一种用于治疗脑肿瘤的功能性脂质体及其制备方法和应用

一种用于治疗脑肿瘤的功能性脂质体及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于治疗脑肿瘤的功能性脂质体及其制备方法和应用。所述靶向脂质体由脂质体和4?氨基苯基?α?D?吡喃甘露糖苷组成；4?氨基苯基?α?D?吡喃甘露糖苷连接于脂质体的氨基上，脂质体的氨基由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺?聚乙二醇?氨基提供。本发明将MAN修饰到脂质体表面，增强跨血脑屏障的能力，同时具有靶向肿瘤细胞的作用；将抗肿瘤药熊果酸和诱导肿瘤细胞凋亡剂EGCG包载到脂质体中，得到多功能的靶向脑肿瘤干细胞复方脂质体，能够使药物在跨过BBB后，到达病灶部位，两药联合杀死肿瘤细胞并诱导肿瘤干细胞凋亡，大大提高化疗效果，预期能过有效防止肿瘤复发。本发明为彻底根治脑肿瘤带来了希望，具有重要的理论意义与临床意义。
【专利说明】
一种用于治疗脑肿瘤的功能性脂质体及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于治疗脑肿瘤的功能性脂质体及其制备方法和应用，属于脑肿 瘤药物研究领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，肿瘤的发病率和死亡率均在明显上升，脑胶质瘤在成人恶性肿瘤的发病 率也占了非常高的比例。脑胶质瘤具有极强的侵袭能力，且侵入性神经胶质瘤细胞能够迅 速渗透和破坏正常脑组织。采用外科治疗时难以彻底清除神经胶质瘤，而且神经胶质瘤对 放化疗的敏感性差，复发率极高，致使神经胶质瘤的预后很差，严重威胁着人类的健康和生 命，是人类死亡率最高的肿瘤之一。尽管采用手术切除，放疗和化疗相结合的治疗手段，患 者的平均存活时间近30年来并没有显著改变。
[0003] 脑胶质瘤的预后较差，也是由于手术切除后的肿瘤耐受和肿瘤复发所致。大多数 肿瘤都是由具有不同增殖潜能和移植成瘤活性不同的细胞群组成。构成肿瘤实体的异质细 胞群中存在着部分具有自我更新及分化特性的细胞亚群，即肿瘤干细胞（cancer stem cellS，CSCS)。目前临床考察放疗和化疗的敏感性以及手术效果的主要指标之一是肿瘤细 胞数量减少或肿瘤体积缩小的程度。但根据肿瘤干细胞(CSCs)理论，这不代表肿瘤干细胞 的完全清除，如果治疗后肿瘤干细胞继续增殖，肿瘤就有可能在缓解后复发。所以，如能完 全杀灭肿瘤组织中的肿瘤干细胞，则脑肿瘤就有被根治的可能。因此，在肿瘤疾病的靶向治 疗中，肿瘤干细胞已经成为备受关注的药物设计与筛选的靶点。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的是提供一种用于治疗脑肿瘤的功能性脂质体及其制备方法和应用， 本发明将]^1^(4-氨基苯-(1-〇-吡喃甘露糖苷4-&1]1；[110-口1161171-(1-0-1]1&1111〇17瓜11〇81(16)修 饰到脂质体表面，增加脂质体穿过BBB的能力进而达到病灶部位;本发明还将熊果酸(UA， Ursolic acids)和EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)包载到脂质体中，两药合用在提高抗 肿瘤作用的同时，增强其对肿瘤细胞及其干细胞的促凋亡作用，为杀死肿瘤细胞及其干细 胞提供可能，从而防止治疗后因干细胞残留而引起肿瘤复发。
[0005] 本发明所提供的靶向脂质体，由脂质体和4-氨基苯基-a-D-吡喃甘露糖苷组成；
[0006] 所述4-氨基苯基-a-D-R比喃甘露糖苷连接于所述脂质体的氨基上。
[0007] 上述的靶向脂质体中，所述脂质体的氨基由由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEG-NH2)提供。
