HT13IT 1的koff。在另一个实施方案中，通过用本文中公开的纳米颗粒 免疫生成的抗体具有范围为约nrt1至约HT 1t3M'约HT4IT1至约HT9M'或约HT4IT 1至约 10-8M-1 的 koff。
[0133] 通过用本文中公开的纳米颗粒免疫生成的抗体具有高结合速率(k〇n)，指示它们紧 密结合抗原。在一个实施方案中，通过用本文中公开的纳米颗粒免疫生成的抗体具有范围 为约IO3M至约108M、约IO4M至约107M、约IO 4M至约106M、约IO4M至约105M、约IO 5M至约107M、或 约IO5M至约IO6M的k_
[0134] 通过用本文中公开的纳米颗粒免疫生成的抗体中和MERS-CoV病毒。抗体可以是广 泛中和性抗体，并且中和一种或多种MERS-CoV病毒株、进化枝、或冠状病毒，或者抗体仅能 中和一种MERS-CoV病毒株。可以通过本领域中通常采用的任何手段来测量抗体的中和能 力，包括但不限于荧光降低中和测试(FRNT 5Q)、测量自经免疫细胞释放的病毒体的量的基于 细胞的体外测定法、和测量经免疫动物中的感染的体内测定法。
[0135] 本公开内容通过下述实施例进一步例示，所述实施例不应解释为限制性的。通过 提及完整收录贯穿本申请及附图引用的所有参考文献、专利和已公布的专利申请的内容用 于所有目的。
[0136] 实施例1
[0137] MERS CoV刺突纳米颗粒的生成
[0138] 通过在Sf9细胞中过表达杆状病毒中的MERS CoV刺突蛋白（图8和9)生成纳米颗 粒。在纯化后，主要以三聚体形式回收含有刺突蛋白的纳米颗粒VLP(图4和6)。
[0139] 实施例2
[0140] 使用MERS CoV刺突纳米颗粒诱导免疫应答
[0141] 对小鼠施用VLP，如图5中显示的。在45天时段结束时，自小鼠提取血液以评估免疫 应答。图7显示了施用SARS CoV刺突纳米颗粒VLP或MERSCoV刺突纳米颗粒VLP的小鼠的中和 性抗体滴度。通过使用佐剂基质Ml获得最高响应。
[0142] 实施例3
[0143] 自转染色体牛生成的有力的抗MERS-CoV人免疫球蛋白在体内抑制MERS-CoV
[0144] 为了证明疫苗接种后自Tc牛获得的抗MERS CoV hlgG抗体和免疫球蛋白能在体外 和在体内中和MERS CoV，我们对三个分开的Tc牛群施用三种实验性MERS CoV疫苗以诱导针 对MERS CoV的高滴度中和性抗体。测试的第一种疫苗是完整的杀死的Jordan株(进化枝A) MERS-CoV病毒体(WKV)疫苗，第二种是Al-Hasa (进化枝B )MERS-CoV刺突纳米颗粒(SN)疫苗， 而第三种是Al-Hasa MERS-CoV刺突蛋白pDNA疫苗。通过体外测定法发现了pDNA疫苗是免疫 原性较差的，没有进一步评估(数据没有呈现）。然而，来自经WKV(称作SAB-300)和SN(称作 SAB-301)疫苗接种的Tc牛两者的康复期者血清和高度纯化的hlgG免疫球蛋白能够在体外 交叉中和病毒，不诱导抗体依赖性的MERS-CoV进入人Raji B细胞中，并且快速降低MERS-CoV的Ad5-hDPP4转导小鼠模型中的病毒感染(Erasmus染色）。
[0145] 方法和材料
[0146] 动物研究
[0147] 转染色体(Tc)牛克隆和抗体生成
[0148] 如Matsushita,et al·,PLoS 0ne，2014.9(3):p.e90383;Sano，et al·,PLoS One, 2013.8(10) :p.e78119;及Kuroiwa，et al.，Nat Biotechnol ,2009.27(2) :p. 173-81所述生 成Tc牛。简言之，此研究中使用的Tc牛在内源牛免疫球蛋白基因的三重敲除（IGHITa IghmlivIGL+)方面是纯合的，并且携带由人染色体14片段(其含有整个人免疫球蛋白重 链基因座)和人染色体2片段(其含有整个人免疫球蛋白卡帕轻链基因座)组成的人类人工 染色体(HAC)。
