一种利用诱导脂质体融合来制备双载或多载脂质体的技术的制作方法
【专利摘要】本发明属于医药领域，具体涉及一种利用诱导脂质体融合来制备双载或多载脂质体的技术。本发明利用诱导脂质体融合来制备双载或多载的脂质体。而且本发明为制备双载或多载的脂质体提供了可行的解决方案，且所得的脂质体依然能够通过实现两种或多种药物组织和细胞水平的共定位，在体内外实现两种或多种药物的协同作用，为临床安全有效的联合用药提供了一种新的选择。
【专利说明】
一种利用诱导脂质体融合来制备双载或多载脂质体的技术
技术领域
[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及采用诱导脂质体融合的方法来制备同时载带双药 或多药的脂质体。
【背景技术】
[0002] 在疾病的治疗中采用两种或两种以上的治疗药物是一个常见的现象，特别是对肿 瘤的治疗，往往不可能采用一种药物而治愈。如果两药或多药之间有协同治疗效果，特别是 协同机制需要共同定位于同一靶细胞或靶组织，那么将两药或多药共载于同一纳米载体内 (简称共载载体)则很有可能较单纯的联合给药更有助于提高药效。这主要是因为共载载体 可实现将药物按照更接近于最佳配比的，并且近乎完全同时的递送到靶细胞或靶组织。
[0003] 脂质体是药剂学领域中最重要的药物递送载体之一，是目前业界研究最广泛的纳 米载体之一，其作为肿瘤靶向载体的研究特别值得关注。目前已有单载的脂质体产品上市 且在临床广泛的应用如阿霉素脂质体。也有双载的脂质体如CPX351(阿糖胞苷/柔红霉素） 已经结束II期临床研究，效果良好，即将进入III期临床研究。因此可见，双载或多载的脂质 体是具有潜在应用前景的新型递药系统。
[0004] 目前，为实现两种药物的共载，常用的方法是采用两步的"离子梯度法"（即remote loading)，为形成脂质双层膜内外的离子梯度，常常需要引入离子试剂（即ionophores)或 金属离子如Mn2+，Cu2+，C 〇2+等等，这些方法往往步骤繁琐，且处方组成复杂。在包载过程 中，往往由于不同的药物同时竞争磷脂分子的结合位点，而导致药物分子的包封率降低。除 此以外，对于不能用离子梯度法进行载带的药物则会对该方法提出挑战。
[0005] 脂质双层膜融合是自然界在细胞相关的活动中已有的现象，如精子对卵子的融 合，病毒通过对宿主细胞膜的融合等等都是利用细胞膜的融合实现的。随着人造生物膜的 出现，该现象又被用于细胞膜表面修饰，制备脂质包裹的材料等等方面。脂质双层膜融合一 般而言不会自行发生，但在诱导剂如酸、碱、热、离子或特定的蛋白等存在下就可顺利进行。 一般而言，该利用诱导脂质体融合制备双载或多载脂质体的方法主要思路是，先制备各自 单载的脂质体，再将两种脂质体混合，在一定诱导条件下，促使单载的脂质体相互融合而形 成双载甚至多载的脂质体。本发明首次将脂质双层膜融合现象应用到制备双载或多载脂质 体的领域，为制备该类脂质体的制备提供新思路和新方法。并且该方法不仅可用于两种或 两种以上的药物，也可以适用于顺磁性MRI对比剂和药物的组合，或者其他具有治疗意义的 化合物组合等等。
【发明内容】
[0006] 本发明所解决的第一个技术问题是分别制备载带单药的脂质体。对此首先要考虑 后续所可能要选用的诱导融合的条件，因为不同的诱导融合条件所需要的磷脂材料并不相 同。
[0007] 对于采用以静电相互作用作为诱导融合条件的，应先制备两种带相反电荷的脂质 体。即分别制备带负电荷的脂质体和带正电荷的脂质体。
[0008] 对于采用阳离子如氢离子(H+)、钙离子(Ca2+)和镁离子(Mg2+)和诱导融合的，应先 制备带负电荷的脂质体或是pH敏感的脂质体。
[0009] 对于采用阴离子如柠檬酸、EDTA、磷酸根、硫酸根、醋酸等来诱导融合的，应先制备 带正电荷的脂质体。
[0010] 对于采用聚阳离子聚合物如聚赖氨酸、聚组氨酸等等来诱导融合的，应先制备带 负电荷的脂质体。
[0011] 对于采用聚阴离子聚合物如聚谷氨酸、聚天冬氨酸等等来诱导融合的，应先制备 带正电荷的脂质体。
[0012] 也可采用一些特殊的融合诱导剂来诱导脂质体融合，这样的诱导剂包括聚乙二 醇、磷脂酶、α-生育酚、聚胺、凝集素、质粒DNA、RNA、siRNA及某些多肽和蛋白（如膜联蛋白 VII、网格蛋白等等）。
[0013] 也可采用一些特殊的理化条件，如温度、渗透压等等。
[0014] 带负电荷的脂质体可以采用的带负电荷的脂质材料来制备。其中可采用带负电荷 的磷脂。磷脂由一个头部和两个尾部组成。头部由磷酸与水溶性分子如胆碱、丝氨酸酯化形 成，可溶于水，向下延伸的两条平行尾部是与油分子相似的脂肪酸链，每条链有10-24个碳 原子和0-6个双键，不溶于水。通常由于头部带有负电荷的基团而成为负电荷的脂质，包括 各种来源的磷脂酰胆碱(卵磷脂）、氢化卵磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、磷脂酰糖 酐、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血磷脂、二鲸蜡磷酸酯(DCP)等。还 可能包含荷负电的脂质体材料如，胆固醇、PEG化磷脂等等。还可能包含荷负电的糖脂如单 半乳糖-和二乳糖-甘油二酯(MDGD，DGDG)。其中胆固醇也可以采用带负电荷基团的胆固醇 衍生物来代替，如胆固醇琥珀酸酯(CHEMS)从而得到荷负电的脂质体。
[0015] 带正电荷的脂质体可以采用的阳离子脂质材料包括DC-CH0L(CAS :166023-21-8)、 硬质酰胺等带正电荷的脂质衍生物。也包括带正电荷的磷脂材料如，〇(^4?(0六5:132172-61-3)、D0TAP(CAS:144189-73-1)、DMTAP(CAS:197974-74-6)、16:0TAP(139984-36-4)、DDAB (CAS:3700-67-2)、D0BAQ(CAS:1360461-69-30)、D0DAP(CAS:127512-29-2)、16:0TAP(CAS: 72719-84-7)、18 : 0TAP(220609-41-6)、12 : 0EPC(EPC为乙酰化磷脂酰胆碱的简称，CAS: 474945-22-7)、14:0EPC(CAS:186492-53-5)、14:1EPC(CAS:1246304-44-8)、16:0EPC(CAS: 328250-18-6)、18:0EPC(CAS:328268-13-9)、18:1EPC(CAS:474945-24-9)、16:0-18:1EPC (CAS:328250-19-7)、D0TMA(CAS:104872-42-6)、MVL5(CAS:464926-03-2)、D0SPA(CAS: 168479-02-5)、DMRIE(CAS:153312-64-2)、DLinDMA(CAS:871258-12-7)、DMPE(CAS:998-07- 2) 、18:1co9TAP(CAS:104162-48-3)、D0DAP(CAS:127512-29-2)、D0BAQ(CAS:1360461-69- 3) 、14:0DAP(CAS:72719-84-7)、16:0DAP(CAS:96326-74-8)、18:0DAP(CAS:121315-93-3)等 等。
[0016] 上述合成阳离子磷脂命名原则是：
[0017] 1，均是按照磷酸酯的种类进行分类如三甲酰胺丙烷缩写为TAP;
[0018] 2,两条脂肪酸链一致的：如:二油酰三甲酰胺丙烷，缩写为D0TAP;
[0019] 3,脂肪酸的表示方法为:脂肪酸(Cm:Zcox)，rn表示碳原子个数，Z表示不饱和双键的 数量，ω χ表示双键位置。
[0020] ⑴饱和脂肪酸 013-(012)11-〇)0!1，111 = 11+2,2 = 0。如肉豆蔻酸((：14:0)，棕榈酸((：16: 〇)，硬脂酸(C18:0)
[0021] ⑵不饱和脂肪酸CH3-(CH2)x-CH = CH-(CH2)y-⑶0Η，Ζ为非0常数。如油酸（C18:l ω9)，芥酸(C22:lco 9)
