3)
[0093]
[0094] 试验例3阿魏酸磷脂复合物的体外酪氨酸酶抑制试验
[0095] 下面通过体外酪氨酸酶抑制试验实验证明本发明的阿魏酸磷脂复合物能够保持 物质的酪氨酸酶活性，从而通过该途径发挥美白功效。
[0096]阿魏酸及其磷脂复合物体外酪氨酸酶抑制实验，溶解过程中加入增溶剂HPS，阿魏 酸磷脂复合物中所含阿魏酸与单体阿魏酸量相同。实验步骤如下所述：
[0097] 1)按照下表3,分别配制C1、C1、T1以及T2四组试剂，酪氨酸酶为后加入；
[0098] 2)C2管配好摇匀后，在37°C水浴锅中水浴加热lOmin，波长475nm下调零。
[0099] 3)C1管溶液配好摇匀，37°C水浴lOmin后，加酪氨酸酶lml，继续水浴25分钟，测定 C1吸光度值。
[0100] 4)按(2) (3)同样方法，以T2调零测定T1吸光度值。
[0101 ] 5)计算样品对酪氨酸酶的活性抑制率T( % )。公式:T( % ) = (Cl-Tl )/Cl X 100%
[0102] 表3试剂配比表 「filial
LU1U4J 汪：Cl和T1加人lmL醋虱酸鰣，鰣沽为lOOU/mL。
[0105] 结果如下表4所示。
[0106] 表4阿魏酸、阿魏酸磷脂复合物对酪氨酸酶的抑制率(n = 3)
[0107]
[0108] 试验例4阿魏酸磷脂复合物对细胞黑色素的抑制试验
[0109] 下面通过细胞黑色素抑制试验证明本发明的阿魏酸磷脂复合物能够减少黑素瘤 细胞黑色素的生成。
[0110] 阿魏酸、阿魏酸磷脂复合物对黑色素瘤细胞中黑色素抑制实验(溶解过程中加入 增溶剂HPS。阿魏酸磷脂复合物中所含阿魏酸与单体阿魏酸量相同），实验步骤如下所述：
[0111] 1)根据计数所得的细胞浓度，将细胞进行稀释，加入6孔板中，使每孔细胞的数量 约10 5个。向6孔板中加入lml的培养液，后加入lml的细胞悬浮液。37°C，5 %⑶2条件下孵育 24小时。
[0112] 2)种板培养24h后，取出细胞培养板，换新培养液1800ul，后加入200ul不同浓度的 样品，每个样品做三个平行。37°C，5%C02条件下孵育72小时。
[0113] 3)弃去细胞上清液，PBS清洗2次，加入0.5ml的roS和0.5ml的胰蛋白酶，37°C，5 % C02条件下消化3~5分钟，拍打使细胞脱落，收集细胞液于2ml的EP管内，用lml的PBS再次清 洗6孔板，将其与第一次收集的细胞液合并。4°C的条件下，5000转-min，离心5分钟。弃去上 清液。取上述细胞加入lml的PBS后再次离心，弃去上清液，即收集得到小鼠黑素瘤细胞。注 意:在最后一步弃去上清液收集细胞的过程中，可使用移液枪吸取EP管内残存的PBS，避免 细胞浓度过低影响后续实验。
[0114] 4)向收集得到的小鼠黑素瘤细胞中加入50ul的IN Na0H，60°C震荡2h，使细胞充分 破裂，释放出黑色素及其它胞内蛋白质。用移液枪取50ul细胞裂解液转移到96孔板内， 405nm下测定吸光值。50ul IN NaOH做空白对照。
[0115] 5)总蛋白的测定
[0116] 取已测定过黑素含量的96孔板内的溶液10ul转移到新的96孔板内，使用考马斯亮 蓝试剂盒测定总蛋白含量（制作蛋白质含量标准曲线）在595nm条件下测定其吸光值。10ul IN NaOH做空白对照。
[0117] 黑色素合成抑制率=[1-A1/C1*C0/A0]*100%
[0118] A1:样品黑素含量吸光值
[0119] A0:溶剂空白对照吸光值
[0120] C1:样品蛋白质含量
[0121] C0:溶剂空白对照蛋白质含量
[0122] 结果如下表5所示。
[0123] 表5阿魏酸、阿魏酸磷脂复合物对黑色素生成的抑制率(n = 3)
[0124]
