确定药物配制剂的剂量，例如通过首先鉴定有效引发防范 性或治疗性免疫应答的剂量，例如通过测量病毒特异性免疫球蛋白的血清滴度或者通过测 量血清样品或尿液样品或粘膜分泌物中的抗体的抑制性比率进行。可以自动物研究确定所 述剂量。
[0103] 另外，熟练技术人员能实施人临床研究以确定用于人的优选有效剂量。此类临床 研究是本领域常规且公知的。要采用的精确剂量也会取决于施用路径。可以从自体外或动 物测试系统得到的剂量-响应曲线外推有效剂量。
[0104] 如本领域也公知的，可以通过使用免疫应答的非特异性刺激物(称为佐剂)来增强 特定组合物的免疫原性。已经在实验中使用佐剂来促进针对未知抗原的免疫力的普遍性增 加(例如美国专利No. 4,877,611)。免疫方案已经使用佐剂来刺激应答达多年之久，并且因 此，佐剂是本领域普通技术人员公知的。一些佐剂影响抗原被呈递的方式。例如，免疫应答 在蛋白质抗原通过明矾沉淀时是增加的。抗原的乳化也延长抗原呈递的持续时间。可以包 含佐剂。合适的佐剂包括那些记载于Vogel et al.，"A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients(第2版)"的，通过提及将其完整收入本文用于所有目的。
[0105] 其它例示性的佐剂包括完全弗氏佐剂(免疫应答的非特异性刺激物，其含有杀死 的结核分枝杆菌）、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。其它佐剂包含GMCSP、BCG、氢氧化铝、 MDP化合物，诸如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂质A、Montanide ISA 206、和单磷酰 脂质A(MPL)。也涵盖RIBI，其在2%鲨烯/Tween 80乳剂中含有自细菌提取的三种成分，即 MPL、海藻糖二霉菌酸酯（trehalose dimycolate) (TDM)和细胞壁骨架(CWS)。也可以使用 MF-59、Novasomes ⑨、MHC 抗原。
[0106] 在一个实施方案中，佐剂是具有约2至10个双层的少层脂质囊泡，以实质上球壳形 式排列，被水性层分开，围绕没有脂双层的大无定形中央腔。少层脂质囊泡可以以下述几种 方式起作用以刺激免疫应答，即作为非特异性刺激物，作为抗原的载体，作为别的佐剂的载 体，及其组合。在例如通过混合抗原与预先形成的囊泡，使得抗原对于囊泡而言仍然在胞外 来制备疫苗时，少层脂质囊泡作为非特异性免疫刺激物起作用。通过在囊泡的中央腔内包 囊抗原，囊泡既起免疫刺激物又起抗原的载体的作用。在另一个实施方案中，囊泡主要由非 磷脂囊泡制成。在其它实施方案中，囊泡是Novasomes。.NovaSOm.eS?是范围为约IOOnm至 约500nm的少层非脂质囊泡。它们包含Brij 72、胆固醇、油酸和藍稀。已经显示了Novasomes 是一种对于抗原有效的佐剂(参见美国专利5,629,021，6,387,373，和4,911，928，通过提及 将它们完整收入本文用于所有目的）。
[0107] 在一个方面中，以磷酸盐缓冲盐水中的约0.05至约0.1 %溶液使用，通过使用诸如 明矾等药剂来实现佐剂效果。或者，可以作为与以约0.25%溶液使用的糖合成聚合物 (Carbopd?)的混合物生成纳米颗粒。一些佐剂(例如自细菌获得的某些有机分子)作用 于宿主而不是抗原。一个例子是胞壁酰二肽(N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺 [MDP])，即一种细菌肽聚糖。在其它实施方案中，也可以使用血蓝蛋白和血红蛋白。尽管可 以采用其它软体动物和节肢动物血蓝蛋白和血红蛋白，但是来自钥孔虫戚的血蓝蛋白 (KLH)的使用在某些实施方案中是优选的。
