海洋微生物来源化合物p-3在制备抗衰老药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了海洋微生物来源化合物P?3 在制备抗衰老药物中的应用。该化合物可以通过增加抗衰老基因Sirt 1的表达，提高细胞端粒酶活性，可显著降低细胞的老化程度，对血管紧张素Ⅱ诱导的细胞衰老具有明显的保护作用。本发明 P?3在制备抗衰老损伤及相关性疾病药物中的应用发掘了 P?3 新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域，且 P?3安全无毒，药理作用强，有很好的药用前景。
【专利说明】
海洋微生物来源化合物P-3在制备抗衰老药物中的应用
技术领域
[0001 ]本发明设及海洋微生物来源化合物P-3的新应用。
【背景技术】
[0002] 海洋微生物来源化合物P-3是南海红树林真菌Xylaria SP . 2508的代谢产物 xyloke化1 A的合成衍生物，其化学结构如下：
[0003]
[0004] 已发现该化合物通过调苄基因MMPs而有促血管新生的活性，而血管新生在缺血性 疾病，如冠屯、病，缺血性脑卒中的治疗中具有重要意义，故该化合物可被用作缺血性疾病治 疗药物的活性成分。
[0005] 老龄化问题被认为是21世纪Ξ大世界性社会问题之一，而衰老和老年病的发生是 相生相伴的，二者具有相同的病理生理过程，如神经内分泌素乱、糖类及脂类代谢素乱、免 疫系统损伤等。随着年龄的增大，一些老年性疾病的发生率和患病率均明显增加，如冠屯、 病、糖尿病、动脉粥样硬化等。因此，寻找一种可W有效的延缓细胞衰老，并预防和治疗衰老 相关性疾病的药物对我国的医疗发展具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供海洋微生物来源化合物P-3在制备抗衰老药物中的应用。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[000引发明人经过长期的研究发现P-3可增加细胞抗衰老基因 Sbt 1表达，提高细胞端 粒酶活性，显著降低细胞的老化程度，对血管紧张素 Π 诱导的细胞老化具有明显的保护作 用，可W用于制备抗衰老及衰老相关疾病的药物。特别是W肾素血管紧张素醒固酬系统 (RAAS)激活和（或)端粒酶/SIRT1受损为特征的衰老损伤及相关性疾病。
[0009]其中，可W将P-3制备成药物领域可W接受的各种剂型，如片剂、胶囊等等。
[0010]与现有的P-3的应用相比，本发明具有如下有益效果：
[0011] (1)本发明的化合物P-3具有良好的抗细胞衰老作用。
[0012] (2)本发明的化合物P-3安全无毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。
【具体实施方式】
[0013] 下面将描述本发明的一个实施例，但本
【发明内容】
并不局限于此。
[0014] 实施例1P-3抗细胞衰老的研究 [001引（一)材料与方法
[0016] 1.药物:P-3，白色粉末。溶于DMS0，胆存浓度1 OOmmo 1 /L，保存于4°C备用。
[0017] 2.细胞培养及模型制备：
[001引采用hEPC(人外周血来源的内皮祖细胞)作为体外研究的细胞，90%EGM-2化0NZA) +10%胎牛血清(GIBC0)于37°C5%C02培养箱解育，待细胞生长至7天可用于实验。
[0019]使用血管紧张素 II诱导细胞老化模型:把生长状态良好的hEP巧巾于6孔板，待其生 长至7天时将其正常培养基换成无血清培养基，加入lOOnM血管紧张素 II作用24小时后进行 实验指标的检测。
[0020] 3、细胞活性检测--CCK-骑去
[0021] 于96孔板接种10化L hEPC细胞悬液，每组使用6个复孔，放入37°C溫箱培养，24小 时后加入不同浓度P-3预刺激1小时，再加入lOOnM血管紧张素 II处理24小时后，每孔中加入 1化L CCK-8溶液，在37°C溫箱中避光解育4小时后，于酶标仪测定在45化m波长检测各组吸 光度，将各组吸光度与空白对照组相比较，从而计算各组细胞的存活比例。
[0022] 4、SA-i3-半乳糖巧酶染色检测细胞的衰老程度
