相关的至少一种症状，并且防止所述病毒扩散至群体中的其 他个体。术语群体定义为个体(例如学龄儿童、老年人、健康个体、等）的组，并且可以包括地 理地区（例如特定的城市、学校、社区、工作场所、国家、州、等）。
[0046] 如本文中使用的，术语"抗原配制剂"或"抗原组合物"指在对脊椎动物(尤其是哺 乳动物)施用时会诱导免疫应答的制备物。
[0047]如本文中使用的，术语"脊椎动物"或"受试者"或"患者"指脊索动物亚门的任何成 员，包括但不限于人和其它灵长类，包括非人灵长类，诸如黑猩猩和其它猿和猴物种。牲畜， 诸如牛、绵羊、猪、山羊和马;家养哺乳动物，诸如犬和猫;实验动物，包括啮齿类，诸如小鼠、 大鼠和豚鼠；鸟类，包括家禽、野禽和猎禽，诸如鸡、火鸡和其它鹑鸡类禽、鸭、鹅、等等也是 非限制性例子。此定义中包括术语"哺乳动物"和"动物"。意图覆盖成年和新生个体两者。
[0048] 纳米颗粒VLP
[0049] 疫苗开发的目的之一是生成针对病原体刺激免疫系统，但是自身不是感染性的疫 苗。这已经引导不要在疫苗中使用全病毒体，而是朝向更加最低限度的组合物。然而，这些 最低限度组合物呈现其自身的障碍，并且特别地经常展现降低的免疫原性，其需要使用加 强免疫应答的系统和佐剂。包含天然病毒蛋白的纳米颗粒提供驾驭病毒进入细胞并且刺激 免疫应答的天然能力的免疫手段。
[0050] 如本文中公开的，纳米颗粒是特定类型的病毒样颗粒(VLP)。纳米颗粒含有病毒蛋 白，但是不含任何病毒遗传材料，并且因此它们自身不是感染性的。纳米颗粒通过重组生成 的病毒蛋白的自我装配来形成，并且刺激尤其有用的免疫应答。不限于理论，认为大小、重 复结构和颗粒性质促成有力的免疫应答。值得注意地，即使在缺乏佐剂的情况下可以获得 有力的免疫应答。
[0051 ] 纳米颗粒结构
[0052]纳米颗粒含有以多聚体形式排列的病毒蛋白，诸如病毒壳体或外壳蛋白。通常，多 聚体至少是病毒蛋白的三聚体。在其它方面中，多聚体可以含有病毒蛋白的超过三个单体。 例如，多聚体可以含有4、5、6、7、8、9或10个单体单位(称为4聚体、5聚体、6聚体、等等）。在具 体的方面中，可以将多聚体装配成更高等级的结构。如此，例如，纳米颗粒可以含有至少约3 个多聚体、至少约5个多聚体、至少约10个多聚体、至少约15个多聚体、至少约20个多聚体、 或至少约30个多聚体。在具体的方面中，纳米颗粒含有介于约5和15个之间的多聚体、介于 约5和20个之间的多聚体、或介于约5和30个之间的多聚体。在又一些方面中，纳米颗粒含有 介于约5和200个之间的多聚体、介于约10和200个之间的多聚体或介于约10和50个之间的 多聚体。如此，在具体的例子中，纳米颗粒可以含有约5至约20个三聚体。
[0053] 一般地，可以通过增加蛋白质浓度来获得更加复杂的较高等级的结构。在一个例 子中，较低蛋白质浓度产生包含约5个多聚体的纳米颗粒，而较高蛋白质浓度(例如30-50μ g/mL)产生包含约10至20个多聚体的纳米颗粒。在一个非限制性例子中，纳米颗粒的浓度是 至少约 I 〇yg/mL、约 20yg/mL、约 30yg/mL、约 40yg/mL、约 50yg/mL、约 60yg/mL、约 10 Oyg/mL、约 200yg/mL、或约500yg/mL。具体地，纳米颗粒的浓度可以介于约10yg/mL至约lmg/mL之间，或 者介于约20yg/mL至约500yg/mL之间，或者介于约30yg/mL至约100yg/mL之间，或者介于约 30yg/mL 至约 50yg/mL之间。
[0054] 纳米颗粒蛋白