[0108] 也可以使用各种多糖佐剂。例如，已经描述了在小鼠的抗体应答上使用各种肺炎 球菌多糖佐剂(Yin et al.，1989)。应当如指示的那样采用产生最佳响应，或者在其它情况 中不产生阻抑的剂量(Yin et al.，1989)。多糖的多胺种类是特别优选的，诸如壳多糖和壳 聚糖，包括脱乙酰化壳多糖。在另一个实施方案中，描述了胞壁酰二肽的亲脂性二糖-三肽 衍生物，其用于自磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油形成的人工脂质体。
[0109] 其它合适的佐剂包括两亲剂和表面活性剂，例如皂苷和衍生物诸如QS21 (Cambridge Biotech)。基于阜苷的佐剂包括那些含有单独的和组合的基质A和基质C的。例 示性的合适的基于皂苷的佐剂记载于美国已公布申请20120107353和20110081378,通过提 及将它们收入本文用于所有目的。
[0110] 也可以采用非离子型嵌段共聚物表面活性剂(Rabinovich et al.，1994)。寡核苷 酸是另一组有用的佐剂(Yamamoto et al.，1988) C3Quil A和香燕多糖是可以在某些实施方 案中使用的其它佐剂。
[0111 ]另一组佐剂是解毒的内毒素，诸如美国专利No. 4，866，034的精制解毒内毒素。这 些精制解毒内毒素在脊椎动物中有效产生佐剂应答。当然，可以组合解毒的内毒素与其它 佐剂以制备多佐剂配制剂。例如，特别涵盖解毒内毒素与海藻糖二霉菌酸酯的组合，如记载 于美国专利No. 4,435,386。也涵盖解毒内毒素与海藻糖二霉菌酸酯和内毒性糖脂的组合 (美国专利No. 4，505，899)，解毒内毒素与细胞壁骨架(CWS)或CWS和海藻糖二霉菌酸酯的组 合亦然，如记载于美国专利No · 4，436，727，4，436，728和4，505，900。仅CWS和海藻糖二霉菌 酸酯而无解毒内毒素的组合也会是有用的，如记载于美国专利No.4,520,019。
[0112] 本领域技术人员会知道可以与疫苗联合的不同种类的佐剂，包括烷基溶血磷脂 (ALP) ;BCG;和生物素(包括生物素化衍生物）等。特别涵盖使用的某些佐剂是来自Gram-细 胞的磷壁酸。这些包括脂磷壁酸(LTA)、核醣醇磷壁酸(RTA)和甘油磷壁酸(GTA)。也可以采 用其合成对应物的活性形式(Takada et al.，1995)。
[0113] 各种佐剂(甚至那些通常不在人中使用的佐剂)仍可以在其它脊椎动物中采用，其 中例如期望提高抗体或随后获得活化的T细胞。可能源自佐剂或细胞的毒性或其它不利作 用(例如使用未照射肿瘤细胞时可能发生的)在此类情况中是无关的。
[0114] 诱导免疫应答的另一种方法可以通过将纳米颗粒与"免疫刺激剂" 一起配制来实 现。这些是身体自身的提高免疫系统应答的化学信使(细胞因子）。免疫刺激剂包括但不限 于具有免疫刺激、免疫加强、和促炎性活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，诸如白 介素(例如11-1、几-2、11^-3、几-4、11^-12、11^-13) ;生长因子(例如粒细胞-巨噬细胞(61)-集 落刺激因子(CSF));和其它免疫刺激分子，诸如巨噬细胞炎性因子、Flt3配体、B7.1、B7.2、 等。免疫刺激性分子可以与纳米颗粒在同一配制剂中施用，或者可以分开施用。可以施用蛋 白质或编码蛋白质的表达载体以产生免疫刺激效应。
[0115] 明研^可以在具有下述下限的范围中存在:约0.2yg、约0.4yg、约0.6yg、约0.8yg、约 Iyg、约 2yg、约 3yg、约4yg、约 5yg、约 6yg、约 7yg、约 9yg、约IOyg、约15yg、约 20yg、约 25yg、约 30yg、约35yg、约40yg、约45yg、约50yg、约60yg、约70yg、约80yg、约90yg、约IOOyg、约11Oyg、 约120yg、约130yg、约140yg、或约150yg。明研^可以以具有下述上限的范围存在：约10yg、约 15yg、约 20yg、约 25yg、约 30yg、约 35yg、约40yg、约45yg、约 50yg、约 60yg、约 70yg、约 80yg、约 90yg、约 IOOyg、约 I IOyg、约 120yg、约 130yg、约 140yg、约 150yg、或约 200yg。在具体的方面 中，明矾的范围是约80yg至约120yg或约IOOyg至约120yg。