[0149] 灭活的完整病毒体生成
[0150] 通过自用J〇rdan-N3/2012株(GenBank KC776174.1)感染的Vero CCL-81 细胞收集 培养液，生成完整的灭活MERS-CoV病毒体以进行疫苗接种。用钴源照射4xl08PFU的MERS-CoV，直到实现6兆拉德的剂量。对于灭活，对材料测试安全性。在经照射的传代材料中没有 检出MERS-Co V特异性信号。
[0151] MERS-CoV刺突纳米颗粒生成
[0152] 如Coleman et aL· ,2014所述生成纯化的Al-Hasa株MERS-CoV刺突蛋白纳米颗粒。 简言之，用特定的重组杆状病毒感染2-3x IO6个细胞/ml的Sf9细胞。于27±2°C在连续搅拌 的情况中温育经感染的Sf9细胞，并且于68-72hpi通过以4000xg离心15分钟收获细胞。用非 离子型去污剂自细胞膜提取刺突蛋白，并且通过以l〇,〇〇〇xg离心30分钟除去不溶性材料。 使用阴离子交换层析、亲和层析和大小排阻层析的组合纯化刺突蛋白装配体。在纯化期间， 除去大部分去污剂，这容许刺突蛋白三聚体形成更高等级的蛋白质-蛋白质胶束纳米颗粒。 将纯化的刺突纳米颗粒进行0.2微米过滤，并且于-80°C贮存。
[0153] Tc牛疫苗接种
[0154] 如图IOA中显示的，以l-2x IO8PPF/剂用完整的杀死的MERS-CoV病毒(WKV)免疫群 1中的三只Tc牛(#2244;#2252和#2254)，所述完整的杀死的MERS-CoV病毒(WKV)用作为水包 油乳剂的Montanide ISA 25佐剂（Seppic)加阜苷衍生免疫刺激剂Quil A(Accurate Chemicals)配制。以2mg/剂用重组MERS-CoV刺突纳米颗粒（SN)免疫群2中的两只Tc牛（# 2178和#2183)，所述重组MERS-CoV刺突纳米颗粒(SN)用作为水包油包水乳剂的Montanide ISA 206佐剂加上Quil A配制。以3至4周间隔将这两群中的Tc牛免疫5次。
[0155] 腺病毒/hDPP4小鼠中的体内MERS-CoV攻击研究
[0156] 用Erasmus染色MERS-CoV感染经转导的hDPP4BALB/c小鼠。简言之，给BALB/c腹膜 内注射100或500yg阴性对照或自牛收集的测试免疫球蛋白（SAB-300或SAB-301)。12小时 后，在总体积50μ1中用MERS-C 〇V( IxIO5PFU)鼻内感染小鼠。为了获得病毒滴度，将肺取入 PBS中，并使用手动匀浆器将肺匀浆。在Vero 81细胞上滴定病毒。对于MERS-CoV，以PFU/g组 织表示病毒滴度。
[0157] 结果和讨论
[0158] Tc动物中生成的抗原特异性hlgG的评估
[0159] 实施MERS-CoV刺突蛋白特异性ELISA以评估用WKV或SN(图10B)和SAB-300和SAB-301(图10C)免疫后Tc牛中的抗原特异性hlgG应答。ELISA结果证明了对于血清和SAB-300和 SAB-301两者（图10)，在第二次疫苗接种(V2)时强力的MERS-CoV刺突特异性hlgG应答，并且 维持高滴度到最后一次免疫(V5)。此数据指示自用WKV或SN免疫的Tc牛生成靶向MERS-CoV 蛋白的高滴度hlgG抗体，并且这两种免疫球蛋白在纯化后保留活性。
[0160] 在体外通过血清、SAB-300和SAB-301中和MERS-CoV
[0161] 荧光降低中和测试-50 %降低(FRNT50)