[0022] pH敏感的脂质体分为PE-脂质体和PC-脂质体，也包括PS构成的脂质体。这些脂质 体低pH融合作用有时需要辅助介质如多聚组氨酸、植物血凝素等等。常用的pH敏感脂质成 分包括:DPSG、D0SG、油酸(0A)、PHC或胆固醇衍生物CHEMS、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)等等。 部分的pH敏感脂质体的组成成分如下表：
[0023]表1 pH敏感脂质体组成成分
[0024]
[0025] -般应根据药物的性质选用合适的制备方法，常用的制备方法主要分为如下几 类:一是以干燥的脂膜、脂类粉末为基础的制备方法，包括薄膜分散法、有机溶剂冻干再水 化法、喷雾干燥法、逆向蒸发法、流化床包衣法、单相溶液冻干法、冷冻干燥法、以交叉过滤 法去除表面活性剂的方法制备脂质体、挤出法等等。二是以乳剂为基础的方法。包括反相蒸 发法、二次乳化法等等。三是以混合胶团为基础的脂质体制备技术，其中包括磷脂可以和某 些表面活性剂如胆盐形成混合胶团，当采用交叉流透析等手段逐步除去胆盐后，剩余的磷 脂就会聚集形成脂质体。形成的脂质体的大小和表面活性剂的种类、磷脂/表面活性剂的质 量比、混合胶团的浓度，以及透析的条件都有关系。如去污剂分散法。四是以乙醇/磷脂/水 三相混合物为基础的脂质体制备方法，如注入法、交叉流注射技术、Alza公司的技术等等； 其中Alza公司的技术主要包括调整乙醇、磷脂、水3种组分的比例，使其落到脂质体区，形成 不均匀的脂质体，之后再使用挤出、均质等手段将其处理成小颗粒的脂质体。五是主动载药 制备方法，如离子梯度法、pH梯度法、硫酸铵梯度法、醋酸钙梯度法等等。主动载药技术与被 动载药技术的差异就在于脂质体的形成和药物的装载不在同一个步骤中完成。其制备工 艺通常包括如下步骤:①制备空白脂质体;②通过透析、柱层析等手段创造特定的脂质体膜 内外梯度;③在合适的条件下，将已形成梯度的空白脂质体和待包封的药物孵育，以便完成 药物的装载。六是机械分散法，如超声波分散法、手摇法等等。七是钙融合法。该法利用由酸 性磷脂组成的小囊泡，在钙存在条件下发生聚集，相继融合。八是气泡方法。该方法是为了 避免有机溶剂、去污剂、高切应力对所包裹物质组分的破坏，1994年由Tal sma等报道了一种 惰性气体通入脂质悬液，通过产生气泡制备脂质体的方法。
[0026] 本发明所解决的第二个技术问题是寻找恰当的诱导两种或几种单载脂质体发生 融合的条件。并以所得双载或多载脂质体的融合率、两种或几种药物的包封率、融合中的泄 漏率、融合后脂质体的理化性质等综合指标为筛选因素对融合条件进行优化。
[0027] 在脂质体融合进行之前，首先分别各自单载的脂质体的多种制剂学指标进行全面 详细地考察，这些因素主要包括药物包封率、脂质体中药物浓度、脂质体中总脂质含量、药 物载药量、脂质体粒径及分布等等。上述指标也作为筛选融合条件的参考因素。
[0028] 定量测定无机磷酸盐的方法包括Fiske和Subbarow分析法、HPLC法、31P-NMR光谱 法、薄层色谱分析等等。其中F i s ke和Subbar ow分析法同时具备简单、准确和高度重现性的 特点，使之成为测定磷脂储备液或LUV制剂中磷脂浓度的基本方法。该分析方法的原理是： 高氯酸能使磷释放，并将其氧化成为磷酸根离子，所形成的有色复合物可用分光光度法定 量。HPLC采用紫外吸收检测器，分析方法简单，使用范围广泛，并且可同时将大豆磷脂中的 PC、PE、PI、PA和LPC定量。对于31P-NMR光谱法，采用CS-EDTA处理后的卵磷脂溶液，图谱谱线 变窄，信号彼此分离。常规分析中，磷脂试样的量为15_20mg，最低检测量为0.05%。此方法 与脂肪酸的分布无关，而仅与头部磷所处的化学环境相关，试样中除磷以外的杂质均不会 影响结果。用TLC法分离磷脂的各组分，优点在于设备简单、操作方便，分离条件易掌握，可 采用显色剂如二氧化锰、茚三酮和罗丹明等对磷脂进行显色，且结果直观。
[0029] 对于带相反电荷的脂质体进行融合时，一般以静电相互作用和热诱导相结合的诱 导融合条件进行。两种或几种单载脂质体融合时所采用的比例的计算，用脂质含量的比例 为标准进行。两种或几种单载脂质体中药物的混合比例，应该根据实际配伍药物最佳疗效 所需的比例进行。融合后脂质体的粒径、zeta电位、包封率等理化性质均会发生变化。诱导 所需的融合温度、融合时间及融合的介质等条件均以得到最佳的融合脂质体为标准进行筛 选。
[0030] 在脂质体融合的前后，我们可采用一些分析方法，来监测脂质体膜成分的混合或 内水相内容物的合并。因为脂质体融合的方式分为部分融合和完全融合。众所周知，脂质体 是由单层或多层的磷脂双分子层构成。融合时若融合地很彻底，即脂质双层膜均发生了融 合，则脂质体的内水相混合起来，这种融合即为完全融合。融合时如果仅有外层的脂质发生 融合，内层脂质并未融合，且内水相并没有完全混合的方式，称为部分融合。故为区分并全 面地评估脂质体融合的方式，应采取多种监测方式。主要是既要采用易于插膜的荧光探针， 又要采用水溶性的荧光探针。几种分析方法可以互为补充来对脂质体融合的过程进行全面 的评价。
[0031] 常用的脂质体融合的荧光分析法包括铽/二吡啶羧酸分析法，氨基萘三磺酸/对-二甲苯二溴化吡啶分析法，NBD/罗丹明共振能量转移法等等。对于铽/二吡啶羧酸分析法， 铽(Tb)和二吡啶羧酸(DPA)相互作用生成荧光络合物[Tb(DPA) 3]3'通过DPA向Tb递送内能 而产生荧光，荧光强度可增加4个数量级。反应物最初包封在不同的磷脂囊泡群内，膜融合 使荧光增强。介质中含有低浓度的EDTA可阻止释放到外部介质中的内容物发生上述作用。 对于氨基萘三磺酸/对-二甲苯二溴化吡啶(ANTS/DPX)分析法，DPA在pH5左右时的质子化作 用会干扰Tb/DPA复合物的形成，在研究低pH-诱导的脂质体融合时，要求建立新的不受低pH 显著影响的分析方法。ANTS/DPX分析法是基于ANTS荧光被DPX碰撞淬灭的原理，二者最初包 封在不同的脂质体群中。融合使ANTS与DPX在两种脂质体内发生相互作用，ANTS荧光淬灭。 若脂质体内容物释放到介质内而被稀释，则实质上不会发生荧光淬灭，因为这一过程需要 高浓度的DPX。当某一荧光团（即能量供体）的发射光谱与另一荧光团（即能量受体）的激发 光谱重叠时，供体吸收光子产生的激发态能量非辐射地转移给受体，此过程称为共振能量 转移(FRET)。许多荧光团对都曾用来监测膜融合过程中脂质的混合。这种方法基于如下原 理:膜融合导致直至混合，使供体/受体对从"标记"脂质体转移到"非标记"脂质体，从而被 稀释。此时能量转移效率低。通常用低于总脂质量lmol%的低浓度探针进行FRET测定，以减 小膜扰动的程度。一个常被使用的FRET对，N-(7-硝基苄基-2-氧杂-1，3-重氮-4-基)磷脂酰 乙醇胺(N-NBD-PE)和N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)磷脂酰乙醇胺(N-Rh-PE)，这些探针在膜之 间没有任何显著的交换，且荧光团连接再PE的头基上，不会引起双分子层排列的明显扰动。 使用FRET对时，关键是要确定在预期不发生融合，或脂质体聚集但不融合的条件下，不发生 脂质混合。某些条件下，在没有内容物混合时也可观察到脂质混合，即发生了上述的"部分 融合"，即相互作用的脂质体外层的单分子层相互混合，而内水相没有发生任何直接的接 触。
【具体实施方式】
[0032]以下通过对本发明【具体实施方式】的描述说明但不限制本发明。
[0033] 一、用诱导正-负电荷脂质体融合的方法制备共载盐酸米托蒽醌(ΜΤ0)和泼尼松龙 磷酸钠(PLP)的脂质体
[0034]米托蒽醌(ΜΤ0)为细胞周期非特异性化疗药物，活性高，抗癌谱广。1987年FDA批准 ΜΤ0上市用于治疗急性非淋巴性白血病，后又将多发性硬化症、前列腺癌、原发性肝癌、晚期 乳腺癌、恶性淋巴癌和前列腺癌列为其适应症。ΜΤ0作用机制在于抑制拓扑异构酶II的活 性、干扰RNA的合成、嵌入DNA和形成交叉键链并诱导、促进细胞凋亡。目前我国上市的制剂 有盐酸米托蒽醌注射液。游离ΜΤ0的使用常伴随恶心、呕吐、脱发、皮疹、严重骨髓抑制和心 脏毒性等不良反应，以致其临床应用受到限制。因此，生物可降解、毒副作用低、治疗效果好 的新型ΜΤ0给药系统一直是研究的热点。目前ΜΤ0新型给药系统主要包括载ΜΤ0脂质体及壳 聚糖修饰的载ΜΤ0脂质体等。这些ΜΤ0给药系统均可在一定程度上改变ΜΤ0的体内分布以减 小游离ΜΤ0的毒副作用。