[0023] 在6孔板中培养hEPC7天，加入lOOnM血管紧张素11，24小时后去除培养基，用?85洗 2遍，每孔加入1血固定液室溫固定，15min后PBS洗2遍，每孔加入按照SA-0-gal染色试剂盒 配制的ImL染色混合液，在37°C、无 C〇2条件下解育过夜，用巧光显微镜拍照计数细胞染色 率，被染色的细胞代表衰老细胞。
[0024] 5、端粒酶活性检测
[0025] 于6孔板培养hEPC7天，P-3预解1小时后，加入lOOnM血管紧张素 II处理2地，离屯、收 集细胞于离屯、管中，每管加入2(Κ)化裂解液重悬，冰上静置30min后离屯、取上清，同时取阴性 对照85 °C加热lOmin。进行TRAP反应，每个PCR管中加入25化反应混合液、化L待测样品及对 照样品，进行PCR扩增。对应每个样品加入20化变性试剂、5化扩增产物室溫解育lOmin，于预 包被的96孔板中每孔加入22扣L杂交缓冲液、100化混合液37°C摇床解育化，去除缓冲液并 用Washing buffer洗Ξ次，每孔加入10化L甲基联苯胺溶液染色，20min后每孔加入10化L终 止液。用Microplate化LISA) reader读取450nm处的吸光值。
[00%] 6.抗衰老基因 SIRT1蛋白的表达检测
[0027] SIRT1蛋白的表达采用western blot的方法检测，于6孔板培养hEPC7天，P-3预解1 小时，加入lOOnM血管紧张素 II处理24h后，用冰PBS洗细胞Ξ次，加入含有蛋白酶抑制剂 (Cocktai 1)的裂解液RIPA 60~80ul;在冰上裂解细胞5~lOmin。用干净细胞刮刮下细胞及 细胞裂解液，12000r/min 4°C离屯、12min，弃沉淀，小屯、吸取上清蛋白液，-80°C保存。用BCA 法进行定量，按标准曲线计算出样品浓度，W相同的上样总蛋白量将样品与上样缓冲液W 4:1的比例混合，95°C溫浴5min使蛋白在上样缓冲液的作用下变性。配置聚丙締酷胺(SDS- PAGE)凝胶，分离胶8%，浓缩胶5%。使用微量上样器将样品加入浓缩胶的各个跑道中，恒压 80V电泳90min;将分离胶与滤纸、PVDF膜用电转夹包裹好后一起置入电转槽中，在电转缓冲 液中恒流200mA电转90min。电转结束后取出PVDF膜，在室溫用含有5%脱脂奶粉的TBST封闭 化;随后加入相应的Sbtl抗体，Wactin作为内参，4°C冰箱过夜。TBST洗膜5min X 3次，加入 相应的二抗化RP标记，1:1000，用抗体稀释液稀释)后室溫摇床上解育1-化;TBST洗膜lOmin X 3次，在暗室中将PVD刊莫与E化发光液(A液:B液，1:1)混合，于X光胶片上曝光，洗片机冲洗 胶片，随后使用Image J 1.39U进行灰度分析。WSbtl与内参actin的灰度比值代表Sbtl 的表达水平，并把control组的比值设为1，其它组与之相比较分析Sbtl的表达高低。
[00巧]7、统计分析
[0029] 本实验为多组定量数据间两两比较，且符合正态性及方差齐性的要求，因此选用 方差分析(One-way AN0VA)作为统计分析的方法。使用SPSS软件执行统计分析操作。
[0030] (二)实验结果
[0031] 1.不同剂量P-3对Angll诱导的hEPC损伤的保护作用如表1。
[0032] 表1不同剂量P-3处理对Ang II诱导的hEPC活性的影响
[0033]
[0035] *经单因素方差分析得到Angll组与空白对照组的细胞活性具有统计学差异(P< 0.05);
[0036] #经单因素方差分析得到P-3 0.2ιχΜ处理组与Angn组的细胞活性具有统计学差异 (P<0.05)
[0037] ##经单因素方差分析得到P-3 1μΜ/5μΜ/25μΜ处理组与Angn组的细胞活性具有统 计学差异(P<〇.〇l)
[0038] 上述实验结果说明P-3具有保护hEPC血管紧张素损伤的作用，增加细胞生存率，且 呈现剂量依赖(0.04-25μΜ)效应。
[0039] 2.Ρ-3的SA-β-半乳糖巧酶染色研究如表2。
[0040] 表2不同剂量Ρ-3对Angll诱导hEPC衰老的保护能力
[0041]
[0042] **经单因素方差分析得到Angn组与空白对照组的细胞衰老程度具有统计学差异 (P<0.01)；
[0043] ##经单因素方差分析得到P-3 ΙμΜ/ΙΟμΜ处理组与Angll组的细胞衰老程度具有统 计学差异(P<〇.〇l);