[0162] 实施了两项中和测定法以鉴定SAB-300和SAB-301的体外中和潜力。使用荧光降低 中和测试(FRNT5q)和病毒感染中和测定法对来自接种疫苗的牛的血清、SAB-300和SAB-301 测定其在体外抑制MERS-Co V感染的能力。FRNT测定法使用荧光报告感染，而病毒感染中和 测定法使用细胞存活力报告。
[0163] 对来自接种疫苗的牛的血清（图I ΙΑ)，及SAB-300和SAB-301 (图11B)实施了FRNT50 测定法。我们发现了牛#2244V2产生高滴度中和性抗体，来自牛#2178和#2183的V2亦然。在 与相等量的阳性对照经抗原亲和纯化的抗刺突家兔抗体相比时，Tc牛V2血清具有显著更多 的中和。此数据与图IOB中的抗原特异性ELI SA结果一致。然后，在相同的FRNT5q测定法中对 SAB-300(自牛#2244V2纯化的hlgG)和SAB-301 (自#2178和#2183的V2纯化的hlgG)测试中 和。数据证明了SAB-300和SAB-301产生相似的高水平的中和性抗体滴度(图11C)。与相等量 的阳性对照经抗原亲和纯化的家兔抗刺突抗体相比，这两种经过纯化的hlgG制备物在中和 1^1?-(：〇￥方面是高度有效的，这证明了348-300和348-301两者都能够在体外抑制]\^1?-(：〇￥ 感染。
[0164] 另外，SAB-300和SAB-301引起对Vero E6细胞中生长的MERS-CoV的显著中和，而非 特异性对照血清对Vero E6细胞的MERS-CoV感染没有显著影响（图12A)。自用SAB-300预处 理的MERS-Co V感染的细胞释放的感染性MERS-CoV水平低于测定法的检测限（158TCID5Q/ml; 图12A)，这指示了SAB-300是一种很强的中和性抗体。自用SAB-301预处理的MERS-CoV感染 的细胞释放的感染性MERS-CoV水平在除1:8000和1:16000以外的所有稀释度低于测定法的 检测限（158TCID 5Q/ml;图12A)，这提示了血清SAB-301是一种强中和性抗体，但是抑制性不 如SAB-300〇
[0165] SAB-300 和 SAB-301 不引起MERS-CoV 的抗体增强
[0166] 为了证明受到抗体结合的MERS-CoV病毒不容许病毒体进入正常情况下不被感染 的细胞中，测试Raji细胞(一种通常不被MERS-CoV感染的永生化人B细胞系）以查看抗MERS 抗体的存在是否能容许病毒RNA的转录和活病毒的释放。用与SAB-300和SAB-301预温育的 MERS-CoV感染Raji细胞（图12B)。在感染后48小时时对培养基实施病毒mRNA的RT-PCR和 TCID5q测定法以评估感染。TCID5q测定法未能检出自Ra j i细胞释放的MERS-CoV，这指示了它 们未被MERS-CoV感染。相反，此测定法发现了经相似处理的Vero E6细胞(其通常受MERS-CoV感染)在感染后48小时时产生高水平的病毒(数据未显示）。为了确定MERS-CoV RNA是否 在用与SAB-300和SAB-301预温育后的MERS-CoV感染的Raji细胞中检出，自经感染的细胞提 取RNA，并且用对MERS-CoV新转录RNA特异性的引物(前导引物)通过Taqman实时PCR进行分 析（图12B)。在仅用MERS-CoV感染的Raji细胞，用自疫苗接种前血浆纯化的非特异性阴性对 照hlgG感染的Raji细胞，或用经SAB-300或SAB-301预处理的MERS-CoV感染的细胞中没有显 著检出MERS-CoV新转录病毒RNA(前导引物组）。这些数据证明了SAB-300或SAB-301没有引 起MERS-Co V感染的抗体依赖性增强。
[0167] MERS-Co V复制的体内抑制