[0008] 上述的靶向脂质体中，所述脂质体由卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚 乙二醇(DSPE-PEG)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEG-NH 2)制备得到；
[0009] 各原料的摩尔份数为：
[0010] 所述卵磷脂65~70份；
[0011] 所述胆固醇30~35份；
[0012]所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1~5份；
[0013]所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基0.5~2份；
[0014]各原料的摩尔份数具体可为：
[0015]所述卵磷脂68.5份；
[0016] 所述胆固醇33.6份；
[0017]所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3.6份；
[0018]所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基1份。
[0019]所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇具体可为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙 二醇2000(DSPE-PEG2000);
[0020]所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基具体可为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚 乙二醇2000-氨基交连物(DSPE-PEG2000-NH2)。
[0021] 上述的靶向脂质体中，所述4-氨基苯基-a-D-吡喃甘露糖苷与所述脂质体的质量 比可为1:20~25,具体可为1:22.25。
[0022] 本发明进一步提供了所述靶向脂质体的制备方法，包括如下步骤：以戊二醛作为 连接剂，将所述4-氨基苯基-a-D-吡喃甘露糖苷连接于所述脂质体的所述氨基上，即得所述 靶向脂质体。
[0023] 上述的制备方法中，所述脂质体可由所述卵磷脂、所述胆固醇、所述二硬脂酰磷脂 酰乙醇胺-聚乙二醇与所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇_氨基通过硫酸铵梯度法制备 得到。
[0024] 上述的制备方法中，所述戊二醛与所述4-氨基苯基-a-D-吡喃甘露糖苷的摩尔比 可为3~5:1，具体可为3.95:1。
[0025] 以所述靶向脂质体为活性成分的药物载体也属于本发明的保护范围。
[0026] 本发明还提供一种载药脂质体，其由所述靶向脂质体包载药物得到。
[0027] 所述载药脂质体中，所述药物具体可为熊果酸和/或表没食子儿茶素没食子酸酯， 熊果酸是存在于天然植物中的一种五环三萜类化合物;表没食子儿茶素没食子酸酯是从中 国绿茶中提取的一种成份，它是绿茶主要的活性和水溶性成份，是儿茶素中含量最高的组 分。
[0028] 所述载药脂质体的药脂比为1:15~40;
[0029] 当所述药物为所述熊果酸时，所述药脂比可为1:20,当所述药物为所述表没食子 儿茶素没食子酸酯时，所述药脂比可为1:15，当所述药物为所述熊果酸和所述表没食子儿 茶素没食子酸酯时，所述药脂比可为1:17.5。
[0030] 所述药脂比指的是所述药物的质量与所述靶向脂质体中的所述卵磷脂和所述胆 固醇的质量之和的比值。
[0031] 本发明提供的载药脂质体可用于治疗脑肿瘤，所述脑肿瘤可为脑胶质瘤，具体可 为C6胶质瘤。
[0032] 本发明提供的载药脂质体能够抑制脑肿瘤细胞和/或脑肿瘤干细胞增殖、促进脑 肿瘤细胞和/或脑肿瘤干细胞凋亡以及增强脑肿瘤细胞和/或脑肿瘤干细胞对药物摄取能 力，所述脑肿瘤细胞为脑胶质瘤细胞，具体可为C6胶质瘤细胞，所述脑肿瘤干细胞可为脑胶 质瘤干细胞，具体可为C6胶质瘤干细胞。
