竹节参总皂苷在制备预防及治疗肝脏衰老的药物上的应用

竹节参总皂苷在制备预防及治疗肝脏衰老的药物上的应用
【专利摘要】本发明提供一种竹节参总皂苷在制备预防及治疗肝脏衰老的药物上的应用。竹节参总皂苷在制备预防及治疗肝脏衰老表现在随着年龄的增长，降低IL?1β、TNF?α蛋白和IL?1β、IL?6、1L?12、IL?17α、TNF?α、IFN?γmRNA的表达。所述的竹节参总皂苷包括人参皂苷Re、竹节参皂苷V、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa、竹节参皂苷2。本发明的竹节参总皂苷对自然衰老大鼠肝脏有保护作用，可能与其对抗肝脏炎症有关。
【专利说明】
竹节参总皂昔在制备预防及治疗肝赃衰老的药物上的应用
技术领域
[0001] 本发明提供一种竹节参总皂巧在制药中的应用，具体为制备预防及治疗肝脏衰老 的药物上的应用。
【背景技术】
[0002] 衰老是生物体普遍的生理现象，是一个及其复杂和多因子的过程，W许多器官渐 进的退行性变化为其主要特征。研究显示随着衰老的进行体内稳态并不能良好维持，而肝 脏是最容易受到影响的器官之一。在人和实验动物肝脏中，与衰老相关的形态学和功能学 的变化包括肝血流量，脂质积累，储存脂肪和产生细胞外基质的肝星状细胞的减少、肿胀W 及炎性因子的增加。慢性炎症已经被提议作为潜在的衰老W及与衰老相关的疾病的主要分 子机制，炎症细胞因子在肝脏疾病中的作用受到密切关注。其中包括化1类炎症因子：化-1 β、IL-12、IL-6、TNF-α、IFN-丫和Thl7类炎症因子：Iレ17α，运些炎症因子直接反映了肝脏内 的炎症状态。
[0003] 竹节参为五加科人参属植物竹节参化naxjaponicas C.A.Mey的干燥呈竹鞭状根 茎，具有滋补强壮、散疲止痛、止血桂疲的功效。竹节参总皂巧是从竹节参块根中提取分离 而得，是竹节参的主要活性成分之一。竹节参总皂巧（total saponins ofPanax japonicas，TSPJ)包括人参皂巧Re、竹节参皂巧V、竹节参皂巧IV、竹节参皂巧I化、竹节参皂 巧2等，多W齐墳果烧型五环Ξ祗为主，达玛烧型四环Ξ祗（原人参二醇、原人参Ξ醇型）相 对较少。现代药理学研究显示，竹节参总皂巧具有抗炎、抗肿瘤、降血脂等多种药理活性。前 期研究显示，竹节参总皂巧可W保护异烟阱、利福平、酒精W及四氯化碳所致的小鼠肝损 伤，竹节参对D-半乳糖所致的衰老具有保护效应。基于此，本研究建立大鼠自然衰老模型， 初步探讨竹节参总皂巧对自然衰老大鼠肝脏炎症的干预作用。

【发明内容】

[0004] 本发明提供一种探讨竹节参总皂巧干预自然衰老大鼠肝脏炎症作用的实验研究。 W自然衰老大鼠为对象，将SPF级SD大鼠按月龄分为3月龄组(3M组）、9月龄组(9M组）、15月 龄组（15M组）、24月龄组(24M组）、及24月龄的竹节参总皂巧(TSPJ)低、中、高剂量组，每组12 只大鼠。TSPJ低、中、高剂量组的大鼠从18M开始，分别给予竹节参总皂巧lOmg/kg、30mg/kg、 60mg/kg灌胃至24个月，每周停药一天，连续6个月。采用皿染色观察病理形态学变化，肝脏 生化指标检测，Western Blotting检测肝脏白介素1-0(比-10)、肿瘤坏死因子(TNF-a)的蛋 白表达，RT-PCR检测肝脏化-1β、白介素-6(比-6)、白介素-12(α-12)、白介素17a(IL-17a)、 TNF-a、干扰素-丫（IFN-丫）mRNA的表达。