中的至少2个取代选自表1中所示的那些取代。在 甚至更具体方面，所述多肽包含仅具有2个氨基酸取代的SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO: 7的变体，其中所述取代选自表4中所示的任何特定的二氨基酸取代：
[0038] 表4.SEQ ID N0:1 的氨基酸 1-217、SEQ ID N0:3的氨基酸 1-217或SEQ ID N0:7的 氨基酸1-217中的特定的去免疫化的二氨基酸取代：
[0041 ]在另一个实施方案中，所述多肽包含具有3-9个氨基酸取代的SEQ ID NO: 1的氨基 酸1-217的变体或SEQ ID N0:3的氨基酸1-217的变体、或SEQ ID N0:7的氨基酸1-217的变 体，其中至少一个氨基酸取代存在于表位1、2和3的每一个中，并且其中所述取代选自表1和 表2中所示的取代。在更具体方面，SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217的变体或SEQ ID N0:3的氨 基酸1-217的变体或SEQ ID NO:7的氨基酸1-217的变体中的至少3个氨基酸取代选自表2中 所示的取代。在甚至更具体方面，包含SEQ ID NO: 1的氨基酸1-217的变体或SEQ ID NO:3的