[0033] 本发明将MAN修饰到脂质体表面，增强跨血脑屏障的能力，同时具有靶向肿瘤细胞 的作用；将抗肿瘤药熊果酸和诱导肿瘤细胞凋亡剂EGCG包载到脂质体中，得到多功能的靶 向脑肿瘤干细胞复方脂质体，能够使药物在跨过BBB后，到达病灶部位，两药联合杀死肿瘤 细胞并诱导肿瘤干细胞凋亡，大大提高化疗效果，预期能过有效防止肿瘤复发。本发明为彻 底根治脑肿瘤带来了希望，具有重要的理论意义与临床意义。
【附图说明】
[0034] 图1为本发明载药脂质体(MAN-UA-EGCG-脂质体)的透射电镜照片。
[0035] 图2为本发明载药脂质体(MAN-UA-EGCG-脂质体)的药物释放曲线，其中，图2(A)表 示的是UA、UA-EGCG-脂质体和MAN-UA-EGCG-脂质体的药物释放曲线，图2 (B)表示的是EGCG、 UA-EGCG-脂质体和MAN-UA-EGCG-脂质体的药物释放曲线。
[0036] 图3为C6脑胶质瘤细胞（图3(A))及肿瘤干细胞球(图3(B))形态。
[0037]图4为C6脑胶质瘤干细胞鉴定结果。
[0038] 图5为不同载药脂质体对C6脑胶质瘤细胞的抑制作用。
[0039] 图6为不同载药脂质体对C6脑胶质瘤干细胞的抑制作用。
[0040] 图7为不同载药脂质体对C6胶质瘤细胞的凋亡作用，其中，图7(A)表示游离EGCG对 C6胶质瘤细胞的凋亡作用，图7(B)表示游离UA对C6胶质瘤细胞的凋亡作用，图7(C)表示UA-EGCG对C6胶质瘤细胞的凋亡作用，图7(D)表示UA-EGCG-脂质体对C6胶质瘤细胞的凋亡作 用，图7(E)表示MAN-UA-EGCG-脂质体对C6胶质瘤细胞的凋亡作用。
[00411图8为不同载药脂质体对C6胶质瘤干细胞的凋亡作用，图7(A)表示游离EGCG对C6 胶质瘤干细胞的凋亡作用，图7(B)表示游离UA对C6胶质瘤干细胞的凋亡作用，图7(C)表示 UA-EGCG对C6胶质瘤干细胞的凋亡作用，图7(D)表示UA-EGCG-脂质体对C6胶质瘤干细胞的 凋亡作用，图7(E)表示MAN-UA-EGCG-脂质体对C6胶质瘤干细胞的凋亡作用。
[0042]图9为不同载药脂质体对C6胶质瘤细胞以及C6胶质瘤干细胞凋亡率对比，其中，柱 状图A、B、C、D和E分别表示游离EGCG、游离UA、UA-EGCG、UA-EGCG-脂质体和MAN-UA-EGCG-月旨 质体对C6胶质瘤细胞以及C6胶质瘤干细胞凋亡率。
[0043]图10为激光共聚焦法检测细胞对不同载药脂质体的摄取及其在细胞内的分布行 为，其中，图10(A1)、图10(B1)和图10(C1)表示药物在C6胶质瘤干细胞内的分布，图10(A2)、 图10(B2)和图10(C2)表示经过PI染色后的C6干细胞核，图10(A3)、图10(B3)和图10(C3)表 示经Hochest33258染色后的C6干细胞核，图10(A4)、图10(B4)和图10(C4)表示前面三组的 叠加图像。
[0044] 图11为C6胶质瘤细胞及其干细胞对不同载药脂质体的摄取能力，其中，柱状图A、B 和C分别表示C6胶质瘤细胞及其干细胞对游离香豆素-UA、香豆素-UA-脂质体和MAN-香豆 素-UA-脂质体的摄取能力。
【具体实施方式】
[0045] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0046] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047] 下述实施例所用的试剂和仪器如下：
[0048] 1、实验试剂和细胞