[0035]糖皮质激素(glucocorticoids，GCs)是由肾上腺皮质分泌的类固醇激素，且早就 被发现能够抑制胸腺细胞、淋巴细胞和白血病细胞的增殖，并能诱导这些细胞凋亡，因此， 泼尼松、泼尼松龙及地塞米松等GCs类药物被临床广泛用于抗炎，治疗自身免疫性疾病、淋 巴细胞性白血病和淋巴瘤。近年来越来越多的研究表明，GCs还能抑制上皮细胞及多种上皮 来源的肿瘤细胞的增殖，其在肿瘤治疗过程中发挥着日益重要作用，包括作为化疗方案的 药物之一以直接抗肿瘤、治疗肿瘤的合并症及缓解肿瘤治疗相关不良反应等。相关研究表 明，GCs抗癌作用机理主要包括：1、抑制bFGF、G-CSF及IL-1等促血管生成因子的合成，2、抑 制氧自由基作用，3、抑制水肿渗出蛋白和肿瘤相关炎症介质的分泌，如TAMs，4、破坏肿瘤生 长基质的形成，5、降低肿瘤细胞糖代谢率，抑制肿瘤细胞生成。为了增强GCs药物的抗肿瘤 效果，目前采用的制剂学手段仍然是将GCs包载于脂质体中，其中以载泼尼松龙(PLP)脂质 体研究最多。临床上有将ΜΤ0和PLP联合用于前列腺癌、乳腺癌等肿瘤的研究报道，特别是在 前列腺癌的治疗中疗效确切。
[0036] 采用单因素对PLP-MT0-HM1:15进行制备工艺优化，以期达到：1、具有优良的脂质 体制剂学性质，2、获得较为缓慢的释放速率，3、增强体内外抗癌效果，4、减小游离ΜΤ0的体 内毒性。以Flk-GFP转基因绿色荧光斑马鱼为动物模型考查LHD7的在体新生血管抑制作用。 以bFGFR高表达的小鼠黑色素瘤细胞株B16F10和bFGFR低表达的小鼠结肠癌细胞株CT26为 模型，考察PLP-MT0-HM1:15的选择性细胞活力抑制作用和细胞摄取促进作用。建立CT26和 B16F10皮下瘤模型，考查PLP-MT0-HM1:15的体内抑瘤效果和安全性，并采用免疫组化技术 对其抑瘤机制进行系统研究。
[0037] 肿瘤在没有血管提供氧气和营养的情况下生长不会超过2mm3,因此，肿瘤新生血 管作为维持肿瘤细胞快速增殖的功能单元必须为肿瘤组织提供充足的营养和氧气，以促进 肿瘤的生长、浸润和转移。肿瘤新生血管的形成是一个复杂的多因子和多信号传导过程的 结果，目前研究认为血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍 生生长因子(PDGF)是最为关键的几种促血管生长因子。近年来以肿瘤新生血管为靶标的治 疗策略已发展成为当今肿瘤领域研究的重要方向之一。
[0038] 肝素是一种重要的抗凝药物，近来发现肝素还具有抗肿瘤、抗炎症及抗病毒等生 物学作用，作用机制主要在于特异性抑制VEGF、bFGF、PDGF-i3及P-选择素等促血管生成因 子，以实现抑制肿瘤细胞增殖、粘附、侵袭、迀移和转移及抗新生血管生成的双重作用。临床 实验表明，低分子量肝素 (Low Molecular Weight Heparin，LMWH)联合化疗药物治疗中晚 期恶性肿瘤可提高肿瘤患者的生存率，然而LMWH抗凝作用导致的出血现象限制了其在抗肿 瘤方面的进一步应用。为了降低LMWH的抗凝作用并增强其抗肿瘤活性，目前采用的方式主 要是设计LMWH衍生物。Kyeongsoon Park等设计了LMWH-去氧胆酸自组装胶束(LHD)并用其 包载阿霉素，结果表明LHD包载的阿霉素 (DHN20)可显著增强LHD和游离阿霉素的体内抗癌 效果。脂质体可借助肿瘤血管特有的EPR效应以增加纳米颗粒在肿瘤血管处的滞留。普通 脂质体存在EPR效应不明显、血浆清除率高及特异性较差等缺点；而表面修饰的主动靶向脂 质体则既可以高度靶向于特定的肿瘤细胞从而增加疗效，又可以减少肿瘤药物对正常细胞 的损害。本项目利用LMWH胆酸类衍生物LHD修饰的脂质体来提高脂质体对肿瘤血管的靶向 性，同时起到抑制肿瘤新生血管的作用。
[0039] (1)载ΜΤ0长循环阳离子脂质体的制备
[0040]按HSPC: D0TAP: Choi: DSPE-mPEG2000 = 9: 25:12:12(W/W)称取一定量膜材置于梨 形瓶中，溶于适量无水乙醇，40°C水浴下减压旋蒸lh除掉有机溶剂，得到空白脂膜。加入 300mmol · L-l(pH 4.0)的硫酸铵溶液，65°C旋转水化60min，探头超声5min，室温透析24h (透析介质为，0.1M，pH 7.4)，得到空白脂质体。采用硫酸铵梯度法，以ΜΤ0:脂材=3:50 (W/W)加入ΜΤ0储备液，65°C水浴保温30min，并通过sephadexG-25柱去除游离药物，得到载 ΜΤ0的阳离子脂质体(ΜΤ0-ΥΜ)。对于载ΜΤ0的长循环阴离子脂质体(MT0-CM)，用HSPC代替 D0TAP，其余操作与ΜΤ0-ΥΜ相同。
[0041 ] ΜΤ0-ΥΜ在300mM硫酸铵(4.0)的包封率达96 %以上，这是由于ΜΤ0与D0X类似，只有 当脂质体有内外水相pH差值>3时才能利用这种pH梯度作为驱动力把ΜΤ0完全包载到脂质体 内水相层;另外，相关文献报道，300mM硫酸铵(pH 4.0)作为ΜΤ0-ΥΜ的水化介质，既利用了pH 梯度的这一驱动力，还利用了内水相硫酸铵能与ΜΤ0形成ΜΤ0-硫酸铵难溶性复合物这一驱 动力，从而使ΜΤ0的主动包载变得更加容易。
[0042] (2)载PLP长循环阴离子脂质体的制备
[0043] 按HSPC:Chol :DSPE-mPEG2000 = 3:1:2:1(W/W)称取一定量膜材置于梨形瓶中，溶 于适量无水乙醇，40°C水浴下减压旋蒸lh除掉有机溶剂，得到空白脂膜。以PLP:脂材= 1:10 (W/W)加入PLP超纯水溶液，65 °C旋转水化60min，探头超声5min，并通过sephadexG-25柱去 除游离药物，得到载PLP的长循环阴离子脂质体(PLP-CM)。
[0044] (3)共载PLP和ΜΤ0融合脂质体的制备
[0045] 取（1)中所得的ΜΤ0-ΥΜ与（2)中所得的PLP-CM，按药物的药物比例3 : 5 (W/W，ΜΤ0: PLP)，将两种脂质体混合均匀，加入40mM L-1柠檬酸，诱导融合2h，即得共载ΜΤ0和PLP融合 脂质体(PLP-MT0-YM)。
[0046]对于制备ΜΤ0和PLP共载脂质体，研究之初考虑采用最简单的共载方法，即将两种 药物溶液直接混合后去水化脂质膜，结果发现两种药物混合溶液中出现沉淀，其原因可能 是形成了 MT0-PLP难溶性复合物，故提示该法不可行。也尝试先制备单载PLP的脂质体，再用 梯度法载ΜΤ0,但是在制备梯度的透析过程中PLP就已经大量泄漏，提示该法亦不可行。 [0047] (4) LHD7修饰的共载ΜΤ0和PLP长循环脂质体的制备
[0048] 取上述所制得的PLP-MT0-YM，按LHD7:Lipids = l: 15(W/W)将LHD7和PLP-MT0-YM混 合均匀，25°C水浴孵育30min，即得LHD7修饰的共载ΜΤ0和PLP的长循环脂质体(PLP-MT0-ΗΜ1:15)〇
[0049] 对于LHD7修饰的载ΜΤ0的长循环脂质体(MT0-HM1:15)，将LHD7和ΜΤ0-ΥΜ混合均匀， 其余操作与PLP-MT0-HM1:15相同。
[0050] PLP-MT0-HM1:15的制备则采用简单、成熟的后插入法将两亲性靶向材料LHD7插入 到PLP-MT0-YM的磷脂双分子结构中，此方法既可使靶头部分(LMWH)全部暴露在脂质体外水 相，又不会引起药物的泄露。
[0051] (5)两种脂质体的融合率
[0052] 为考察两种脂质体的融合程度，用铽/吡啶-2,6_二羧酸钠(TbC13/DPA)分析法进 行研究。融合率的计算方法是，两种脂质体融合后的荧光强度值与用表面活性剂完全消解 两种脂质体的混合液后荧光值的比值。以表面活性剂（10%胆酸钠)消解脂质体后产生的荧 光强度(Fmax)为100%参比，考察不同条件下脂质体融合率。[Tb(DPA)3]3-的荧光测定条件 为Em:277nm;Ex:545nm;Em Slix:5nm;Ex Slix:5nm〇