[0168] 我们在MERS-CoV的小鼠模型中测试了 SAB-300和SAB-301的功效。小鼠对于MERS-CoV是不允许的；然而，在用表达MERS-CoV受体人二肽基肽酶4(hDPP4)的腺病毒转导时，它 们变为允许的，并且复制病毒(Zhao,et al. ,Proc Natl Acad Sci U S A,2014.111(13): p. 4970-5)。为了测试Tc抗体的抗病毒活性，用75ul PBS中的2.5xl08PFU Ad5-hDPP4鼻内转 导BALB/c小鼠（6-8周）。在转导后5天时，用一剂100或500yg的对照hIgG、SAB-300或SAB-301 通过腹膜内注射处理小鼠。12小时后，用总体积50μ1中的MERS-C 〇V(1x105PFU)鼻内感染小 鼠。在感染的5天过程里不给予另外的抗体注射。在感染后1、3和5天时，对小鼠实施安乐死， 并且切出它们的肺。为了获得病毒滴度，使用手动匀浆器在PBS中将肺匀浆，通过离心澄清， 并且在Vero细胞上滴定（图13)。在感染后第1天和第3天在无处理组的肺和接受阴性对照人 I gG的组中发现约IXI O6PFlVmg肺组织的滴度，滴度在5dp i时下降至IXIO5。与hi gG对照注射 组相比，在感染后第1天发现用IOOyg或500yg SAB-300注射的小鼠分别具有病毒滴度的约 50倍或500倍降低（图13A)。到感染后第3天，IOOyg组的病毒滴度降低是约5000倍，而接受 500ug的小鼠中的滴度低于检测水平。在感染后5天时，这两个处理组中的病毒滴度低于检 测水平（图13A)。对SAB-301抗体发现了病毒滴度的相似降低，只是在感染后第1天与SAB-300处理的小鼠相比肺滴度适度更高（图13B)。到感染后第5天，所有SAB-301处理的小鼠具 有低于检测水平的病毒滴度（图13B)。这些数据证明了 SAB-300和SAB-301两者都能够在单 次防范性注射的情况中保护小鼠免于MERS-Co V感染。
[0169] 实施例4
[0170] 用MERS-CoV刺突蛋白（S)纳米颗粒免疫的动物中的抗体的BIAC0RE分析
[0171] 通过抗S亲和力(Biacore?)分析测试来自遵循图IOA和实施例3中显示的一系列免 疫用MERS-CoV S纳米颗粒疫苗免疫的两头Tc牛(#2178和2183)的两种抗体的亲合力。我们 测试了疫苗接种3 (v3)、疫苗接种4 (v4)和疫苗接种5 (v5)后这些动物的血清中的抗体的亲 合力。简言之，使用与CM5芯片胺偶联的蛋白A/G，将牛Tc血清IgG捕获至流动室。将0、20和 40nM的MERS刺突蛋白抗原注射至流动室达180秒，接着解离600秒。应用1:1拟合模型。以时 间的函数测量结合和解离速率，并且在传感图上进行绘图，并且自结合和解离速率计算解 离常数。图14和表1中显示了结果。
[0172] 表1
[0175] 表2显示了通过Ying et al. J. Virol .(2014)中披露的噬菌体展示生成的抗Sl单 抗的亲和力。这两张表中的数据的比较证明了经由噬菌体展示生成的MERS-CoV单抗的报告 Kd和抗体Kciff速率比Tc牛中诱导的多克隆抗S应答小几个数量级。
[0176] 表2
[0178] 其它实施方案
[0179] 本领域技术人员会认识到，或者仅仅使用常规实验就能够确定，本文中描述的具 体实施方案的许多等同方案。此类等同方案意图由本文中提供的权利要求书所涵盖。
[0180] 援引收录
[0181 ]本申请通过援引完整收录本文中公开的所有出版物或参考文献用于所有目的。 [0182]本申请通过援引完整收录下列各项用于所有目的：2007年6月27日提交的美国流 水号12/306,965，2007年12月20日提交的美国流水号61/015