[0049] 蛋黄卵磷脂（EPC)购自Germany Lipoid company，ShangHai local agent,China; 胆固醇(cholesterol)购自北京双旋微生物培养基制品厂;聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺（DSPE-PEG2000)购自日本油脂株式会社（日本 NOF&3);DSPE-PEG2000-NH2、p-aminophenyl-a-D-manno-pyranoside(MAN)、葡聚糖凝胶（shephedex G-50)、三硝基苯横酸 (TNBS)购自Sigma公司；熊果酸购自南京泽朗生物科技有限公司;EGCG购自成都植标化纯生 物技术有限公司；硫酸铵（（NH4) 2S〇4)，分析纯，购自天津市福晨化学试剂厂;DMEM高糖培养 基、01^11作12高糖培养基、0.25%胰酶购于611^(3 〇公司；胎牛血清购自杭州四季青生物科技 有限公司；青霉素-链霉素双抗试剂（100X)购于北京索莱宝生物科技有限公司；基本成纤 维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)购自美国PeproTech公司；B27购自美国Gibco 公司；磺酰罗丹明B蛋白（SRB)购自美国Sigma公司。C6大鼠脑胶质瘤细胞购自中国科学院 上海细胞所。
[0050] 2、实验仪器
[0051 ] 聚碳酯过滤器(孔径为400、200nm)购自組111口〇代（86(^(^(1，]\^，1^4) ;岛津^：-15〇 高效液相色谱仪（日本岛津公司，紫外检测器）；UV-2401PC型紫外-可见分光光度计（日本岛 津公司）；马尔文粒度测定仪(英国马尔文仪器公司）；Sart〇riUSBP211D电子天平(德国赛多 利斯集团）；超声波清洗器(天鹏电子新技术北京有限公司）；EYELA-1000S型旋转蒸发仪（日 本EYELA东京理化器械株式会社）；JY92细胞超声破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公 司）；恒温振荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂）；透析袋(截留分子量8000-12000);脂质体挤 压器(德国赛多利斯集团）；流式细胞仪（美国BD公司）C02恒温培养箱（Thermo科技有限公 司，美国）；酶标免疫测定仪(上海基因科技有限公司）。
[0052]实施例1、脂质体的制备 [0053] 一、空白脂质体的制备
[0054] 1、空白脂质体的制备
[0055] 将卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-NH2按摩尔比68 ? 5:33 ? 6:3 ? 6:1 溶解在甲醇中，旋转蒸发除去甲醇，在茄形瓶中35°C、40rpm旋转蒸发成膜，加入250mM硫酸 铵10ml，先在水浴中超声5min，然后转移到血清瓶中在JY92型超声波细胞粉碎机中进一步 超声(超声工作时间为l〇s，间歇时间为30s，全程时间为10min，保护温度为35°C )，再使用脂 质体挤压器分别过400nm和200nm聚碳脂膜各3次，采用透析法用PBS液(pH=7.4)更换脂质 体外相液，得到空白脂质体。
[0056] 2、4-氨基苯-a-D-吡喃甘露糖苷修饰的空白脂质体的制备
[0057] 通过戊二醛作连接剂将4-氨基苯-a-D-吡喃甘露糖苷(MAN)化学连接到空白脂质 体上DSPE-PEG2000-NH2的氨基上。
[0058] 具体步骤为：将8ml空白脂质体（10.8mg/ml)与lmg MAN混合，然后缓慢加入戊二 醛，使戊二醛终浓度达到15mM(其与MAN的摩尔比为3.95:1)，室温下孵育5min。未连接的MAN 和戊二醛通过在PBS(pH=7.4)中透析去除，得到MAN修饰的脂质体(MAN-脂质体）。
[0059]二、载药脂质体的制备
[0060]药脂比=熊果酸或EGCG的质量:脂质体中卵磷脂和胆固醇的质量之和。
[0061]将熊果酸以1:20的药脂比与卵磷脂、胆固醇等溶解在甲醇中，操作方法同一中的 步骤1。得到载有熊果酸的脂质体(UA-脂质体）。将EGCG以1:15的药脂比与UA-脂质体混合， 60°C水浴中振摇20min，得到载熊果酸和EGCG的脂质体(UA-EGCG-脂质体）。