[0053] 首先筛选了几种融合诱导剂对脂质体融合率的影响，包括柠檬酸、EDTA和磷酸，结 果表明脂质融合诱导作用大小为柠檬酸〉EDTA>磷酸。接着对柠檬酸的浓度和作用时间做出 进一步筛选，图1表明，不同浓度柠檬酸作用下，〇~2h内脂质体融合率随时间延长逐渐增 加，2~3h内融合率基本不发生变化;20~40mM柠檬酸范围内，在40mM时诱导融合的效率更 高，进一步增加柠檬酸浓度并不能显著增加融合率，因此最佳脂质融合诱导条件为:40mM柠 檬酸为融合诱导剂，诱导融合2h。
[0054] (5)融合前后脂质体的理化性质
[0055] 按照前述方法制备两种脂质体及融合脂质体，并测定各处方脂质体的粒径、PDI及 Zeta电位。如表1-1所示最佳制备工艺下所得脂质体粒径在100~125nm，PDI均〈0.2,粒径分 布均勾，Zeta电位从-18mV到36mV不等。结果表明，融合后脂质体的粒径并不会明显增加，反 而roi较融合前有所改善。
[0056] 表1-1脂质体的粒径和电位，.x _±.s:，n = 3
[0057]
[0058] (6)脂质体的包封率
[0059] 分别测定ΜΤ0和PLP的包封率，测定结果如表1-2所示。最佳制备工艺下制备所得脂 质体的包封率均大于95%，其中PLP-MT0-YM的ΜΤ0包封率为95.1% ;PLP包封率分别为 95.7%〇
[0060] 表1_2月旨质体的包封率，.X ±s，n = 3
[0062] (7)脂质体融合的电镜照片
[0063]取脂质体胶体溶液适量，超纯水稀释至脂质浓度约为2mg · mL'2%磷钨酸溶液负 染4min，滴至覆盖碳膜的铜网上，室温挥干，置透射电镜下观察。TEM图2可见，脂质体均呈球 形，外观圆整，大小均勾，粒径均在l〇〇nm左右，与粒度测定仪测定粒径结果基本一致。
[0064] (8)PLP-MT0-YM 的体外释放
[0065]相关文献报道，正常血浆为中性环境，肿瘤组织为偏酸环境，肿瘤细胞胞浆及溶酶 体为酸性环境，因此，为模拟脂质体在正常血浆、肿瘤组织及肿瘤细胞内的释放情况，本实 验选择三种不同pH值的磷酸盐缓冲液(pH 5.0、6.8和7.4)作为PLP-MT0-HM1:15的体外释放 介质。
[0066]首先考察了药物在释放介质中的稳定性。称取一定量的PLP和MT0三份，分别用上 述三种释放介质配制成MT0浓度约为10yg · mL-1的供试品溶液，置于37°C、100r · min-1恒温 振荡器中，测定他、811、2411、4811、9611、12011及14411时的样品浓度并观察色谱图的峰型。以011 样品浓度(Co)作为100%，按下列公式计算每个时间点样品浓度(Cn)的变化率以考查药物在 释放介质中的稳定性。如表1-3所示，MT0和PLP在释放介质中放置144h稳定。
[0067] 变化率（％)=Cn/C〇X100%
[0068] 表1-3PLP和ΜΤ0在释放介质中的变化率，T 土 s，n = 3
[0071] 随后进了脂质体中药物的释放。精密量取PLP-MT0-HM1:15胶体溶液0.5mL三份，分 别封装于纤维素透析袋后立即放于盛有20mL上述不同PBS的具塞锥形瓶中，置于37°C、100r min- 1水平摇床进行释放。分别于卟、211、411、611、811、1211、2411、9611，12011及14411从锥形瓶取样 1. OOmL，同时补加等温roS 1. OOmL。按本节上述的方法测定样品中PLP和ΜΤ0的浓度，计算 PLP-MT0-HM1:15的累积释放率。
[0072] 累积释放率（％ )=释放到介质中的总药量/加入透析袋中的总药量X 100%。
[0073] 图4A可以看出PBS 7.4中，PLP-CM在24h时累积释放(52.18±1.84)%，72h基本释 放完全;ΜΤ0-ΥΜ在72h时累积释放(53.56± 2.47) %，144h基本释放完全，PLP-CM药物释放速 度大于]^1'0-￥]\^1^-01+]?1'0-腿1:15中？1^的释放行为与？1^-01-致，]?1'0的释放行为与]\〇'0-YM-致;PLP-MT0-HM1:15 中PLP在24h时累积释放（38 · 35 ± 2 · 95) %，120h时PLP基本释放完 全，其释放速度小于PLP-CM; PLP-MT0-HM1:15中ΜΤ0在72h时累积释放（71 · 11 ± 4 · 60) %， 120h时ΜΤ0基本释放完全，其释放速度大于ΜΤ0-ΥΜ。图4B可以看出，PLP-MT0-HM1:15中PLP及 ΜΤ0的释放速率均随着释放介质pH值下降而依次增大;且当pH为6.8时，两者在72h均基本释 放完全，pH下降至5.0时，48h均基本释放完全。
[0074] 药物在到达肿瘤细胞前后会暴露在不同pH值环境下，因此本文为模拟脂质体在体 内的释放情况，分别选用类似正常血浆、肿瘤组织周围、肿瘤细胞内的三种不同pH值的PBS 作为体外释放介质。释放结果显示，各处方脂质体在TOS 7.4中的半衰期均大于20h，表明脂 质体均有一定长循环作用;PLP-MT0-HM1:15的释放速率随释放介质的pH减小而增大，表明 其还具有一定pH敏感性。
[0075]由于ΜΤ0和PLP自身理化性质及载药原理不同，结果显示PLP释放较快，而ΜΤ0释放 缓慢，故两种药物体外释放速率本身有较大差异;PLP-CM+MT0-HM1:15物理相加组两种药物 的释放行为与药物单载组一致，表明两种脂质体简单混合后互不影响各自药物的释放行 为;将MT0和PLP共载于PLP-MT0-HM1:15后，两种药物的释放行为与药物单载组相比发生变 化，速率差明显减小，其原因可能是共载脂质体内部MT0-PLP复合物的形成改变了两种药物 的释放行为。
[0076] (9)PLP-MT0_HM1:15 的溶血实验
[0077] 心脏取血方式，取新鲜兔血10mL，置干净烧杯中，用玻璃棒顺同一方向轻轻搅拌 2min除去纤维蛋白。加入约10倍体积的生理盐水，轻轻摇勾，3000r mirT1离心15min，弃去上 清液，底部红细胞用生理盐水按照同样的方法洗涤6次，直到上清液为无色透明状，将所得 的红细胞用生理盐水配成2%的混悬液，待用。
[0078] 取洁净的试管7支，进行编号，依次排列在试管架上，1号管为阳性对照管，2号管为 阴性对照管，3~7号管为供试品管。按表1-4依次加入2%红细胞悬液、生理盐水、蒸馏水或 脂质浓度约40mg mL-1的空白PLP-MT0-HM1:15胶体溶液，混匀后，立即置37±0.5°C的恒温箱 中温育3h，并记录各支试管中溶血情况。溶血反应结束后，3000r mirT1离心15min，用紫外分 光光度计测定各管上清液在54 lnm处的吸光度值，按下列公式计算受试品的溶血率。如表1 -4所示，PLP-MT0-HM1:15的溶血率均小于5%，符合中国药典的要求，进一步验证PLP-MT0-HM1:15不会引起明显的溶血现象。
[0079] 溶血率（％ )=(样品吸光度-阴性对照吸光度)/(阳性对照吸光度-阴性对照吸光 度）X100%〇
[0080] 相关研究报道，阳离子脂质体有一定的溶血性，提示阳离子脂质体存在一定程度 的安全性问题；但试验浓度下PLP-MT0-HM1:15溶血率均小于5%，没有发生明显的溶血现 象，符合中国药典的要求;且小鼠尾静脉注射脂质浓度约80mg ml/VrO-YM试验表明小鼠生 理活动正常，体内未发生溶血现象。综上所述PLP-MT0-HM1:15毒性在可接受范围内，可用于 后续的体内实验。
[0081 ] 表1-4溶血性实验分组及结果，T 土s,n = 3
[0082]
[0083] (lO)PLP-MTO-HMl: 15的存储稳定性
[0084] 脂质体为磷脂双分子层结构，磷脂可能由于存储条件不当被氧化从而造成药物的 泄漏，并影响制剂的质量。本实验以粒径、PDI及包封率为评价指标，考察PLP-MT0-HM1:15存 储于4 °C的稳定性。图5可看出PLP-MT0-HM1:15共载体4 °C放置28d，其粒径、PDI、包封率均无 明显变化。