[0116] 基于皂苷的佐剂可以在具有下述下限的范围中存在:约0.2yg、约0.4yg、约0.6yg、 约 0.8yg、约Iyg、约 2yg、约 3yg、约 4yg、约 5yg、约 6yg、约 7yg、约 9yg、约IOyg、约15yg、约 20yg、 约25yg、或约30yg。基于皂苷的佐剂可以以具有下述上限的范围存在：约I Oyg、约15yg、约20 "区、约25以8、约3(^8、约35以8、约4(^8、约45以8、约5(^8、约6(^8、约7(^8、约8(^8、约9(^8、约 IOOyg、约11Oyg、约12〇yg、约13〇yg、约14〇yg、约15〇yg、或约200yg。在具体的方面中，基于阜 苷的佐剂的范围是约5yg至约2〇yg或约I yg至约I Oyg。
[0117] 这些剂量是在小鼠中特别合适的，并且可以基于典型的20g小鼠重量对约60Kg人 重量进行调节以供人使用。
[0118] 刺激抗MERS CoV免疫应答的方法
[0119] 纳米颗粒可用于制备免疫原性组合物以刺激赋予针对MERS CoV病毒的免疫力或 实质性免疫力的免疫应答。粘膜和细胞免疫两者可以促成针对感染和疾病的免疫力。在上 呼吸道中局部分泌的抗体是抵抗天然感染的主要因子。分泌性免疫球蛋白A(SlgA)参与上 呼吸道的保护，而血清IgG参与下呼吸道的保护。由感染诱导的免疫应答针对相同的病毒或 抗原性相似的病毒株的再感染提供保护。也可以对其他受试者施用在用本文中公开的纳米 颗粒免疫后在宿主中生成的抗体，从而在受试者中提供被动施用。
[0120] 本公开内容提供了生成高亲和力抗MERS-CoV抗体的方法。通过用本文中公开的纳 米颗粒免疫生成的高亲和力抗体是如下生成的，即对动物施用包含MERS-CoV纳米颗粒的免 疫原性组合物，自动物收集血清和/或血浆，并自血浆和/或血浆纯化抗体。在一个实施方案 中，动物是人。在一个实施方案中，动物是牛或马。在另一个实施方案中，牛或马动物是转基 因的。在又一个实施方案中，转基因牛或马动物生成人抗体。在一个实施方案中，方法进一 步包括施用佐剂或免疫刺激性化合物。在又一个实施方案中，对人受试者施用经过纯化的 高亲和力抗体。在一个实施方案中，人受试者处于MERS-CoV感染的风险。
[0121] 纳米颗粒能在对脊椎动物(例如人)施用时在所述脊椎动物中诱导实质性免疫力。 实质性免疫力源自针对纳米颗粒的免疫应答，其在所述脊椎动物中针对病毒感染提供保护 或改善感染或至少减轻病毒感染的症状。在一些情况中，若所述脊椎动物受到感染，则所述 感染会是无症状的。响应可以不是完全保护性响应。在此情况中，若所述脊椎动物受到MERS CoV病毒感染，则脊椎动物会经历与未免疫脊椎动物相比减轻的症状或更短的症状持续时 间。
[0122] 在一个实施方案中，本公开内容提供了在受试者中诱导针对病毒感染或其至少一 种症状的实质性免疫力的方法，其包括施用至少一个有效剂量的纳米颗粒。在另一个实施 方案中，所述诱导实质性免疫力缩短MERS症状的持续时间。在另一个实施方案中，在受试者 中诱导针对病毒感染或其至少一种症状的实质性免疫力的方法包括施用至少一个有效剂 量的纳米颗粒。在另一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述 哺乳动物是人。在又一个实施方案中，与佐剂或免疫刺激剂一起配制所述纳米颗粒。
