可以使用保留其完整性的方法，诸如通过梯度离心，例如氯化铯、 鹿糖和碘克沙醇（iodixano 1 )，以及标准纯化技术(包括例如离子交换和凝胶过滤层析)来 分呙。
[0072] 下文是可以如何生成、分离和纯化纳米颗粒的例子。通常，自工程化改造为创建纳 米颗粒的重组细胞系当在细胞培养中培养所述细胞时生成纳米颗粒。
[0073]例如，纳米颗粒的生成可以如下开始，即将Sf9细胞(未感染的）接种入摇瓶中，容 许细胞扩充，并且随细胞生长和繁殖而放大(例如从125ml烧瓶至50L Wave袋）。对合适的细 胞系配制用于培养细胞的培养基(优选无血清培养基，例如昆虫培养基ExCell-420，JRH)。 接着，以最有效的感染复数(例如每个细胞约1至约3个噬斑形成单位)用重组杆状病毒感染 所述细胞。一旦发生了感染，蛋白质自病毒基因组表达，该蛋白质自我装配成纳米颗粒VLP， 并且在感染后大约24至72小时自细胞分泌。通常，当细胞处于对数生长期中期(4-8X IO6个 细胞/ml)并且是至少约90 %存活时，感染是最有效的。
[0074]或者，例如，可以通过用如下重组杆状病毒感染宿主细胞(例如Sf9细胞)来生成纳 米颗粒，所述重组杆状病毒包含编码一种或多种感兴趣MERS-CoV蛋白的核苷酸序列。温育 并收获经感染的细胞。用去污剂自细胞膜提取MERS-CoV蛋白（例如刺突蛋白）。然后，容许蛋 白质天然装配以形成结构(例如三聚体），然后纯化该结构。在纯化期间除去去污剂容许蛋 白质形成较高等级的结构，诸如包含多重结构的纳米颗粒(例如包含蛋白质三聚体的蛋白 质-蛋白质胶束纳米颗粒）。一般地，纳米颗粒中的结构的数目受到蛋白质浓度影响，较高的 蛋白质浓度产生包含较大数目的结构(例如三聚体)的纳米颗粒。
[0075]可以在感染后大约48至96小时，在细胞培养液中纳米颗粒VLP的水平接近最大值 时，但是在广泛细胞裂解前收获纳米颗粒。收获时的SfO细胞密度和存活力可以是约0.5 X IO6个细胞/ml至约1.5 X IO6个细胞/ml及至少约20%存活力，如通过染料排除测定法显示 的。接着，取出并澄清培养液。可以对培养液添加 NaCl至浓度为约0.4至约1.0M，优选至约 0.5M，以避免不想要的聚集。可以通过用一次性使用的预先灭菌的中空纤维0.5或Ι.ΟΟμπι滤 器筒或类似装置的切向流过滤(TFF)实现自含有纳米颗粒的细胞培养液除去细胞和细胞碎 片。
[0076]接着，可以通过使用抛弃型预先灭菌的500，000分子量截留中空纤维筒的超滤来 浓缩澄清的培养液中的纳米颗粒。可以针对1 〇个体积的含有〇. 5MNaCl的pH 7.0至8.0的磷 酸盐缓冲盐水(PBS)渗滤浓缩的纳米颗粒以除去残留的培养基成分。
[0077] 可以通过于约4°(3至约10°(3以6,500\8离心18小时在具有0.51恥(：1的口!17.2?85 缓冲液中的20 %至60 %不连续鹿糖梯度上进一步纯化经过浓缩、渗滤的纳米颗粒。通常，纳 米颗粒VLP会在约30 %至约40 %蔗糖之间或者在界面处(在20 %和60 %步式梯度中）形成独 特可见条带，可以自梯度收集并贮存该条带。可以稀释此产物以包含200mM NaCl，为纯化工 艺中的下一步做准备。此产物含有纳米颗粒VLP，并且可以含有完整的杆状病毒颗粒。
[0078]可以通过阴离子交换层析，或者44 %等密度蔗糖垫离心来实现纳米颗粒的进一步 纯化。在阴离子交换层析中，将来自蔗糖梯度的样品（见上文)加载入含有具有阴离子的介 质（例如Matrix Fractogel EMD TMAE)的柱中，并且经由盐梯度（自约0.2M至约1.0M NaCl) 洗脱，所述盐梯度能分开纳米颗粒与其它污染物(例如杆状病毒和DNA/RNA)。在蔗糖垫方法 中，将包含纳米颗粒的样品添加至44%鹿糖垫，并且以30 ,OOOg离心约18小时。纳米颗粒在 44%蔗糖的顶部形成条带，而杆状病毒在底部沉淀，并且其它污染性蛋白质保留于顶部的 〇 %鹿糖层中。收集纳米颗粒峰或条带。