[0085]脂质体的磷脂易被氧化且属于热不稳定性的胶体溶液体系，因此需考察PLP-MT0-HM1:15的4°C存储稳定性，以为后续研究打下坚实基础。实验结果表明，PLP-MT0-HM1:15置 于4°C放置28d后，其粒径、PDI及包封率均未发生显著变化，这可能与脂质体表面亲水链段 PEG和LMWH共同增加了脂质体外部的空间位阻有关。
[0086] (ll)PLP-MTO-HMl: 15细胞活力抑制作用
[0087] 取对数生长期的B16F10(CT26)细胞，以适当浓度接种于96孔板中，每孔100μΙ^37 °C、5 % C〇2孵育24h后，分别加入系列浓度的MT0-CM、ΜΤ0-ΥΜ、ΜΤ0-ΗΜ: 15、PLP-CM+MT0-HM1: 15、PLP-MT0-HM1:15、MT0-HM1:15空白脂质（blank-HMl: 15)、MT〇-YM空白脂质（blank-YM)及 PLP-CM空白脂质(blank-CM) 100yL，并空白培养基作为阴性对照孔。继续孵育24h后，每孔加 入20μΙ^度为5mg · mL-1的MTT，振荡后继续孵育4h。吸弃上清，加入DMSO 200yL，37°C恒温震 摇lOmin，酶联免疫测定仪测定A57〇,计算细胞生长抑制率和IC 50:
[0088] 活力抑制率（％ ) = (1-实验孔/阴性对照孔）X 100%。
[0089] 如图6所示，实验浓度下blank-CM及blank-YM组对CT26及B16F10存活率均在92% 以上，表明脂质空白材料对以上细胞无明显毒性;而blank-HMl: 15在浓度为10mg · ml/1及 20mg · mL-1 时，CT26存活率分别为（84.34±4.52)%和（76.56±3.07)%，显著高于B16F10的 (77.68 ± 3.38) %和(51.63 ± 4.61) %。图7所示，各处方脂质体对CT26及B16F10两种细胞的 活力抑制作用均呈浓度依耐性，且同浓度下抑制作用大小均依次为11'0-01僅1'0-￥1〈11'0-HM: 15~PLP-CM+MT0-HM1:15〈PLP-MT0-HM1:15。表 1-5可以看出，两种细胞株中，PLP-MT0-HM1:15 的 IC5Q 显著小于 ΜΤ0-ΥΜ，且显著小于 PLP-CM+MT0-HM1:15;而 PLP-CM+MT0-HM1:15 和 MT0-HM1:15 的 IC5Q 无显著性差异。同时还可看出，MT0-YM、MT0-HM1:15 及 PLP-CM+MT0-HM1:15 三者对CT26的活力抑制无显著性差异；而MT0-HM1:15和PLP-CM+MT0-HM1:15对B16F10的活 力抑制显著大于ΜΤ0-ΥΜ对其的活力抑制(Ρ〈0·05)。
[0090] 表卜5作用24h时各处方的IC5〇，！T±s，n = 3
[0091]
[0092] 注：@，与MT0-CM相比有显著性差异，P〈0.05 ;*，与ΜΤ0-ΥΜ相比有显著性差异，P〈 0.05; &，与PLP-CM+MT0-HM1:15相比有显著性差异，P〈0.05。
[0093] (12)细胞活力抑制的时间依耐性
[0094] 取对数生长期的B16F10(CT26)细胞，以适当浓度接种于96孔板中，每孔100μΙ^37 °C、5%C〇2孵育24h，分别加入MT〇-CM、MT〇-YM、MT〇-HM: 15、PLP-CM+MT0-HM1:15及PLP-MT0-HM1:15胶体溶液100yL，使ΜΤ0终浓度为0.5yg · ml/1，并设空白培养基为阴性对照孔，继续孵 育24h，48h或72h后，按上述（11)的后续操作进行。图8可知，各处方脂质体对CT26及B16F10 两种细胞的生长抑制作用均呈时间依耐性，且在各个时间点MT0-CM和ΜΤ0-ΥΜ对CT26的抑制 率大于对 B16F10 的抑制率;MT0-HM1:15、PLP-CM+MT0-HM1:15 和 PLP-MT0-HM1:15 对 CT26 的抑 制率小于对B16F10的抑制率，该结果与（11)中的结果一致，证实了 LHD7修饰脂质体对 B16F10细胞的选择性抑制。
[0095] (13) LHD7修饰的共载ΜΤ0和PLP脂质体的体内抑瘤
[0096] 本部分内容建立CT26和B16F10两种皮下瘤模型以研究PLP-MT0-HM1:15的体内抑 瘤效果，并对其进行体内安全性初步研究；同时采用免疫组化技术从分子水平探究PLP-MT0-HM1:15的体内抑瘤作用机制。
[0097]挑选肿瘤体积为 100mm3的小鼠，随机分为NS(A)、FM(B)、MT〇-CM(C)、MT〇-YM(D)、 MT0-HM1:60(E)、MT0-HM1:30(F)、MT0-HM1:15(G)、PLP-MT〇-YM(H)、PLP-CM+MT0-HM1:15(1) 及卩1^-]?1'〇-腿1 :15(1)，每组8只小鼠。给药组按[0 611^.1^-1和（或汗1^1011^.1^-1单次 尾静脉给药，NS组注射等体积的生理盐水，同时记为第1天。测量肿瘤的长、短径绘制肿瘤生 长曲线；称量小鼠体重绘制体重变化曲线。待NS组平均瘤体积达4000mm 3左右，脱颈椎处死 各组小鼠，完整剥离肿瘤组织，称重计算抑瘤率。
[0098]肿瘤体积(mm3)= 0 · 5 X 长径(mm) X 短径(mm)2。
[0099] 抑瘤率（％ )=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重X 100%。 [0100] 如图9所示，NS组小鼠肿瘤体积增长迅速，11天时瘤体达(4483.44±462.42)mm3; 给药组瘤体增长则有不同程度的减缓，11天时MT0-YM、MT0-HM1:60、MT0-HM1:15及PLP-MT0-HM1:15 组仅分别为（1877 · 73±205.47)mm3、（ 1203 · 86± 131.97)mm3、（ 1098 · 76± 127.09)mm3 和（724.38±63.98)mm3。给药组的抑瘤作用 MT0-YM>MT0-HM1:30~PLP-CM+MT0-HM1:15>MT0-HM1:60>MT0-YM>MT0-CM>FM 组。经统计分 析，ΜΤ0-ΥΜ组的抑瘤率显著大于MT0-CM组(P〈0.05);除FM、MT〇-CM组外，其余治疗组的抑瘤 率均显著大于ΜΤ0-ΥΜ组(P〈0 · 05) ;MT0-HM1:15组的抑瘤率显著大于MT0-HM1:60(P〈0 · 05) 组；PLP-MT0-HM1:15组的抑瘤率显著大于PLP-CM+MT0-HM1:15和MT0-HM1:15组（Ρ〈0·05); PLP-CM+MT0-HM1:15、PLP-MT0-YM、MT0-HM1:30 和 ΜΤ0-ΗΜ1:15 四组之间的抑瘤率无显著性差 异。
[0101] CT26皮下瘤模型中，MT0-HM1:15组的抑瘤率大于MT0-HM1: 30组并显著大于ΜΤ0-HM1:60和ΜΤ0-ΥΜ组的抑瘤率，说明脂质表面的LHD7密度越大，其抑瘤效果越明显，这可能与 LHD7的亲水LMWH端可以增加脂质在体内的循环时间以增强新生血管EPR效应，从而增强抑 瘤效果相关;PLP-CM+MT0-HM1:15组的抑瘤率与MT0-HM1:15组相当，却显著小于PLP-MT0-HM1:15组的抑瘤率，说明PLP-CM与MT0-HM1:15的物理混合对ΜΤ0的抑瘤效果增加不明显，但 当PLP与ΜΤ0共载于脂质体后，PLP可显著增加肿瘤细胞对ΜΤ0的敏感性。
[0102] (14)小鼠 B16F10皮下瘤的抑制