[0062]上述方法得到的熊果酸-EGCG脂质体，按照一中的步骤2得到MAN修饰的熊果酸和 EGCG的脂质体(MAN-UA-EGCG-脂质体）。
[0063]实施例2、脂质体的性能测定 [0064] 一、MAN修饰率测定
[0065] 脂质体上NH2-PEG2000-DSPE的氨基与三硝基苯硫酸反应，据此检测MAN-UA-EGCG- 脂质体可与三硝基苯硫酸反应的氨基数量。MAN-UA-EGCG脂质体的MAN修饰率为：[1-(MAN-UA-EGCG-脂质体)上可与三硝基苯硫酸反应的氨基数量/空白脂质体上可与三硝基苯硫酸 反应的氨基数量]X 100%。测得MAN-UA-EGCG-脂质体表面MAN的连接效率为32.95土 0.06%〇
[0066] 二、包封率的测定
[0067] 采用葡聚糖凝胶G-50柱层析法除去未包载到脂质体内的熊果酸，取适量过柱前 UA-EGCG-脂质体和MAN-UA-EGCG-脂质体甲醇消解测定总熊果酸含量;另取过柱后的脂质体 溶液用甲醇消解，测定脂质体中熊果酸含量。采用透析法去除未包载到脂质体内的EGCG，取 适量透析UA-EGCG-脂质体和MAN-UA-EGCG-脂质体甲醇消解测定总EGCG含量;另取透析后的 脂质体溶液用甲醇消解，测定脂质体中EGCG含量。采用用公式(1)计算包封率：
[0068] 包封率包/W总 X100% (1)
[0069] 其中W包和W总分别表示脂质体包载的药量和总投料量。
[0070] 在所制备的载药脂质体中，熊果酸的包封率可达79%，EGCG的包封率可达78%。
[0071] 三、粒径和电位测定
[0072] 分别将lml新制得的空白脂质体、UA-EGCG-脂质体和MAN-UA-EGCG-脂质体用roS稀 释，使用Nano Series Zen 4003 Zeta Sizer(Malvern instruments,Ltd,UK)测定脂质体 的粒径、多分散系数和Zeta电位。不同脂质体的粒径、多分散系数(PDI)和zeta电位的测定 结果见表1。脂质体粒径分布均勾，粒径大小在l〇5nm~115nm之间。各载药脂质体都略带负 电，说明脂质体囊泡之间具有适量的静电排斥力，贮存稳定性更好，不易发生聚沉。
[0073] 表1不同脂质体粒径及Zeta电位(n = 3)
[0075]四、透射电镜(TEM)
[0076]采用透射电镜对实施例1制备的多功能MAN-UA-EGCG-脂质体进行形态学观察。具 体方法为使用去离子水作为分散介质稀释脂质体，用〇. 2wii微孔滤膜过滤后，将铺有碳膜的 铜网漂放在脂质体溶液上，lmin后取出，滤纸吸干;将俘获有脂质体粒子的铜网漂放在3% 磷钨酸染色水溶液上，lmin后取出，用清水洗涤未结合的燃料，干燥。通过透射电镜观察脂 质体的形貌见图1，可见脂质体形态较为圆整，大小均一。
[0077]五、载药脂质体的释放
[0078] 分别精密量取1 .OOmL UA-EGCG-脂质体和MAN-UA-EGCG-脂质体混悬液转入经处理 的透析袋中，系紧透析袋两端，悬置在盛有25倍释放介质的锥形瓶中，置于恒温振荡器中， 于37±0.5°C中恒温振荡48h，在设定的取样时间取样，并立即补入等体积透析介质，过0.45 Mi微孔滤膜，进样20yL，HPLC分析测定。根据公式(2)计算UA和EGCG释放百分率：
[0079] F(%) = (Ct/CS)X100% (2)
[0080] Ct/C总为各时间点实测浓度与按标示量计算得到的溶出介质中浓度之比，由此求 得不同时间的释放百分率F( % )，绘制释放曲线。
[0081 ]由图2可知，熊果酸游离药释放速度较快，在48h时达到80%，48h时UA-EGCG-脂质 体和MAN-UA-EGCG-脂质体中熊果酸释放率为20 %左右，释放缓慢，无突释现象。由图2可知， EGCG游离药释放速度较快，在48h时达到80%以上，48h时UA-EGCG-脂质体和MAN-UA-EGCG-脂质体中EGCG释放率为20%左右，释放缓慢，无突释现象。上述结果表明，熊果酸和EGCG以 脂质体为载体时稳定性良好，目标脂质体具有缓释作用。