[0079] 若想要的话，可以灭活完整的杆状病毒。可以通过化学方法，例如福尔马林或β-丙 内酯(BPL)实现灭活。也可以通过使用本领域已知的选择性沉淀和层析方法在很大程度上 实现完整杆状病毒的除去和/或灭活，如上文例示的。灭活方法包括将在〇. 2%BPL中含有纳 米颗粒的样品于约25°C至约27°C温育3小时。也可以通过将以0.05%BPL含有纳米颗粒的样 品于4°C温育3天，然后于37°C温育1小时来灭活杆状病毒。
[0080] 在灭活/除去步骤后，可以经由另一个渗滤步骤运行包含纳米颗粒的产物以除去 来自灭活步骤的任何试剂和/或任何残留蔗糖，并且将纳米颗粒放入期望的缓冲液(例如 PBS)中。可以通过本领域已知的方法(例如无菌过滤)将包含纳米颗粒的溶液灭菌，并在冰 箱或冷冻器中贮存该溶液。
[0081 ]可以在多个规模间实施上述技术。例如，T-烧瓶、摇瓶、转瓶、直至工业大小的生物 反应器。生物反应器可以包含不锈钢罐或预先灭菌的塑料袋（例如由Wave Biotech， Bridgewater，NJ出售的系统）。本领域技术人员会知道什么是对于他们的目的最想要的。 [0082]药物或疫苗配制剂和施用
[0083] 在本文中有用的药物组合物含有药学可接受载剂，包括任何合适的稀释剂或赋形 剂，其包括任何下述药剂，该药剂自身不诱导产生对接受组合物的脊椎动物有害的免疫应 答，并且可以在没有过度毒性的情况中与纳米颗粒一起施用。如本文中使用的，术语"药学 可接受"意指得到联邦或州政府的管理结构批准或在美国药典、欧洲药典或其它公认的药 典中列出用于脊椎动物，且更特别地用于人。
[0084] -般地，以有效量或数量(如上文定义的）施用纳米颗粒，所述有效量或数量足以 刺激针对MERS CoV病毒的一种或多种株的免疫应答。可以作为疫苗和/或抗原性组合物使 用这些组合物以在脊椎动物中诱导保护性免疫应答。组合物可以含有具有不同多聚体类型 的纳米颗粒。例如，组合物可以主要含有三聚体，剩余部分由不同多聚体构成。在一个实施 方案中，以有效量施用以刺激针对MERS CoV病毒的一种或多种株的免疫应答的纳米颗粒包 含MERS-CoV蛋白的至少约5至100个三聚体、至少约10至90个三聚体、至少约20至50个三聚 体、至少约10至30个三聚体、或至少约10至20个三聚体。在又一个组合物实施方案中，施用 的纳米颗粒包含刺突蛋白或其片段(诸如RBD)的至少约5至100个三聚体、至少约10至90个 三聚体、至少约20至50个三聚体、至少约10至30个三聚体、或至少约10至20个三聚体。
[0085] 在一个非限制性实施方案中，纳米颗粒的浓度是至少约10yg/mL、约20yg/mL、约30 yg/mL、约40yg/mL、约 50yg/mL、约 60yg/mL、约 100yg/mL、约 200yg/mL、或约 500yg/mL。在具体 的方面中，纳米颗粒的浓度介于约10yg/mL至约lmg/mL之间，或介于约20yg/mL至约500yg/ mL之间，或介于约30yg/mL至约100yg/mL之间，或介于约30yg/mL至约50yg/mL之间。
[0086]在其它例子中，组合物可以包含较高等级的纳米颗粒，诸如5聚体至6聚体。在具体 的方面中，组合物含有至少70%5聚体至6聚体、至少80%5聚体至6聚体、或至少90 %5聚体 至6聚体。在其它方面中，组合物含有至少70%5聚体至6聚体、至少80%5聚体至6聚体、或至 少90 % 5聚体至6聚体。
[0087] 在一个实施方案中，本文中公开的药物配制剂包含如下纳米颗粒和药学可接受载 剂或赋形剂，所述纳米颗粒包含MERS-CoV蛋白，经常是刺突蛋白。