[0103]挑选肿瘤体积为 100mm3的小鼠，随机分为NS(A)、FM(B)、PLP-CM(C)、MT〇-YM(D)、 MTO-HM1:15 (E)、PLP-CM+MTO-HM1:15 (F)及PLP-MT0-HM1:15 (G)组，每组8 只小鼠。如图 10所 示，NS和PLP组小鼠肿瘤体积增长迅速，9天时瘤体分别达（3600.65 ± 383.70 )mm3和 (3565.56± 397.42)mm3;给药组瘤体增长则有不同程度的减缓，9天时MT0-YM、MT0-HM1:15 及 PLP-MTO-HM1:15组仅分别为（1531 · 34± 188 · 56)mm3、（ 1088 · 32 ± 126 · 45)mm3和（349 · 81 土 47 · 79)mm3。给药组的抑瘤作用依次为 PLP-MTO-HM1:15>PLP-CM+MT0-HM1:15~MT0-HM1:15> MT〇-YM>FM>PLP-CM。经统计分析，除PLP-CM组外，其余治疗组的抑瘤率均显著大于FM组(P〈 0.05) ;MT0-HM1:15、PLP-CM+MT0-HM1:15和PLP-MTO-HM1:15组的抑瘤率均显著大于MTO-YM 组(P〈0.05) ;PLP-MT0-HM1:15组的抑瘤率显著大于PLP-CM+MTO-HM1:15和MTO-HM1:15组(P〈 0.05) ;PLP-CM+MT0-HM1:15和MTO-HM1:15两组间抑瘤率无显著性差异。
[0104] 在B16F10皮下瘤模型中，PLP-CM组的肿瘤体积和质量基本与NS组一致，该结果证 实PLP-CM的单独使用对B16F10肿瘤基本无抑制作用;MT0-HM1:15组的抑瘤率显著大于ΜΤ0-YM组的抑瘤率，这可能与LHD7可主动靶向高表达bFGFR肿瘤细胞并抑制肿瘤新生血管生长 相关;MT0-HM1:15和PLP-CM+MT0-HM1:15组间抑瘤率无差异，且均显著小于PLP-MT0-HM1:15 组的抑瘤率，该结果进一步证实将共载PLP和ΜΤ0于脂质体的联合给药方式可显著增强PLP 和ΜΤ0的抑瘤效果。以上结果共同表明，PLP与ΜΤ0的联合给药方案可以实现两者的协同抗癌 效果。本项目制备的PLP-MT0-HM1:15将PLP和ΜΤ0共载于靶向脂质体中，既可以避免两种药 物混合使用时体内分布及药动学方面的差异，又可以提高药物对肿瘤细胞的选择性，同时 减少耐药现象的发生，从而更好地发挥两种药物的协同治疗目的。
[0105] (15)PLP-MT0-HM1:15体内抑瘤作用机制研究
[0106] ①肿瘤新生血管形成抑制作用
[0107] 肿瘤组织冰冻切片后进行微血管CD31免疫荧光染色，以检测肿瘤血管形成抑制作 用。具体操作如下：1)迅速取出肿瘤组织，0CT包埋剂浸没，冰冻切片机切片，厚约δμπι。〗）切 片组织室温放置30min，4°C丙酮固定SOmiruO.lM PBS洗涤两次，每次δπ?η。〗）吸尽液体，37 °C下，正常山羊血清封闭组织60min。4)去除封闭液，滴加约50yL⑶31-抗4°C湿盒内孵育 过夜。5)去除一抗，0.1M PBS洗涤两次，每次δπ?η』)吸尽液体，加入50yL AF 488标记的二 抗避光孵育60min。7)去除二抗，0.1M PBS洗涤两次，每次5min。8)吸尽液体，滴一滴抗荧光 淬灭封片液于载玻片上，封片。9)显微镜下镜检。抗原定位处显线状或点状绿色荧光为阳性 结果。
[0108] 图11A所示，CT26模型中，NS组肿瘤组织微血管较给药组密、粗且长，给药组微血管 密度PLP-MT0-HM1:15〈PLP-CM+MT0-HM1:15〈MT0-HM1:15〈PLP-MT0-YM~MT0-HM1: 30〈MT0-腿1:60〈11'0-￥1〈11'0-01，且经1^07修饰后脂质体组微血管密度显著低于未经1^07修饰后脂 质体组(P〈0.05)。在图11B所示B16F10模型中，各组肿瘤组织微血管密度PLP-MT0-HM1:15〈 PLP-CM+MT0-HM1:15〈MT0-HM1:15〈MT0-YM〈FM〈PLP-CM~NS，且含 MT0-HM1:15组微血管密度 显著低于ΜΥ0-ΥΜ和FM组(P〈0.05)。
[0109] ⑶31免疫组化结果显示，在CT26和B16F10两种肿瘤模型中，经LHD7修饰后脂质体 的肿瘤微血管密度均显著低于未经LHD7修饰脂质体组，这可能与LHD7强大的肿瘤新生血管 生成抑制作用相关。而本文单用PLP-CM对肿瘤和微血管生长抑制作用却不明显，这可能与 本文单次给药、给药剂量小。
[0110] ②肿瘤细胞凋亡促进作用
[0111] 肿瘤组织冰冻切片米用TUNEL(IdT_mediated dpTP Hick-互nd labeling)法检测 细胞凋亡。具体操作如下：1)迅速取出肿瘤组织，OCT包埋剂浸没，冰冻切片机切片，厚约5μ m〇
[0112] 2)切片组织室温放置30min，4%多聚甲醛固定20miru0.1M PBS洗涤两次，每次 5min〇
[0113] 3)加入含0.1%Triton X-100的PBS，冰浴孵育2min，PBS洗涤两次，每次Sminj)加 入20yg/mL蛋白酶K(不含DNAse和RNase)，37°C作用30min，PBS洗涤两次，每次5miru5)制备 TUNEL反应混合液，处理组用2yL TdT+48yl FITC标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μ L FITC的dUTP液，阳性对照组先加入100yL DNAse，25°C反应lOmin，后面步骤同处理组。6) 加入50yL TUNEL反应混合液，37°C，暗湿盒中避光孵育60min JBS洗涤两次，每次δπ?η。？)抗 焚光淬灭封片液封片后焚光显微镜下观察。
[0114] 图12A所示，CT26模型中，NS组肿瘤组织基本无凋亡，给药组调亡程度？!^，?-HM1:15>PLP-CM+MT0-HM1:15>MT〇-HMl: 15^MT〇-HMl: 30>PLP-MT〇-YM^MT〇-HMl: 60>MT〇-YM >MT〇-CM。图12Β所示B16F10模型中，NS及PLP-CM组肿瘤组织基本无凋亡，其余组调亡程度 PLP-MT0-HM1:15>PLP-CM+MT0-HM1:15>MT〇-HMl:15>MT〇-YM>FM〇
[0115] TUNEL染色结果显示，除PLP-CM组和NS组外，其余组均有不同程度的绿色荧光阳性 结果，这可能与ΜΤ0对肿瘤细胞凋亡促进作用相关。MT0-HM1:15凋亡促进作用大于ΜΤ0-ΥΜ凋 亡促进作用，说明LHD7可增强ΜΤ0的细胞凋亡诱导作用。PLP-CM+MT0-HM1:15和PLP-MT0-HM1:15凋亡促进作用大于MT0-HM1:15,说明PLP可增加肿瘤细胞对ΜΤ0的敏感性。
[0116] (16)PLP-MT0-HM1:15体内安全性初步研究
[0117] 体内药效学实验的同时每天称量小鼠体重，绘制各组小鼠体重变化曲线；药效学 实验终点时眼眶取检测各组小鼠血生化指标。实验条件下，两种肿瘤模型的NS组及脂质体 组小鼠体重均无明显下降或稍有增大，而FM组小鼠体重随时间的延长而减轻，且从实验第 4天起明显少于其他组(P〈0.05)。
[0118] 与ΜΤ0-样，ΜΤ0由于严重的骨髓抑制和心脏毒性，其临床运用受到严重限制。脂质 体是目前降低药物毒性、改善药物释放行为、增强药物稳定性最为常见的制剂学手段之一， 被认为是较为理想的药物载体。国内外均有研究表明，将ΜΤ0、ΜΤ0等抗癌药物制备成脂质体 既可以改变药物在体内的分布和循环时间又可以提高疗效并降低游离药物的毒性。
[0119] FM组小鼠体重明显下降，脂质体组小鼠体重均无明显下降，表明游离ΜΤ0有较大的 毒副作用，而脂质体作为优良的药物载体可明显减少有游离ΜΤ0的毒副作用。
[0120]二、用诱导正-负电荷脂质体融合的方法制备共载盐酸阿霉素(D0X)和泼尼松龙磷 酸钠(PLP)的脂质体
[0121]阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗 瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀 灭作用。主要适用于急性白血病，对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病均有效，一般作为 第二线药物，即在首选药物耐药时可考虑应用此药。恶性淋巴瘤，可作为交替使用的首选药 物。乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌等其他各种癌症都有一定疗效，多与其他抗癌药联合使用。 主要的毒性反应有，白细胞和血小板减少，约60 %~80%的病人可发生；100 %的病人有不 同程度的毛发脱落，停药后可以恢复生长;心脏毒性，表现为心律失常，ST-T改变，多出现在 停药后的1~6个月，及早应用维生素 B6和辅酶Q10可减低其对心脏的毒性;恶心、食欲减退； 药物溢出血管外可引起组织溃疡及坏死。另外，用药后尿液可出现红色。