[0082]实施例3、载药脂质体体外对C6脑胶质瘤细胞及C6脑胶质瘤干细胞的抑制作用研 究
[0083] 一、培养条件
[0084] 1、C6脑胶质瘤细胞培养条件
[0085]将C6胶质瘤细胞培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100yg/mL链霉素的 DMEM高糖培养基中，37°C、5 %⑶:^饱和湿度培养箱孵育，C6胶质瘤细胞贴壁生长，细胞形态 呈梭形，胞浆伸展，胞间有突起互相连接(图3(A)所示），取对数生长期细胞进行实验。
[0086] 2、C6脑胶质瘤干细胞培养条件
[0087] 取处于对数生长期的C6细胞，用PBS清洗，0.25%胰酶消化，吹打成单细胞悬液，重 悬于无血清培养基(含有01^11^12 4?6?46?，827)，4~5天后细胞增殖可形成悬浮生长的 肿瘤干细胞球，呈球形，细胞连接紧密，形态如图3(B)所示。干细胞球的传代方法具体为： 将悬浮生长的肿瘤干细胞球连同培养基一起转移至试管内，以l〇〇〇r/min离心5min，弃上 清，无血清培养基重悬细胞，反复吹打，使细胞团分解成单细胞，按1:2或者1:3的比例接种 于25cm 2底面积培养瓶，添加无血清培养基至6mL/瓶，继续在37 °C、5 % C02饱和湿度培养箱中 培养，取培养14天的C6胶质瘤干细胞球进行实验。
[0088] 3、干细胞的鉴别
[0089]由于Nestin在干细胞表面高表达，故用来鉴定C6胶质瘤干细胞。C6胶质瘤干细胞 培养14天之后，收集C6胶质瘤干细胞球，胰酶消化分离，PBS洗涤后，4%多聚甲醛固定固定 lOmiruO. 1 %的皂苷破膜，与Nestin巢蛋白抗体以及其同型对照一起避光孵化30分钟，洗涤 三次后用PBS重悬，使用FACScan流式细胞仪分析。由图4可知，于同型对照相比，C6胶质瘤干 细胞中Nestin表达量为98.51 %。从结果中可以看出Nestin在所培养的C6胶质瘤干细胞球 中高表达，说明上述培养条件适合干细胞的生长和增殖。
[0090] 二、配制不同浓度的载药脂质体
[0091] 配制系列浓度的游离UA、游离EGCG、游离UA-EGCG、UA-EGCG-脂质体和MAN-UA-EGCG-脂质体，取10此上述药物溶液分别加入细胞培养孔中，使各实验组最终熊果酸浓度梯 度为:0、0.1、0.5、1、5、10和201^，对应的￡6〇6浓度为0、0.0164、0.0819、0.164和3.2751^。
[0092]三、载药脂质体对C6胶质瘤细胞及C6胶质瘤干细胞的抗增殖作用 [0093] 取对数生长期的5000个/孔C6胶质瘤细胞190yL/孔接种于96孔板中，37°C，5%C02 条件下培养24h;取培养14天后的C6胶质瘤干细胞球，以1000r/min离心5min，弃上清，C6细 胞完全培养基重悬细胞，反复吹打，使细胞团分解成单细胞，计数后以8000个/孔C6胶质瘤 细胞190此/孔接种于96孔板中，37°C，5%⑶ 2条件下培养24h。将系列浓度的游离UA、游离 EGCG、游离UA-EGCG、UA-EGCG-脂质体和MAN-UA-EGCG-脂质体，各取10yL分别加入细胞培养 孔中，每个浓度设四个复孔。给药后继续培养48h，经SRB方法获得每孔吸收度0D值(540nm)， 计算不同载药脂质体对C6细胞及其干细胞的抑制作用，如图5和图6所示。从图5中可以看 出，游离UA对C6细胞的抑制作用较弱，但与EGCG联用后，可明显增强对C6细胞的生长抑制作 用;MAN-UA-EGCG-脂质体对C6的抗增殖作用优于其他载药脂质体组。从图6中可以看出，UA 与EGCG联合使用后，对C6脑胶质瘤干细胞具有较强的抗增殖效果，发挥了其作为干细胞凋 亡诱导剂的作用;UA-EGCG-脂质体经MAN修饰后，可能增强C6干细胞对其的亲和力和摄取能 力，对C6干细胞的抑制作用明显优于其他各组。
[0094] 实施例4、载药脂质体体外对C6脑胶质瘤细胞及干细胞的凋亡作用研究