[0123] 在实施方案中，组合物中存在的每种抗原的剂量可以是约0.2yg、约0.4yg、约0.6μ g、约0.8yg、约 Iyg、约2yg、约3yg、约4yg、约 5yg、约6yg、约 7yg、约9yg、约 IOyg、约 15yg、约20μ g、约 25yg、约 30yg、约 35yg、约 40yg、约 45yg、约 50yg、约 60yg、约 70yg、约80yg、约 90yg、约 100 yg、约11Oyg、约12〇yg、约13〇yg、约14〇yg、或约15〇yg。例如，可以依照MERS刺突蛋白含量测 量量。例如，Iyg纳米颗粒是约lyg MERS刺突蛋白。
[0124] 通过用纳米颗粒免疫生成的抗体
[0125] 本文中公开的纳米颗粒在宿主中诱导高亲和力抗MERS-CoV抗体的生成。这些高亲 和力抗MERS-CoV抗体展现比经由常规方法(例如噬菌体展示;参见Zhang et al. 2014)生成 的抗MERS-Co V抗体要高的亲和力。
[0126] 术语"亲和力"指表位和抗体的抗原结合位点之间的相互作用的强度。例如，可以 使用下述方程确定亲和力：
[0128]其中Ka =亲和常数；[Ab]=抗体上未被占据的结合位点的摩尔浓度；[Ag]=抗原 上未被占据的结合位点的摩尔浓度;而[Ab-Ag]=抗体-抗原复合物的摩尔浓度。Ka描述了 在达到平衡的点时存在多少抗体-抗原复合物。这发生所花费的时间取决于扩散速率，并且 对于每种抗体是相似的。然而，高亲和力抗体会比低亲和力抗体在更短的时段中结合更大 量的抗原。所生成的抗体的Ka(亲和常数）可以有所变化，并且范围介于约IO 5Hior1至约 IO1Vor1或更多之间。Ka可以受到包括pH、温度、和缓冲液组成在内的因素影响。
[0129] 所生成的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可以精确测量单克隆抗体的亲和 力，因为它们是同质的，并且对于单一表位是选择性的。多克隆抗体是异质的，并且会含有 识别几种表位的不同亲和力的抗体的混合物，因此仅能测量平均亲和力。
[0130] 可以使用本领域中通常采用的任何手段来测量抗体亲和力，包括但不限于使用生 物传感器，诸如表面等离振子共振(例如Biacore)。共振单位与可溶性配体对固定化受体 (或可溶性抗体对固定化抗原）的结合程度成比例。测定不同已知浓度的受体(抗体)和配体 (蛋白质抗原)平衡时的结合量容许计算平衡常数(Ka，Kd)，和解离和结合速率(krff，!^)。
[0131] 例如，Kd(平衡解离常数)是抗体与其抗原之间的WJkcin比率。Kd和亲和力是反比 关系的。Kd值越低(抗体浓度越低），抗体的亲和力越高。大多数抗体具有低微摩尔（10- 6)至 纳摩尔（HT7至HT9)范围中的Kd值。一般认为高亲和力抗体在低纳摩尔范围（10- 9)中，很高 亲和力抗体在皮摩尔（HT12)范围或更低(例如HT13至HT 14范围）中。在一个实施方案中，通 过用本文中公开的纳米颗粒免疫生成的抗体具有范围为约1〇_6至约1〇_ 15、约1〇_7至约1〇_15、 约HT8至约HT 15、约HT9至约HT15、约10-1()至约HT 15、约HT11至约HT15、约HT12至约HT 15、约 10_13至约10_14、约10_13至约10_ 15、和约10_14至约10_15的KD。在一个优选的实施方案中，通过 用本文中公开的纳米颗粒免疫生成的抗体具有范围为约HT 1t3至约HT14的Kd。
[0132] 通过用本文中公开的纳米颗粒免疫生成的抗体具有低解离速率(koff)，指示它们 紧密结合抗原。在一个实施方案中，通过用本文中公开的纳米颗粒免疫生成的抗体具有范 围为约 10-3IT1 至约 10-13IT1、约 10-5IT1 至约 10-13IT1、约 10-6IT1 至约 10-13IT1、约 10-7IT1 至约 10- 13M'约10-8IT1 至约10-13M'约10-9IT1 至约10-13M'约10-iqIT1 至约10-13M'约10-11IT1 至约10 _13M'或约KT12IT1至约