专利名称：联用填充剂和成纤维细胞生长介质的可注射组合物的制作方法
技术领域：
本发明是在开发用于治疗皱纹的注射用溶液的基础上完成的。本发明提出将经典的填充剂(例如透明质酸)与活化真皮的有明确组成的成纤维细胞生长介质相组合。
现有技术皮肤是一种不断更新并且包括多种细胞和专门结构的组织。长期与环境接触，皮肤形成了身体的保护屏障。此外，它还涉及许多生理过程，使身体能够维持固定的恒定温度。而且，皮肤在免疫系统中起到重要的作用，其保护身体远离疾病。在结构上，皮肤由三层组成-外层，表皮，-内层，皮下组织，-以及中间层，通常称为真皮。天然的人表皮主要由三种类型的细胞组成大部分的角质细胞和黑色素细胞以及朗格汉斯细胞(cellules de Langerhans)。作为外层的表皮起到对外源物的屏障作用。表皮本身具有5个不同的层；从最深层至最表层为-基底层或生发层(stratum germinativum),-马氏层(couche de Malpighi)或棘层(stratum spinosum),立层或颗|立层(stratum granulosum),-透明层(stratum lucidum)，以及-角化层或角质层(stratum corneum)。真皮为表皮提供固体支持并为其提供营养物。从本质上讲，真皮由成纤维细胞和细胞外基质(ECM)组成，所述细胞外基质主要由胶原蛋白、弹性蛋白和称为“基底物”的物质组成。所有这些组分均由成纤维细胞合成。还发现真皮中存在白细胞、红细胞，甚至组织巨噬细胞。此外，它还被血管和神经纤维所穿过。皮下组织或下皮(hypoderme)是一层脂肪和结缔组织，其覆盖神经和大血管。在老化过程中，各种特征标志出现在皮肤上，表明其结构和功能的改变。皮肤老化的主要标志是出现细纹和/或皱纹，其随着年龄增长而增加。这些皱纹可以是较深深度的或中间深度的或浅表的，尤其发生在鼻唇沟、眶周区、唇廓、前额和眉毛之间的区域(狮纹) (rides du lion)。这些皱纹和细纹被看作是皮肤表面的凹陷或皱褶。深度皱纹被认为是由于真皮-下皮改变引起的，而浅表皱纹可由真皮和可能的表皮改变来解释。皱纹常常是由于皮肤失去弹性(尤其是组织软化)以及不同厚度细纹的产生而引起的。当真皮失去弹性时，其被削弱并开始形成更深的皱纹。随着皱纹的产生，负责皮肤弹性和结构的胶原蛋白纤维随着金属蛋白酶的过度产生而失去其特性。这种异常量的酶将胶原蛋白基质降解，从而导致产生深度皱纹。因此，真皮随时间而变得更薄，特别是它的胶原蛋白层。其它因素(例如自由基、暴露于日光、污染、吸烟、酒精摄入或臭氧)可通过同样的激活金属蛋白酶和胶原蛋白分解的现象而损伤皮肤。近年来，对不想要的皮肤变化(特别是与老化有关的那些)的处理发展迅速并取得了巨大的进步。已提出多种处理方法，特别是注射天然或合成的物质，以修补皮肤改变。特别地，我们应该提到利用灭活的肉毒杆菌毒素(B0t0X )进行局部注射以及利用激光技术，或者将两种技术一起使用。这些技术方案的替代性方案是将填充产品(所谓的真皮填充物)注射到真皮中。 可利用不可再吸收的产品(例如聚丙烯酰胺凝胶或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)颗粒)进行这种填充。然而，这些化合物可导致炎性或超敏不耐受反应。由于这些原因，已考虑使用可再吸收的产品，例如蛋白质或脂类。目前，优选的技术方案是利用人体内存在的天然状态的物质，例如胶原蛋白或透明质酸，这是目前大多数市售产品的基础。然而，这些可再吸收产品具有在有机体内相当迅速分解的缺点，这降低了其疗效并且需要定期重复注射。天然的可再吸收产品的一个实例是透明质酸，其为一种优选的化合物。应该提及的是，透明质酸(HA)是真皮的天然成分，在真皮中它在维持水化和皮肤弹性方面起着重要的作用。然而，其数量和质量随着年龄增长而降低，导致皮肤干燥并变薄，然后起皱纹。由于透明质酸也非常易溶于水并在水中形成高粘度的溶液，因此它是最广泛使用的药品之一。目前，药品或医疗器械中使用的旨在用于治疗皱纹的透明质酸可以透明质酸钠或透明质酸钾凝胶的形式获得。然而，这些透明质酸钠或透明质酸钾凝胶是相当迅速地生物可再吸收的(通常4-6个月不等)，这意味着必须以规律的紧密间隔进行重复注射。为了延长透明质酸的作用时间，已开发出稳定形式的透明质酸。特别地，这些透明质酸是化学交联的HA凝胶。认为这种通过分子内或分子间桥接的交联延长了产品在真皮内的持续时间。作为替代，还考虑了包封透明质酸(W02008/147817)。此外，有关填充产品的最新进展都集中将用于该应用的多种活性成分相组合。已设想将透明质酸作为机械填充物与本文中有活性的经皮肤施用的其它物质相组合。例如，文献W02008/139122将HA与透明质酸体内降解作用抑制剂相组合，以确保保存一定量的所注射的HA分子。尽管市场上出现了不同的替代物，但仍需要开发可长时间确保有效皮肤修复并尽可能对皮肤无痛的技术方案。