[0088] 在其它实施方案中，组合物可以含有如下纳米颗粒，所述纳米颗粒含有来自不同 MERS株的MERS-CoV蛋白，或变体诸如RBD变体。可以施用此类组合物以提供针对多种不同株 的免疫力。在一个方面中，组合物可以含有纳米颗粒以提供针对第一株、第二株、第三株的 免疫应答。在另一个方面中，纳米颗粒可以提供针对4、5或6种株的免疫应答。在另一个实施 方案中，药物配制剂包含经过纯化的在施用纳米颗粒的动物中生成的高亲和力抗体。
[0089] 药学可接受载剂包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、无菌等张水性缓 冲液、及其组合。药学可接受载剂、稀释剂和其它赋形剂的全面讨论呈现于Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.N.J.，当前版本）。配制剂应当适合施用模式。在 一个优选的实施方案中，配制剂适合于对人施用，优选是无菌、无颗粒和/或无热原的。
[0090] 若想要的话，组合物也可以含有少量湿润或乳化剂、或PH缓冲剂。组合物可以是固 体形式，诸如适合于重建的冻干粉末、液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放 配制剂、或粉剂。口服配制剂可以包含标准载剂，诸如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸 镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁、等。
[0091] 本公开内容还提供了药用包装或试剂盒，其包含装有免疫原性疫苗配制剂的一种 或多种成分的一个或多个容器。在一个优选的实施方案中，试剂盒包含两个容器，一个含有 纳米颗粒而另一个含有佐剂。与此类容器联合的可以是管理制造、使用或销售药物或生物 产品的政府机构规定的形式的通告，该通告反映该机构批准制造、使用或销售用于人施用。
[0092] 可以在密封容器(诸如安瓿或小袋（sachette))中包装配制剂，指示组合物的数 量。在密封容器中，在一个实施方案中，以液体，在另一个实施方案中，以干燥灭菌冻干粉或 无水浓缩物供应组合物，并且可以例如用水或盐水重建至适合于对受试者施用的浓度。优 选地，以优选约 lyg、约5yg、约 10yg、约20yg、约25yg、约30yg、约50yg、约 100yg、约 125yg、约 150yg、或约200yg的单位剂量在密封容器中以干燥无菌冻干粉供应组合物。或者，组合物的 单位剂量小于约Iyg (例如约〇 · 〇8yg、约0 · 04yg、约0 · 2yg、约0 · 4yg、约0 · 8yg、约0 · 5yg或更 小、约0.25yg或更小、或约0.1 yg或更小），或大于约125yg(例如约150yg或更多、约250yg或 更多、或约500yg或更多）。可以以总纳米颗粒或以yg MERS-CoV蛋白（例如刺突蛋白或其片 段)测量这些剂量。应当在自冻干粉重建后约12小时内，优选约6小时内，约5小时内，约3小 时内，或约1小时内施用纳米颗粒组合物。
[0093] 在一个备选的实施方案中，在密封容器中以液体形式供应纳米颗粒组合物，指示 纳米颗粒组合物的数量和浓度。优选地，以至少约50μg/ml，更优选至少约100μg/ml，至少约 200μg/ml，至少500μg/ml，或至少lmg/ml在密封容器中供应液体形式的纳米颗粒组合物。 [0094]可以对动物施用纳米颗粒以引发针对MERS-CoV的免疫应答。在一个实施方案中， 动物对MERS-CoV感染易感。在一个实施方案中，动物是人。优选地，纳米颗粒的施用引发针 对至少一种MERS-CoV株、隔离群、进化枝、和/或物种的实质性免疫力。在一个实施方案中， 纳米颗粒的施用引发针对至少2种或更多种MERS-CoV株、隔离群、进化枝、和/或物种的实质 性免疫力。在又一个实施方案中，纳米颗粒的施用引发针对另一种冠状病毒的实质性免疫 力。通常，可以根据例如年龄、身体状况、体重、性别、饮食、施用时间、和其它临床因素，在此 范围内调节剂量。