随着大鼠年龄的逐渐增长，肥染色观察发现肝组织 中肝索及肝血窦的排列素乱加重，脂肪空泡和炎症细胞增多，血清ALT、胆固醇、甘油Ξ醋明 显增高，TSPJ( lOmg/kg、30mg/kg、60mg/kg)各剂量组均能在一定程度上改善其病变情况，恢 复肝功能，降低血糖血脂；化-ie、TNF-a蛋白和化-1β、化-6、化-12、化-17α、TNF-a、IFN- 丫 mRNA的表达随着年龄的增长逐渐升高，TSPJ各剂量组均在一定程度上的降低其表达。竹节 参总皂巧对自然衰老大鼠肝脏有保护作用，与其对抗肝脏炎症有关。
[0005] 因此本发明提供一种竹节参总皂巧在制备预防及治疗肝脏衰老的药物上的应用。 所述的竹节参总皂巧包括人参皂巧Re、竹节参皂巧V、竹节参皂巧IV、竹节参皂巧I化、竹节 参皂巧2。
【附图说明】
[0006] 图1为不同年龄段及不同处理的大鼠肝脏图。
[0007] 图2为不同年龄段及不同处理的大鼠肝脏重量图。
[0008] 图3为TSPJ对自然衰老大鼠肝脏肥染色的影响。
[0009] 图4为TSPJ对自然衰老大鼠肝脏IL-li3、TNF-a蛋白表达的影响。
[0010] 图5为TSPJ对自然衰老大鼠炎症因子基因的影响。
【具体实施方式】 [00川实施例1 [0012]实验动物
[0013] SPF级雄性SD大鼠，购自Ξ峡大学实验动物中屯、，动物分笼饲养于空调室内，室溫 (22 ± 2 rC，湿度(60 ± 5) %，喂标准颗粒饲料，自由饮水和摄食。
[0014] 实验药物和试剂
[0015] 竹节参的块根购于湖北省恩施椿木营竹节参种植基地，经湖北省天然产物研究与 开发重点实验室邹坤教授鉴定其为五加科人参属植物竹节参化naxjaponicas C.A.Mey。竹 节参总皂巧（total saponins ofP. japonicas，TSPJ)是由本研究团队提取分离，其提取分 离方法参照前期研究方法(袁下，张长城，何銃敏，王洪武，胡远浪，孙志伟，赵海霞，李玉洲. 一种竹节参皂巧和多糖的提取分离方法[P].湖北:〔化018383384,2010-09-22.);总1?^八提 取试剂盒、逆转录试剂盒和PCR扩增试剂盒，大连宝生物科技有限公司；PCR引物，生工生物 工程(上海)股份有限公司；羊抗β-actin、白介素-liKlL-lW，兔抗肿瘤坏死因子-a(TNF-a) 抗体，美国Santa Cruz公司，批号依次为：SC-4778，SC-13968，SC-1351。羊抗兔及兔抗羊 IgG-HRP，武汉科瑞有限公司；化学发光剂ECL，碧云天生物技术研究所。
[0016] 仪器
[0017] AL104型电子分析天平(梅特勒-托利多国际贸易有限公司）；ΤΡ1020脱水机化eica 公司）；ZB-J0020样品旋转浸透器(北京中兴百瑞技术有限公司）；化TRACUTR型超薄切片机 (奥地利莱卡公司）；CS-V1型摊片烤片机(孝感市宏业医用仪器有限公司）；DMIRB巧光倒置 生物显微镜(德国Leica公司）；CT15RT高速冷冻离屯、机(上海天美生化仪器设备工程有限公 司）；皿.S21-6-S恒溫水浴锅（上海新苗医疗器械制造有限公司）；WD-940加脱色摇床(北京 市六一仪器厂）；DYY-6C电泳仪(北京市六一仪器厂）；902PCR扩增仪(新加坡AB Applied Biosystems) ;Gene Genius凝胶分析系统（美国SYNG肥公司）。
[001引方法分组和给药