[0095] 取对数生长期的C6脑胶质瘤细胞及培养14天后的C6胶质瘤干细胞，以2 X105个/ 孔接种于6孔板中，37 °C，5 %⑶2培养箱中培养。细胞生长24h后，加入游离UA、游离EGCG、游 离UA-EGCG、UA-EGCG-脂质体和MAN-UA-EGCG-脂质体(UA和EGCG的终浓度分别为1 OyM和1.64 yM)，每个药物设三个复孔。置培养箱中继续培养48h后，用冷roS漂洗3遍，不含EDTA的胰酶 消化，离心（lOOOrpm离心3min)后用ros洗涤细胞两次，300yL回流的ros将离心的下沉细胞 吹匀。之后依次加入500yL的Binding Buffer、5yL Annexin V-APC、5yL 7-AAD，混匀后于室 温避光的条件下反应lOmin，经流式细胞仪检测。
[0096] 实验结果如图7所示，游离EGCG(A)、游离UA(B)、UA-EGCG(C)、UA-EGCG-脂质体(D)、 MAN-UA-EGCG-脂质体（E)对C6胶质瘤细胞的凋亡率分别为5. 14%、4.75%、17. 14%、 28.48%和48.47%。如图8所示，游离￡606(八）、游离1^(8)、1^4606(〇、1^4606-脂质体 (0)、1^.1^1606-脂质体（￡)对06胶质瘤干细胞的凋亡率分别为10.01%、14.82%、 18.87%、21.57%、23.62%和32.43%。由上述结果可以看出，不同载药脂质体对C6胶质瘤 细胞的促凋亡作用强于对C6胶质瘤干细胞的促凋亡作用。熊果酸本身对C6胶质瘤细胞以及 C6胶质瘤干细胞都有促凋亡作用，但是作用较弱，加入EGCG后对C6胶质瘤细胞促凋亡作用 增大；熊果酸-EGCG用脂质体作为载体后对C6胶质瘤细胞和C6胶质瘤干细胞的促凋亡作用 明显增高。由图9可知，MAN-UA-EGCG-脂质体对C6胶质瘤细胞以及C6胶质瘤干细胞的凋亡百 分率最高分别为48%和32%，经统计学分析，与其他各组相比具有显著性差异，说明其促凋 亡作用明显强于其他各组。
[0097] 实施例5、共聚焦显微镜研究不同载药脂质体在C6胶质瘤干细胞内的分布
[0098] 目前对于微粒给药系统体内评价的一个重要方面是研究其在体内的吸收和转运 情况，较常用的方法是进行荧光标记后示踪给药系统的体内转运行为。香豆素6(Coumarin-6)是一种激光转化率较高、性能比较稳定的脂溶性激光染料。本试验采用薄膜分散法制备 包载模型药物熊果酸和荧光标记物香豆素6的脂质体，研究C6脑胶质瘤干细胞的体外摄取 情况。
[0099] 取C6胶质瘤干细胞球，收集离心后接种在含有载玻片的12孔板上，含血清培养基 培养，2万/孔，于37°C二氧化碳培养箱中，相对湿度95%的条件下孵育24h。分别加入游离香 豆素-UA、香豆素-UA-脂质体和MAN-香豆素-UA脂质体。置培养箱中继续培养2h后，依次用冷 PBS漂洗三次，4 %多聚甲醛固定lOmin，Hoechst33258进行细胞核染色5min，30 %甘油封片。 用Hoechst 33258着色lOmin，用PI着色5min。用激光扫描共聚焦显微镜观察。（Hoechst 33258激发波长为352nm，吸收波长为505-550nm;PI激发波长为488nm，发射波长为63nm)〇 然后用Aim Image Examiner软件进行图像分析。
[0100] 结果如图10所示。A1-C1表示药物在C6胶质瘤干细胞内的分布;A2-C2表示经过PI 染色后的C6干细胞核;A3-C3表示经Hochest33258染色后的C6干细胞核;A4-C4为前面三组 的叠加图像。实验结果表明，采用薄膜分散法制备的脂质体微粒给药经过香豆素标记后，可 以进入到细胞内，并且MAN-香豆素-UA-脂质体进入细胞的量明显多于其他两组。由结果可 知，经过PI染色后，可以观察到细胞的凋亡形态，细胞核中有红色碎片形成。不同的给药系 统，细胞核中呈现出的碎片大小以及形态有一定程度的差异。通过观察，MAN-香豆素-UA-月旨 质体相比较于其他两组，细胞核出现了较为明显的裂解。