[0055] 本文中公开的纳米颗粒可以包含任何MERS-CoV蛋白，包括但不限于刺突（S)蛋白、 膜(M)蛋白、核壳体(N)蛋白、和包膜(E)蛋白或其组合。所述蛋白可以自任何MERS-CoV株、进 化枝或种获得或衍生。纳米颗粒可以包含来自一种或多种MERS-CoV隔离群、株、进化枝和/ 或种的一种或多种蛋白。在一个实施方案中，自MERS-CoV的Jordan-N3/2012株(GenBank KC776174.1)获得或衍生蛋白。在另一个实施方案中，自MERS-CoV的Munich_2013株获得或 衍生蛋白。在另一个实施方案中，自MERS-CoV的Al-Hasa_l_2013株获得或衍生蛋白。也可以 自多种其它来源衍生或获得构成纳米颗粒的蛋白，包括但不限于Hafr-Al-batinj_2013 株、Bi sha_l_2012株、Qatar_3_2013株、Came l_Egypt_2013株、MERS-CoV进化枝A病毒、MERS-C0V进化枝B病毒、紧密相关HKU4和HKU5蝙蝠冠状病毒株、和/或其它紧密相关冠状病毒。也 可以在体外合成或重组生成MERS-CoV蛋白。在一个实施方案中，在昆虫细胞(诸如Sf9细胞） 中重组生成蛋白。
[0056] 在一个实施方案中，多聚体可以包含一种或多种不同类型的MERS-CoV蛋白。在又 一个实施方案中，多聚体包含单一类型的MERS-CoV蛋白。在一个优选的实施方案中，多聚体 仅包含刺突蛋白。在另一个实施方案中，多聚体中的蛋白质由刺突蛋白组成。在又一个实施 方案中，纳米颗粒不含膜或核壳蛋白。在又一个实施方案中，纳米颗粒不含任何病毒核酸序 列。
[0057] 在一个实施方案中，纳米颗粒包含刺突蛋白或其片段。在又一个实施方案中，纳米 颗粒包含刺突蛋白或其片段的三聚体。在另一个实施方案中，纳米颗粒包含由SEQ ID NO: 1 编码的刺突蛋白的至少一个多聚体。在另一个实施方案中，纳米颗粒包含包含SEQ ID N0:2 的刺突蛋白的至少一个多聚体。在另一个实施方案中，纳米颗粒包含由SEQ ID N0:2组成的 刺突蛋白的至少一个多聚体。在又一个实施方案中，纳米颗粒包含刺突蛋白受体结合域 (RBD)的至少一个多聚体。
[0058] 可以如本领域中描述的那样制备纳米颗粒（例如如2010年9月23日公布的 US20100239617所述，为了所有目的收入本文）。描述适用于本公开内容的分子生物学技术 (诸如克隆、突变、细胞培养、等等）的通用教科书包括Berger and Kimmel ,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology volume 152,Academic Press, Inc.，San Diego，Calif·(Berger);Sambrook et al.,Molecular Cloning-ALaboratory Manual(3rd Ed.),Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor, Ν·Υ·，2000("Sambrook"）；和Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel et al·，eds·，Current Protocols,Greene Publishing Associates，Inc·和John Wiley& Sordine.的一项联合投资（"Ausuber'h这些教科书描述了诱变，使用载体，启动子和与蛋 白质克隆和突变相关的许多其它相关主题。如此，本公开内容还涵盖使用蛋白质工程和重 组DNA技术的已知方法来改善或改变纳米颗粒之上或之中表达的蛋白质的特征。它们包括 但不限于定点、随机点诱变、同源重组(DNA改组）、使用含有尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸 指导的诱变、经硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用有缺口的双链体DNA的诱变、等等。别的合 适的方法包括点错配修复、使用修复缺陷宿主株的诱变、限制-选择和限制-纯化、删除诱 变、通过完全基因合成的诱变、双链断裂修复、等等。本公开内容中还包括例如牵涉嵌合构 建体的诱变。在一个实施方案中，可以通过天然发生分子或改变或突变的天然发生分子的 已知信息(例如序列、序列比较、物理特性、晶体结构、等等)来指导诱变。
[0059] MERS刺突蛋白