[0019]不同时间点购买3M大鼠，在Ξ峡大学实验动物中屯、常规喂养至不同月龄进行实 验。其中3M大鼠12只、9M大鼠12只、15M大鼠12只、18M大鼠48只，将18M大鼠分为4组，每组12 只，分别是衰老对照组，竹节参总皂巧(TSPJ)低、中、高剂量组。18M衰老对照组每天灌胃生 理盐水，每周灌六天停一天至24个月；TSPJ低、中、高剂量组分别给与竹节参总皂巧lOmg/ kg、30mg/kg、60mg/kg灌胃至24个月，每周灌六天停一天。实验前12小时禁食，饮水不限制。 实验过程、实验研究均遵循中国实验动物学会动物伦理委员会制定的指导原则和要求。
[0020] 血清生化指标测定:全自动生化仪测定
[0021] 肝脏肥染色
[0022] 大鼠处死后，完整取出肝脏组织，称重后用0.9%氯化钢注射液冲洗，予滤纸尽量 沾干，快速切取肝中叶标本，置入4%多聚甲醒中固定，统一进行脱水，石蜡包埋、切片，按标 准操作进行肥染色，光镜下观察结果。
[0023] 肝脏电镜观察
[0024] 取新鲜大鼠肝组织，放入装有预冷的生理盐水的玻璃培养皿中，经漂洗，除去肝脏 表面血液，用手术刀片迅速在肝右页距边缘1cm处，切取两块肝组织，大小为1 X 1 X 1mm，迅 速放入装有3%戊二醒固定液的玻璃小瓶中，4Γ固定，于1化内送至Ξ峡大学医学院电镜室 做进一步处理，制作成电镜观察标本，在H-7500型投射电镜（日立公司）下观察并拍照。
[00巧]Western Blotting检测蛋白的表达
[00%] 取50-100mg肝组织于1.5ml EP管中，每管加入1ml PBS，冰上快速剪碎肝组织， 100化离屯、10s，倒去上清液，如此反复至上清液接近无色，倒去上清液，然后每管加入适量 蛋白裂解液和PMSF(100:1)，轻轻混匀，加至玻璃匀浆器中，迅速娠磨呈乳白色无碎块即可， 4°C 120001·离屯、lOmin，取上清，加入1/5上清体积的5 X上样缓冲液，煮沸lOmin，进行 Western Blotting,检测肝组织IL-10、TNF-a蛋白的表达，Image J软件进行分析。
[0027] RT-PCR检测基因的表达
[00%]将提取RNA所需的用物均进行高压处理，泡酸后洗净的培养皿提前于150°C烘箱中 放置化，用前取出放在超净台内。取30-70mg肝组织于1.5ml EP管中，加入适量化i ZO1，在培 养皿中进行组织匀浆，4°C120(K)巧m离屯、lOmin，取上清，将其转至1.5ml EP管中，加入1/5上 清体积的氯仿，震荡30s，室溫静置5min，4°C120(K)r离屯、15min，将其转至新的EP管中，加入 同等体积的异丙醇，轻轻混匀，室溫静置5min，4 °C 1200化离屯、lOmin，弃去上清，加入1ml 75%乙醇于管中，洗涂沉淀，4°C 1200化pm离屯、lOmin，弃去上清，即得到RNA，按照反转录试 剂盒操作，得到DNA。按照PCR扩增试剂盒说明书进行扩增，扩增条件为:94 °C 5min，94 °C 30s、 53 °C 30s、72 °C 30s循环34次，72 °C 5min。产物经2 %琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的表达。
[0029] 表1 PCR引物序列
[0030]
[0032] 统计学分析
[0033] 采用SPASS 18.0统计学软件进行分析。计量资料用x±s表示，多组样本间采用方 差分析，WesternBlotting和RT-PCR数据采用Image J软件分析，P<0.05表示差异有统计学 意义。