[0101 ]实施例6、C6胶质瘤细胞及其干细胞对不同载药脂质体的摄取能力
[0102] 取对数生长期的C6脑胶质瘤细胞及培养14天后的C6胶质瘤干细胞，收集离心后， 以20万/孔的密度接种于6孔板，含血清培养基培养，于37 °C二氧化碳培养箱中，相对湿度 95%的条件下孵育24h后，分别给与游离香豆素-UA(A)、香豆素-UA-脂质体(B)和MAN-香豆 素-UA-脂质体(C)，培养箱中孵育2h。孵育完毕后，用冷的PBS洗涤细胞三次，经0.25 %胰酶 消化收集，再用PBS吹打成细胞悬液，经流式细胞仪检测。结果如图11所示，在C6胶质瘤细胞 及其干细胞的摄取实验中，与游离药和其他各组载药脂质体相比，MAN-香豆素-UA-脂质体 显示出最强的C6胶质瘤细胞及其干细胞的摄取能力。
[0103] 综上所述，本发明构建的多功能祀向脂质体，粒径大小均一，药物释放稳定;对C6 脑胶质瘤细胞及其干细胞具有很强的抗增殖作用；显著增加C6脑胶质瘤干细胞对药物的摄 取;可诱导C6脑胶质瘤细胞及C6脑胶质瘤干细胞的凋亡；可明显提高载体跨越血脑屏障的 能力，进而将药物输送至肿瘤部位，杀死C6脑胶质瘤细胞，并诱导C6脑胶质瘤细胞干细胞的 凋亡，预防肿瘤复发。
【主权项】
1. 一种靶向脂质体，其特征在于:所述靶向脂质体由脂质体和4-氨基苯基-α-D-吡喃甘 露糖苷组成； 所述4-氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷连接于所述脂质体的氨基上。2. 根据权利要求1所述的靶向脂质体，其特征在于:所述脂质体的氨基由由二硬脂酰磷 脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基提供。3. 根据权利要求2所述的靶向脂质体，其特征在于:所述脂质体由卵磷脂、胆固醇、二硬 脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基制备得到； 各原料的摩尔份数为： 所述卵磷脂65~70份； 所述胆固醇30~35份； 所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1~5份； 所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基0.5~2份。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的靶向脂质体，其特征在于:所述4-氨基苯基-a-D-吡喃甘露糖苷与所述脂质体的质量比为1:20~25。5. 权利要求1-4中任一项所述靶向脂质体的制备方法，包括如下步骤：以戊二醛作为连 接剂，将所述4-氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷连接于所述脂质体的所述氨基上，即得所述靶 向脂质体。6. -种药物载体，其活性成分为权利要求1-4中任一项所述靶向脂质体。7. -种载药脂质体，由权利要求1-4中任一项所述靶向脂质体包载药物得到。8. 根据权利要求7所述的载药脂质体，其特征在于:所述药物为熊果酸和/或表没食子 儿茶素没食子酸酯。9. 权利要求7或8所述载药脂质体在下述1 )-4)中的任一种应用： 1) 制备治疗脑肿瘤的药物； 2) 制备抑制脑肿瘤细胞和/或脑肿瘤干细胞增殖的产品； 3) 制备促进脑肿瘤细胞和/或脑肿瘤干细胞凋亡的产品； 4) 制备增强脑肿瘤细胞和/或脑肿瘤干细胞对药物摄取能力的产品。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述脑肿瘤为脑胶质瘤。
【文档编号】A61K31/353GK105853360SQ201610282091
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】应雪, 王亚华, 闫荷露, 李霞, 唐辉
【申请人】石河子大学