[0060]自MERS-CoV隔离群、株、进化枝、和/或序列获得或衍生合适的刺突蛋白或其片段。 或者，它们可以重组或合成生成。例如，在Genbank登录号AGN70962中披露了一种合适的 MERS-CoV氨基酸序列（图9, SEQ ID NO: 2)。在一个实施方案中，自Al-Hasa MERS-CoV株获得 刺突蛋白或其片段。
[0061 ]本公开内容提供了MERS-CoV蛋白的变体。变体可以含有组成性蛋白质的氨基酸序 列中的变化。就多肽而言，术语"变体"指就参照序列而言改变一个或多个氨基酸的氨基酸 序列。变体可以具有"保守"变化，其中替代的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如用异 亮氨酸替换亮氨酸。或者，变体可以具有"非保守"变化，例如用色氨酸替换甘氨酸。类似的 微小变异还可以包括氨基酸删除或插入，或者这两者。可以使用本领域公知的计算机程序 (例如DNASTAR软件)找到确定哪些氨基酸残基可以在不消除生物学或免疫学活性的情况中 被替代、插入或删除的指导。
[0062] 天然变体可以由于抗原性漂移而发生。抗原性漂移是病毒蛋白中随时间连续发生 的小变化。如此，感染有特定MERS-CoV病毒株的人形成针对该病毒的抗体，随着较新的病毒 株出现，针对较老的株的抗体不再识别较新的病毒，并且可以发生再感染。可以使用这些天 然发生的MERS-CoV蛋白和RBD变体来生成本文所述纳米颗粒。
[0063] 在一些实施方案中，突变含有如下变化，所述变化产生沉默替代、添加、或删除，但 是不改变编码的蛋白质的特性或活性或者蛋白质怎样生成。可以出于多种原因生成核苷酸 变体，例如为了优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变成昆虫细胞诸如Sf9 细胞优选的那些）。参见美国专利公开文本2005/0118191，通过提及将其完整收入本文用于 所有目的。在一个具体的方面中，优选的蛋白质由经密码子优化的核苷酸序列(诸如图8中 所示，SEQ ID NO: 1)编码。核酸和多肽可以与图8和9中所示序列（SEQ ID NO: 1和2)至少 85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同。
[0064] 另外，可以对核苷酸测序以确保正确的编码区得到克隆，并且不含任何不想要的 突变。可以将核苷酸亚克隆入表达载体(例如杆状病毒）中以在任何细胞中表达。上文仅是 可以如何克隆病毒蛋白的一个例子。本领域技术人员理解别的方法是可用的并且是可能 的。
[0065] 本公开内容还提供了会提高纳米颗粒生成的效率的构建体和方法。例如，自蛋白 质除去切割位点以增加蛋白质表达。其它方法包括添加前导序列以实现更加有效的转运。 例如，可以将异源信号序列与MERS蛋白融合。在一个实施方案中，可以自昆虫细胞的基因衍 生信号序列。在另一个实施方案中，信号肽是壳多糖酶信号序列，其在杆状病毒表达系统中 有效运转。在其它实施方案中，在蛋白质间互换前导序列能提供更好的蛋白质转运。
[0066] 可以使用编码MERS-CoV蛋白或其片段的合适载体。例如，载体可以是噬菌体、质 粒、病毒、或逆转录病毒载体。在一个实施方案中，载体是重组杆状病毒载体。编码基因的构 建体和/或载体应当与合适的启动子可操作连接，诸如AcMNPV多角体蛋白启动子(或其它杆 状病毒）、噬菌体APL启动子、大肠杆菌lac、ph 〇A和tac启动子、SV40早期和晚期启动子、和逆 转录病毒LTR的启动子是非限制性例子。根据宿主细胞和/或期望的表达速率，其它合适的 启动子会是熟练技术人员知道的。表达构建体会进一步含有用于转录起始，终止的位点，和 转录区中用于翻译的核糖体结合位点。优选地，由构建体表达的转录物的编码部分会包括 开始处的翻译起始密码子和适当位于要翻译的多肽末尾处的终止密码子。