[OOW 结果
[0035] 活体动物观察
[0036] 试验期间，3M大鼠精神状态好，活动正常，毛发光泽，肤色红润，大小便正常；随着 年龄的增长9M、15M和24M大鼠精神萎靡，喜静，活动明显减少，饲料消耗量比3M少，体重增长 较慢;TSPJ低、中、高剂量组大鼠比24M大鼠活跃，进食有所增加。
[0037] 肝脏大体观察如图1、2所示
[0038] 3M大鼠肝脏外观颜色呈鲜红色，边缘锐利，表面光滑；随着年龄的增长9MU5M和 24M大鼠的肝脏体积逐渐增大，边缘变纯，与周围组织黏连增加，切面呈油腻状;TSPJ低、中、 高剂量组大鼠肝脏体积略有减轻，外观色泽有所改善。
[0039] TSPJ对自然衰老大鼠血清生化指标的影响
[0040]
[0041] 注乂3 31，冲<0.05，*冲<0.01;￥8 24]\1，咕<0.05
[0042] 血清TG和TC的含量是高血脂症的重要指标。ALT能一定程度反映肝损伤。通过试剂 盒测定，由公式计算获得结果如表1知，与3月龄对照组(3M)比较，随着年龄的增长TG、TC、 ALT的水平也不断增高，到老年（24M)升高最明显(P<0.05)，说明老年肝脏的衰老及功能的 衰退;相对于老年组而言，给药组的TG、TC、ALT均有不同程度地降低，而且药物高剂量组降 低较为明显。
[0043] TSPJ对自然衰老大鼠肝脏肥染色的影响
[0044] 3M大鼠肝细胞排列紧密，镜下肝小叶结构完整，随着年龄的增长9M、15M、24M大鼠 肝脏汇管区炎性细胞、坏死细胞明显增多，细胞索排列素乱，脂滴和假小叶显著增加 。TSPJ 低、中、高剂量组在镜下观察发现TSPJ中剂量组的肝细胞和肝索的排列最为整齐，脂滴明显 减少，炎性细胞和坏死细胞数量显著下降。如图3所示。
[0045] TSPJ对自然衰老大鼠肝脏IL-li3、TNF-a蛋白表达的影响
[0046] 如图4显示，随着大鼠年龄的逐渐增长，肝脏组织IL-li3、TNF-a蛋白的表达逐渐增 加，TSPJ低、中、高剂量组能够明显的降低其表达。
[0047] TSPJ对自然衰老大鼠炎症因子基因的影响
[〇〇4引如图5所示，与3M大鼠肝脏相比，随着年龄的增长，化-1β、化-6、lL-12、IL-17a、 TNF-a和IFN-丫 mRNA表达明显增加，与24M相比，TSPJ低、中、高剂量组均能够降低其表达。
【主权项】
1. 一种竹节参总皂苷在制备预防及治疗肝脏衰老的药物上的应用。2. 权利要求1所述的应用，其特征在于，竹节参总皂苷在制备预防及治疗肝脏衰老表现 在随着年龄的增长，降低 IL-lKTNF-α蛋白和 IL-10、IL-6、lL-12、IL-17a、TNF-a、IFN_y mRNA的表达。3. 权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的竹节参总皂苷包括人参皂苷Re、竹节参 皂苷V、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa、竹节参皂苷2。
【文档编号】A61K36/258GK105998118SQ201610525860
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】袁丁, 张长城, 刘朝奇, 王婷, 周志勇, 顿耀艳, 赵海霞, 何毓敏, 向婷婷
【申请人】三峡大学