[0125] 试验例5阿魏酸磷脂复合物的体外抑制透明质酸酶试验
[0126] 下面通过体外抑制透明质酸酶试验证明本发明的阿魏酸磷脂复合物有抑制透明 质酸酶的活性，具有潜在的抗炎功效。
[0127] 阿魏酸、阿魏酸磷脂复合物体外对透明质酸酶活性的抑制实验，样品配制过程中， 加入增溶剂HPS，其中阿魏酸磷脂复合物中所含阿魏酸与单体阿魏酸量相同。实验步骤如下 所述：
[0128] 采用透明质酸酶体外抑制实验Elson-Morgan法进行。取0 · lmL 0 · 25mmol/LCaCl2 溶液和0.5mL透明质酸酶液37°C保温培养20min;加入样品液0.5mL，继续37°C保温培养 20min;加入0.5mL透明质酸钠液37°C保温30min，常温放置5min;加入0. lmLO. 4mol/LNaOH溶 液和0.5mL乙酰丙酮溶液，置于沸水浴中加热15min后立即用冰水进行冷却5min;加入埃尔 利希试剂1. OmL并用3. OmL无水乙醇进行稀释，放置20min显色，用分光光度计582nm测定其 吸光度值。
[0129] 结果如下表6所示。
[0130] 表6阿魏酸、阿魏酸磷脂复合物对透明质酸酶活性的抑制率(n = 3)
[0131]
[0132] 试验例6阿魏酸磷脂复合物的渗透性实验
[0133] 下面通过渗透性实验来证明本发明的阿魏酸磷脂复合物具有很好的渗透性能，能 够很好的渗透至皮肤，而且具有缓释阿魏酸，从而达到长时间的作用的功效。
[0134] 离体鼠皮的制备，取180~220g Wistar大鼠，罕c?兼用，处死，于腹部脱毛，剪取脱 毛后皮肤，除尽皮下组织及脂肪，用生理盐水反复洗涤至无白色混浊物，浸于生理盐水中， 于4°C冰箱中保存，1周内使用。实验前检查鼠皮的完整性，不得有破损。
[0135] 供给液的配制，称取过量的阿魏酸和阿魏酸磷脂复合物，配制成供给液，其中两种 供给液所含的阿魏酸的量是相同的。
[0136] 渗透扩散装置及经皮渗透试验透皮扩散仪的上池为筒状供给池，下室为圆锥状接 收池，其间夹皮肤并固定。经皮渗透面积为3.14cm 2,以潜水式电磁搅拌器维持接收池的动 态环境。于接收池中精密加入6.6mL生理盐水，置37°C恒温水浴中，开动电磁搅拌器并保持 恒速搅拌(200r · mirT1)，取供给液lmL于供给池中，于0.5、1、2、4、8、12h、24h时分别精密吸 取接受液2mL(补加等量生理盐水），用0.45μπι微孔滤膜过滤，紫外分光度法测定吸光值，计 算接受液浓度。并求算累积渗透量Qn(yg · cnf2)，结果如下表7所示。
[0137] 表7阿魏酸、阿魏酸磷脂复合物经皮渗透量随时间变化的量
[0138]
[0
[0140] 由表7可知，阿魏酸磷脂复合物经皮渗透量明显大于阿魏酸，且在涂抹供给液阿魏 酸磷脂复合物24h后，其所携带的阿魏酸仍然能够透过皮肤，这说明阿魏酸磷脂复合物能够 增大阿魏酸的经皮吸收量，同时可以延长作用时间。
[0141] 试验例7含有阿魏酸磷脂复合物的美白乳液的美白效果评价
[0142] 1材料和仪器
[0143] 样品:实施例16制备得到的含有阿魏酸磷脂复合物的美白乳液
[0144] 1.2测试仪器
[0145] 皮肤黑色素和血红素测试仪(MexameterMX18)，德国CK公司生产；多功能皮肤测试 仪及色度测试探头MPA 9,德国CK公司生产。
[0146] 2实验方法：
[0147] 参考文献进行:吴金昊，刘琦，邓影妹等，美白祛斑化妆品功效评价方法研究[C]， 第十届中国化妆品学术研讨会论文集，2014:276-280。
[0148] 2.1志愿者
[0149] 受试者共计30人，25岁-45岁女性。志愿者排除条件符合《化妆品接触性皮炎诊断 标准及处理原则》纳入、排除标准。
[0150]