[0044] 上述实验结果说明hEPC细胞体外Angll诱导衰老模型构建成功，衰老比例约为空 白对照组的360 % ;同时，P-3具有抗hEPC衰老的作用，且呈现剂量依赖(0.1 -1 ΟμΜ)效应。
[0045] 3.Ρ-3 ΙμΜ处理对Angll诱导的hEPC的端粒酶活性的作用如表3。
[0046] 表3P-3 ΙμΜ处理对Angll诱导的hEPC的端粒酶活性的影响
[0047]
[0049] **经单因素方差分析得到Angn组与空白对照组的细胞端粒酶活性具有统计学差 异(P<〇.〇l);
[0050] #经单因素方差分析得到P-3 ΙμΜ处理组与Angn组的细胞端粒酶活性具有统计学 差异(P<0.05)
[0051] 上述实验结果说明P-3 ΙμΜ具有显著提高hEPC端粒酶活性的作用。
[0化2] 4.P-3 ΙμΜ处理对SIRT1表达的作用如表4。
[0053] 表4Ρ-3 ΙμΜ处理对hEPC中SIRT1表达的影响
[0化4]
[0055] *经单因素方差分析得到Angn组与空白对照组的Sbtl表达具有统计学差异(P< 0.05);
[0化6] ##经单因素方差分析得到P-3 ΙμΜ处理组与Angll组的Sbtl表达具有统计学差异 (P<0.01)
[0057]上述实验结果说明P-3 lliM具有显著提高hEPC中抗衰老基因 Sbtl表达的作用。 [0化引 （Ξ)讨论
[0059] 现今的研究认为，衰老源于细胞活性的降低，进而导致细胞、组织和器官的衰老， 因此衰老即是细胞的衰老。随着衰老机制的研究进入分子时代，各种导致衰老的原因包括 自由基理论、热量限制、端粒酶学说W及表观遗传学等研究领域都有了新的发展。在屯、血管 疾病，如高血压、屯、血管重构，屯、衰等的发病过程中，肾素-血管紧张素-醒固酬系统(RAAS) 的激活起着重要的作用，其中Angll是RAAS系统中关键的活性分子，Angll可通过激活ATI受 体，上调NADPH氧化酶的蛋白表达，诱导过多的自由基生成导致细胞衰老；也可通过下调抗 衰老基因 SIRT，降低线粒体的数量等多种方式诱导细胞衰老，在WRAAS系统激活为特征的 衰老损伤及相关性疾病中发挥着重要的作用。因此，在本实施例1中，我们WAngll诱导细 胞衰老为模型具有一定的代表性。
[0060] 端粒酶和β-半乳糖巧酶活性检测是目前最公认的细胞衰老检测手段。端粒是真核 染色体末端像帽子一样的特殊结构，可稳定染色体、防止染色体末端融合、保护染色体结构 基因及调节正常细胞生长。端粒酶则是帮助端粒合成的分子，使端粒的长度和结构得W稳 定，从而保护染色体。细胞随着端粒的变短而衰老，而当端粒酶的活性足W维护端粒的长度 时，细胞将会延迟衰老。0-半乳糖巧酶在人体大部分细胞上均有表达，且随着衰老的进程， 表达逐渐增加，因此β-半乳糖巧酶染色是常用的检测细胞衰老的指标。我们的研究结果发 现Ρ-3能够明显提高细胞生存率，增加端粒酶活性，减少β-半乳糖巧酶的细胞染色率，具有 良好的抗细胞衰老的作用。
[0061] SIRT1又称沉默信息调节因子相关酶1，是一种依赖于烟酷胺嚷岭二核巧酸的去乙 酷化酶，主要分布于细胞核内。现今的研究认为，SIRT1是一种长寿基因，是当今衰老领域的 分子学研究热点。当细胞发生损伤时，SIRT1可W通过去乙酷化ρ53，F0X0和Ku等蛋白W减轻 细胞调亡的趋势；除此之外，SIRT1可W通过控制新陈代谢，热量消耗，脂肪存储，维持氧化 应激下线粒体的正常功能W及抑制炎症等多个方面来延缓衰老。研究表明抑制SIRT1表达 会促进细胞衰老，敲除SIRT1后细胞死亡率明显增多；而激活其同源体的表达可W延长酵母 的存活期。在本研究发明中，我们发现P-3能够显著提高细胞中Sbtl的表达，对抗Angll诱 导的细胞衰老。
[0062]总之，本发明研究通过检测细胞存活率，β-半乳糖巧酶染色，端粒酶活性和抗衰老 基因 Sbtl的表达证明了海洋微生物来源的化合物Ρ-3具有良好的抗细胞衰老作用。
【主权项】
1. 海洋微生物来源化合物P-3在制备抗衰老药物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于是以肾素血管紧张素醛固酮系统激活或端粒 酶/SIRTl受损为特征的衰老损伤及相关性疾病。
【文档编号】A61P39/06GK105920580SQ201610281054
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】杜艳华, 庞冀燕, 王冠蕾
【申请人】中山大学