[0095] 如此，本文中公开了配制对受试者诱导针对病毒感染或其至少一种症状的实质性 免疫力的疫苗或抗原性组合物的方法，其包括对所述配制剂添加有效剂量的纳米颗粒。
[0096] 虽然用单剂刺激实质性免疫力是优选的，但是可以通过相同或不同路径施用额外 剂量以实现期望的效果。例如，在新生儿和婴儿中可能需要多次施用以引发足够水平的免 疫力。在维持足够水平的针对感染的保护必要时，施用可以贯穿整个童年以某种间隔继续。 类似地，对重复或严重感染特别易感的成年人，诸如例如健康护理工作人员、日间护理工作 人员、幼儿的家庭成员、老年人、和具有受损的心肺功能的个体，可能需要多次免疫以建立 和/或维持保护性免疫应答。例如，可以通过测量中和性分泌性和血清抗体的量来监测诱导 的免疫力的水平，并且在必要时调节剂量或重复疫苗接种以引发和维持期望水平的保护。 [0097]如此，在一个实施方案中，在受试者中诱导针对病毒感染或其至少一种症状的实 质性免疫力的方法包括施用至少一个有效剂量的纳米颗粒，其中纳米颗粒包含至少一个包 含MERS CoV刺突蛋白或其片段的三聚体。在其它方面中，纳米颗粒包含至少一个基本上由 MERS CoV刺突蛋白或其片段组成的三聚体。实际上，刺突蛋白可以是三聚体和/或纳米颗粒 中的唯一蛋白质。
[0098] 施用包含纳米颗粒的组合物(疫苗和/或抗原性配制剂)的方法包括但不限于胃肠 外施用（例如皮内、肌肉内、静脉内和皮下）、硬膜外和粘膜(例如鼻内和口服或肺路径或者 通过栓剂）。在一个具体的实施方案中，肌肉内、静脉内、皮下、经皮或皮内施用本公开内容 的组合物。可以通过任何方便的路径，例如通过输注或推注，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里 (例如口腔粘膜、结肠、结膜、鼻咽、口咽、阴道、尿道、膀胱和肠粘膜、等)吸收来施用组合物， 并且组合物可以与其它生物学活性剂一起施用。在一些实施方案中，包含纳米颗粒的组合 物的鼻内或其它粘膜路径施用可以诱导实质性高于其它施用路径的抗体或其它免疫应答。 在另一个实施方案中，包含纳米颗粒的组合物的鼻内或其它粘膜路径施用可以诱导如下抗 体或其它免疫应答，该抗体或其它免疫应答会诱导针对病毒的其它株的交叉保护。施用可 以是系统的或局部的。系统性施用防范性疫苗配制剂，例如通过使用针和注射器或无针注 射装置的皮下或肌肉内注射进行。或者，鼻内施用疫苗配制剂，通过滴剂、大颗粒气雾剂(大 于约10微米），或者进入上呼吸道的喷雾剂进行。虽然任何上述投递路径导致免疫应答，但 是鼻内施用在病毒进入部位处赋予引发粘膜免疫的附加益处。
[0099] 在又一个实施方案中，以下述方式施用疫苗和/或抗原性配制剂，使得靶向粘膜组 织，以便在免疫接种部位处引发免疫应答。例如，可以通过使用含有具有特定粘膜靶向特性 的佐剂的组合物的口服施用将免疫靶向粘膜组织，诸如肠相关淋巴样组织(GALT)。也可以 靶向别的粘膜组织，诸如鼻咽淋巴样组织(NALT)和支气管相关淋巴样组织(BALT)。
[0100] 也可以按剂量日程表(例如疫苗组合物的初次施用及后续加强施用)施用疫苗和/ 或抗原性配制剂。在具体的实施方案中，可以在初次施用后2周至1年，优选约1、约2、约3、约 4、约5至约6个月的任何时间施用第二剂组合物。另外，可以在第二剂后并且在初次施用后 约3个月至约2年，或甚至更久，优选约4、约5、或约6个月、或约7个月至约1年施用第三剂。任 选地，可以在第二剂后在受试者的血清和/或尿液或粘膜分泌物中检测不到特异性免疫球 蛋白或检测到低水平的特异性免疫球蛋白时施用第三剂。在一个优选的实施方案中，在第 一次施用后约1个月施用第二剂，并且在第一次施用后约6个月施用第三剂。在另一个实施 方案中，在第一次施用后约6个月施用第二剂。
[0101] 在另一个实施方案中，可以以联合疗法的一部分施用纳米颗粒。例如，可以与其它 免疫原性组合物和/或抗病毒剂一起配制纳米颗粒。
[0102] 熟练技术人员能容易地