[0067] 优选地，表达载体会包括至少一个选择标志。此类标志包括用于真核细胞培养的 二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性和用于在大肠杆菌和其它细菌中培养的四环素、卡那 霉素或氨节青霉素抗性基因。优选的载体中有病毒载体，诸如杆状病毒、痘病毒(例如痘苗 病毒、鸟痘病毒、金丝雀痘病毒、鸡痘病毒、浣熊痘病毒、猪痘病毒、等）、腺病毒(例如犬腺病 毒）、疱疹病毒、和逆转录病毒。也可以使用细菌载体。例示性的细菌载体包括pQE70、pQE60 和pQE_9、pB Iue script载体、Phage scrip t 载体、pNH8A、pNHl 6a、pNH18A、pNH46A、p trc99a、 pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。优选的真核载体中有 pFastBacl、pWINE0、pSV2CAT、 pOG44、pXTl和?3643￥1(348?￥4136、和?3￥匕其它合适的载体会是熟练技术人员容易显而 易见的。
[0068]可以依照本领域公知的方法将载体(例如包含MERS-CoV多核苷酸的载体)转染入 宿主细胞中。例如，可以通过磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂转染、和采用多胺转染试 剂的转染将核酸导入真核细胞中。在一个实施方案中，所述载体是重组杆状病毒。
[0069] 重组载体(诸如上文公开的那些）可以用于转染、感染或转化真核细胞和/或原核 细胞，并且可以在真核细胞和/或原核细胞中表达蛋白质。真核宿主细胞中有酵母、昆虫、鸟 类、植物、秀丽隐杆线虫(C.elegan S)(或线虫)和哺乳动物宿主细胞。昆虫细胞的非限制性 例子是草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)( Sf)细胞，例如Sf9、Sf21、粉纹夜蛾 (Trichoplusia ni)细胞，例如High Five细胞，和果绳(Drosophila)S2细胞。真菌(包括酵 母）宿主细胞的例子有酿酒酵母（S.cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis，K. Iactis)、假丝酵母属(Candida)物种(包括白色假丝酵母(C.albicans)和光滑假 丝酵母（C.glabrata))、构巢曲霉（Aspergillus nidulans)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe，S. pombe)、巴斯德毕赤酵母（Pi chia pas tor is)、和解脂耶 氏酵母(Yarrowia I ipoIytica)。哺乳动物细胞的例子有⑶S细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠 L细 胞、LNCaP细胞、中国仓鼠卵巢（CHO)细胞、人胚肾（HEK)细胞、和非洲绿猴细胞、CVl细胞、 HeLa细胞、MDCK细胞、Vero和Hep-2细胞。也可以使用光滑爪蟾(Xenopus Iaevis)卵母细胞， 或两栖类起源的其它细胞。原核宿主细胞包括细菌细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌 (B. subtil is)和分枝杆菌。
[0070] 培养工程化改造为生成纳米颗粒的细胞的方法包括但不限于分批、分批-补料、连 续和灌注细胞培养技术。细胞培养意指细胞在生物反应器(发酵室）中的生长和增殖，其中 细胞增殖并表达蛋白质（例如重组蛋白）以进行纯化和分离。通常，在生物反应器中在无菌 受控温度和气氛条件下实施细胞培养。生物反应器是用于培养细胞的室，其中可以监测环 境条件，诸如温度、气氛、搅拌和/或PH。在一个实施方案中，所述生物反应器是不锈钢室。在 另一个实施方案中，所述生物反应器是预先灭菌的塑料袋(例如Cellbag?,Wave Biotech, Bridgewater,NJ)。在其它实施方案中，所述预先灭菌的塑料袋是约50L至1000L袋。
[0071] 然后，纳米颗粒