[0122] (1)载D0X长循环阳离子脂质体的制备
[0123] 按HSPC: DOTAP: Choi: DSPE-mPEG2000 = 9: 25:12:12(W/W)称取一定量膜材置于梨 形瓶中，溶于适量无水乙醇，40°C水浴下减压旋蒸lh除掉有机溶剂，得到空白脂膜。加入 300mmol · L-l(pH 4.0)的硫酸铵溶液，65°C旋转水化60min，探头超声5min，室温透析24h (透析介质为，0.1M，pH 7.4)，得到空白脂质体。采用硫酸铵梯度法，以D0X:脂材=3:50 (W/W)加入ΜΤ0储备液，65°C水浴保温30min，并通过sephadexG-25柱去除游离药物，得到载 D0X的阳离子脂质体（D0X-YM)。对于载D0X的长循环阴离子脂质体（D0X-CM)，用HSPC代替 D0TAP，其余操作与D0X-YM相同。
[0124] (2)载PLP长循环阴离子脂质体的制备
[0125] 按HSPC: Choi:DSPE-mPEG2000 = 3:1: 2:1 (W/W)称取一定量膜材置于梨形瓶中，溶 于适量无水乙醇，40°C水浴下减压旋蒸lh除掉有机溶剂，得到空白脂膜。以PLP:脂材= 1:10 (W/W)加入PLP超纯水溶液，65 °C旋转水化60min，探头超声5min，并通过sephadexG-25柱去 除游离药物，得到载PLP的长循环阴离子脂质体(PLP-CM)。
[0126] (3)共载D0X和PLP融合脂质体的制备
[0127] 取（1)中所得的D0X-YM与（2)中所得的PLP-CM，按药物的药物比例3 : 5 (W/W，D0X: PLP)，将两种脂质体混合均匀，加入40mM L-1柠檬酸，诱导融合2h，即得共载D0X和PLP融合 脂质体(PLP-D0X-YM)。
[0128] 对于制备D0X和PLP共载脂质体，研究之初考虑采用最简单的共载方法，即将两种 药物溶液直接混合后去水化脂质膜，结果发现两种药物混合溶液中出现沉淀，其原因可能 是形成了D0X-PLP难溶性复合物，故提示该法不可行。也尝试先制备单载PLP的脂质体，再用 梯度法载D0X，但是在制备梯度的透析过程中PLP就已经大量泄漏，提示该法亦不可行。
[0129] (4)LHD7修饰的共载ΜΤ0和PLP长循环脂质体的制备
[0130] 取上述所制得的PLP-D0X-YM，按LHD7:Lipids = l: 15(W/W)将LHD7和PLP-D0X-YM混 合均匀，25°C水浴孵育30min，即得LHD7修饰的共载D0X和PLP的长循环脂质体（PLP-D0X-ΗΜ1:15)〇
[0131] 对于LHD7修饰的载D0X的长循环脂质体(D0X-HM1:15)，将LHD7和D0X-YM混合均匀， 其余操作与PLP-D0X-HM1:15相同。
[0132] PLP-D0X-HM1:15的制备则采用简单、成熟的后插入法将两亲性靶向材料LHD7插入 到PLP-D0X-YM的磷脂双分子结构中，此方法既可使靶头部分(LMWH)全部暴露在脂质体外水 相，又不会引起药物的泄露。
[0133] (4)融合前后脂质体的理化性质
[0134] 按照前述方法制备两种脂质体及融合脂质体，并测定各处方脂质体的粒径、PDI及 Zeta电位。如表2-1所示最佳制备工艺下所得脂质体粒径在97~121ηηι，Η)Ι均〈0.3,粒径分 布均勾，Zeta电位从-18mV到37mV不等。结果表明，融合后脂质体的粒径并不会明显增加，反 而roi较融合前有所改善。
[0135] 表2-1脂质体的粒径和电位，X. ±_s,.n = 3
[0136]
[0137] (6)脂质体的包封率
[0138] 分别测定D0X和PLP的包封率，测定结果如表2-2所示。最佳制备工艺下制备所得脂 质体的包封率均>95%，其中PLP-D0X-YM的D0X包封率为97% ;PLP包封率为94%。
[0139] 表2-2脂质体的包封率，T±s，n = 3
[0141] 三、用诱导正-负电荷脂质体融合的方法制备共载盐酸多柔比星(DNR)和泼尼松龙 磷酸钠(PLP)的脂质体
[0142] 本品为第一代蒽环类抗肿瘤抗生素。其作用机制酷似阿霉素。作为一种周期非特 异性化疗药，柔红霉素的抗瘤谱远较阿霉素为窄，对实体瘤疗效大不如阿霉素和表阿霉素。 该品主要用于各种类型的急性白血病(包括粒细胞性、淋巴细胞性和单核细胞性以及粒-单 核细胞性）、红白血病、慢性粒细胞性白血病、恶性淋巴瘤，也可用于神经母细胞病、尤因肉 瘤和肾母细胞瘤等。
[0143] (1)载DNR长循环阳离子脂质体的制备
[0144] 按HSPC: DOTAP: Choi: DSPE-mPEG2000 = 9: 25:12:12(W/W)称取一定量膜材置于梨 形瓶中，溶于适量无水乙醇，40°C水浴下减压旋蒸lh除掉有机溶剂，得到空白脂膜。加入 300mmol · L-l(pH 4.0)的硫酸铵溶液，65°C旋转水化60min，探头超声5min，室温透析24h (透析介质为，0.1M，pH 7.4)，得到空白脂质体。采用硫酸铵梯度法，以D0X:脂材=3:50 (W/W)加入ΜΤ0储备液，65°C水浴保温30min，并通过sephadexG-25柱去除游离药物，得到载 DNR的阳离子脂质体(DNR-YM)。对于载DNR的长循环阴离子脂质体(DNR-CM)，用HSPC代替 DOTAP，其余操作与DNR-YM相同。
[0145] (2)载PLP长循环阴离子脂质体的制备
[0146] 按HSPC: Cho 1: DSPE-mPEG2000 = 3:1: 2:1 (W/W)称取一定量膜材置于梨形瓶中，溶 于适量无水乙醇，40°C水浴下减压旋蒸lh除掉有机溶剂，得到空白脂膜。以PLP:脂材= 1:10 (W/W)加入PLP超纯水溶液，65 °C旋转水化60min，探头超声5min，并通过sephadexG-25柱去 除游离药物，得到载PLP的长循环阴离子脂质体(PLP-CM)。
[0147] (3)共载DNR和PLP融合脂质体的制备
[0148] 取（1)中所得的D0X-YM与（2)中所得的PLP-CM，按药物的药物比例3 : 5 (W/W，DNR: PLP)，将两种脂质体混合均匀，加入40mM L-1柠檬酸，诱导融合2h，即得共载DNR和PLP融合 脂质体(PLP-DNR-YM)。
[0149] 对于制备DNR和PLP共载脂质体，研究之初考虑采用最简单的共载方法，即将两种 药物溶液直接混合后去水化脂质膜，结果发现两种药物混合溶液中出现沉淀，其原因可能 是形成了DNR-PLP难溶性复合物，故提示该法不可行。也尝试先制备单载PLP的脂质体，再用 梯度法载DNR，但是在制备梯度的透析过程中PLP就已经大量泄漏，提示该法亦不可行。
[0150] (4) LHD7修饰的共载ΜΤ0和PLP长循环脂质体的制备
[0151] 取上述所制得的 PLP-DNR-YM，按 LHD7: Lipids = 1:15(W/W)将 LHD7 和 PLP-DNR-YM 混 合均匀，25°C水浴孵育30min，即得LHD7修饰的共载DNR和PLP的长循环脂质体(PLP-DNR-ΗΜ1:15)〇
[0152] 对于LHD7修饰的载DNR的长循环脂质体(DNR-HM1:15)，将LHD7和DNR-YM混合均匀， 其余操作与PLP-DNR-HM1:15相同。
[0153] PLP-DNR-HM1:15的制备则采用简单、成熟的后插入法将两亲性靶向材料LHD7插入 到PLP-DNR-YM的磷脂双分子结构中，此方法既可使靶头部分(LMWH)全部暴露在脂质体外水 相，又不会引起药物的泄露。
[0154] (4)融合前后脂质体的理化性质
[0155] 按照前述方法制备两种脂质体及融合脂质体，并测定各处方脂质体的粒径、PDI及 Zeta电位。如表3-1所示最佳制备工艺下所得脂质体粒径在100~125nm，PDI均〈0.2,粒径分 布均勾，Zeta电位从-16mV到36mV不等。结果表明，融合后脂质体的粒径并不会明显增加，反 而roi较融合前有所改善。
[0156] 表3-1脂质体的粒径和电位，X. 土s,n = 3
[0157]
[0158] (6)脂质体的包封率
[0159]分别测定DNR和PLP的包封率，测定结果如表3-2所示。最佳制备工艺下制备所得脂 质体的包封率均>95%，其中PLP-DNR-YM的DNR包封率为95% ;PLP包封率为94%。
[0160]表3-2脂质体的包封率，T±s，n = 3
【附图说明】：
[0163] 图1柠檬酸对脂质体融合率的影响。
[0164] 图 2中A~C分别为 PLP-CM、MT〇-YM、PLP-MT〇-YM的 TEM 图。
[0165] 图3中A为制备PLP-MT0-YM融合脂质体的动态TEM图，其中（i) :PLP-CM与ΜΤ0-ΥΜ相 隔较远，（i i): PLP-CM与ΜΤ0-ΥΜ逐渐靠近，（i i i): PLP-CM与ΜΤ0-ΥΜ开始融合，（iv): PLP-CM与 ΜΤ0-ΥΜ融合完全至界面消失。
[0166] 图4脂质体的体外释放曲线，其中A:各处方脂质体在PBS 7.4中的释放，B:PLP-MT0-HM1:15在不同pH值PBS中的释放。
[0167] 图5 PLP-MT0-HM1:15的存储稳定性，A:包封率变化，B:粒径和Η)Ι变化。
[0168] 图6空白材料对细胞的活力抑制，A:CT26，B:B16F10。
[0169] 图7脂质体对细胞活力抑制的浓度依赖性，A: CT26，B: B16F10。
[0170] 图8细胞生长抑制的时间依耐性，A:CT26，B:B16F10。
[0171] 图9 CT26皮下瘤的生长曲线。
[0172] 图10 B16F10皮下瘤的生长曲线。
[0173] 图11肿瘤新生血管抑制作用，A:CT26,其A~J分别代表NS、FM、MT〇-CM、MT〇-YM、 MT0-HM1:60、MT0-HM1:30、MT0-HM1:15、PLP-MT0-YM、PLP-CM+MT0-HM1:15及PLP-MT0-HM1:15 组；B:B16F10，a~g分别代表 NS、FM、PLP-CM、MT0-YM、MT0-HM1:15、PLP-CM+MT0-HM1:15& PLP-MT0-HM1:15组。
[0174] 图12肿瘤细胞凋亡促进作用，A:CT26,其中A~J分别代表代表吧^1、11'0-01、11'0_ YM、MT0-HM1:60、MT0-HM1:30、MT0-HM1:15、PLP-MT0-YM、PLP-CM+MT0-HM1:15及PLP-MT0-腿1:15组 ；8:816?10,3~8分别代表吧小]\^1^-〇1、]?1'0-￥]\1、]?1'0-腿1:15、？1^-〇1+]?1'0-腿1: 15及PLP-MT0-HM1:15组。
【主权项】
1. 利用诱导脂质体融合来制备双载或多载脂质体的技术。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于:所述的诱导脂质体融合的方法包括:诱导 正-负电荷脂质体融合、阳离子如氢离子(H+)、钙离子(Ca 2+)、镁离子(Mg2+)等诱导普通脂质 体或pH敏感脂质体融合；阴离子如柠檬酸、EDTA、磷酸根、硫酸根、醋酸等来诱导融合;聚阳 离子聚合物如聚赖氨酸、聚组氨酸等等来诱导融合;聚阴离子聚合物如聚谷氨酸、聚天冬氨 酸等等来诱导融合;特殊的融合诱导剂来诱导脂质体融合，这样的诱导剂包括聚乙二醇、磷 脂酶、α-生育酚、聚胺、凝集素、质粒DNA、RNA、siRNA及某些多肽和蛋白（如膜联蛋白VII、网 格蛋白等等）;一些特殊的理化条件，如温度、渗透压等等，中的至少一种。3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于:所述的带负电荷的脂质体可以采用的带负 电荷的脂质材料来制备，通常由于头部带有负电荷的基团而成为负电荷的脂质，包括各种 来源的磷脂酰胆碱(卵磷脂）、氢化卵磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、磷脂酰糖酐、磷 脂酰丝氨酸、鞘磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血磷脂、二鲸蜡磷酸酯(DCP)等。4. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于:所述的带负电荷的脂质体也可能采用荷负 电的糖脂如单半乳糖-和二乳糖-甘油二酯(MDGD，DGDG)。5. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于:所述的带负电荷的脂质体也可以采用带负 电荷基团的胆固醇衍生物来代替，如胆固醇琥珀酸酯(CHEMS)从而得到荷负电的脂质体。6. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于:带正电荷的脂质体可以采用的阳离子脂质 材料包括所述的DC-CHOL(CAS: 166023-21-8)、硬质酰胺等带正电荷的脂质衍生物。7. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于：带正电荷的脂质体也可以包括带正电荷的 磷脂材料如，〇(1^?(〇厶5:132172-61-3)、0(1^?(〇厶5:144189-73-1)、01^^?(〇厶5:197974-74-6)、16:0 TAP(139984-36-4)、DDAB(CAS: 3700-67-2)、D0BAQ(CAS:1360461-69-30)、 D0DAP(CAS:127512-29-2)、16:0 TAP(CAS: 72719-84-7)、18:0 TAP(220609-41-6)、12:0 EPC(EPC为乙酰化磷脂酰胆碱的简称，CAS: 474945-22-7)、14:0 EPC(CAS: 186492-53-5)、 14:1EPC(CAS:1246304-44_8)、16:0EPC(CAS:328250-18-6)、18:0EPC(CAS:328268-13-9)、18:1 EPC(CAS: 474945-24-9)、16:0-18:1 EPC(CAS: 328250-19-7)、D0TMA(CAS: 104872-42-6)、MVL5(CAS: 464926-03-2)、D0SPA(CAS: 168479-02-5)、DMRIE(CAS: 153312-64-2)、DLinDMA(CAS: 871258-12-7)、DMPE(CAS: 998-07-2)、18:1co9TAP(CAS: 104162-48-3)、D0DAP(CAS: 127512-29-2)、DOBAQ(CAS: 1360461-69-3)、14:0DAP(CAS: 72719-84-7)、16:0 DAP(CAS: 96326-74-8)、18:0 DAP(CAS: 121315-93-3)等等。8. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于:pH敏感的脂质体分为PE-脂质体和PC-脂质 体，也包括PS构成的脂质体。9. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于:pH敏感的脂质体的pH融合作用有时需要辅 助介质如多聚组氨酸、植物血凝素等等。10. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于：pH敏感脂质成分包括:DPSG、DOSG、油酸 (OA)、PHC或胆固醇衍生物CHEMS、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)等等。
【文档编号】A61K31/573GK105832670SQ201510994777
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年12月28日
【发明人】不公告发明人
【申请人】四川大学