发明内容
鉴于这种情况，申请人已采用了一种全新的方法。虽然现有技术主张将填充剂(例如透明质酸)与保护所述填充剂的药剂相组合， 但是本发明旨在以两个不同的水平起作用，以便重建良好的皮肤外观，特别是由此起到抗衰老作用。
本发明涉及将已知的“机械”填充剂与成纤维细胞生长介质相组合的注射用皮肤科、美容或治疗制剂。实际上，这意味着既起到物理地填充形成皱纹的不平整或褶皱的作用，又刺激真皮中成纤维细胞的生长。成纤维细胞也能在褶皱内生长并且另外合成有助于皮肤再生的物质，例如弹性蛋白和胶原蛋白。此外，所述生长介质很可能稳定并保护本发明的填充剂。因此，本发明组合的第一组分是机械填充剂，其主要功能是构建皱纹内的体积。在上下文中，特别可提及的有硫酸葡聚糖、弹性蛋白、胶原蛋白和透明质酸。合成填充剂(例如硅氧烷或聚氨酯凝胶)也是本发明涉及的。在寻求尽可能与皮肤相容的技术方案时，使用皮肤中存在的天然聚合物是优选的。这尽可能少地干扰真皮组成并降低变态或炎性反应的风险。当所述天然聚合物是透明质酸时，优势更大。已知透明质酸可以不同的形式存在盐、衍生物(例如酯类或酰胺类)、直链或化学交联形式。所有这些形式均可包括在本发明中。虽然交联延长了透明质酸分子在有机体中的寿命，但是这会影响其物理/化学特性、其生物学特性及其潜在的免疫原性。在寻求对于皮肤而言尽可能为中性的技术方案(也就是说仿生方案)时，非交联的透明质酸及其生理学上可接受的盐是优选的，因为这种分子是真皮的天然组分。透明质酸的生理学上可接受的盐特别意指钠盐和钾盐以及它们的混合物。所述填充剂(优选透明质酸)占组合物总重量的0. 07-3%,更优选0. 8-2. 5%。应当指出，所选透明质酸的交联度和分子量可取决于所针对的应用，尤其是待治疗皱纹的深度。本发明组合物的第二必要组分是成纤维细胞生长介质。对于该发明，成纤维细胞生长介质定义为不仅维持成纤维细胞存活而且还刺激其增殖的完全培养基。利用生长功能测定可确定指定培养基是否是本发明的成纤维细胞生长介质。特别地，本领域技术人员公知的合适的功能测定是利用WST-I试剂并在450nm处读取结果的活细胞密度比色观察法(Berridge，M. V.等(1996) :The Biochemical and Cellular Basis of Cell Proliferation Assays That Use Tetrazolium Salts. Biochemica 4, 15-19.)可商购的成纤维细胞生长介质的一个实例是补充有10重量％的细胞生长因子 FCS (胎牛血清)的DMEM标准培养基(Sigma)。一般而言，这种培养基含有动物或细胞来源的提取物，其实际上确实刺激成纤维细胞的生长，但是具有组成不明确或含有不可追踪来源的外源性因素的缺点，所述外源性因素例如FCS (牛垂体提取物)、细胞生长因子EGF (表皮生长因子)或FGF (成纤维细胞生长因子)、胰岛素或霍乱毒素、氢化可的松、哌嗪等。有利地，本发明中所用的成纤维细胞生长介质不含细胞生长因子或者动物或细胞来源的生物提取物，特别是当这些因子或提取物不能追踪来源和/或组成不明确时。表述“未追踪来源”或“不可追踪来源”意指生物材料的来源处于争议中和/或经所述生物材料所经受的处理不能被确认或核实。实际上，所述培养基优选不含动物或细胞来源的生物提取物、不含细胞化合物或生长因子或激素。
在一个优选的实施方案中，通过注射将尽可能与皮肤的天然组分相容的成纤维细胞生长介质引入真皮中。这是含组分的培养基，所述组分是生物真皮的(biodermiques) (皮肤中天然含有的)、仿生的和/或生物相容性的(对于皮肤而言是生物模拟或中性的)。所述培养基将为成纤维细胞特别提供含维生素、微量元素、氨基酸、无机盐、简单糖(例如葡萄糖、核糖、脱氧核糖)和/或复合物(例如“HA”)形式的最佳营养以及核酸组分(形成核苷酸和核苷所需的核苷酸碱基和戊糖)形式的天然生长因子。有利地，其生理 PH 值为 6. 5-7. 9,7. 4-7. 6，渗透压为 280_450m0sm，优选 300_350m0sm。应当指出，HA既可以是生长介质的组分，也可以是填充剂。不同的是HA的形式 (培养基中必须是透明质酸盐)和其量(培养基中的量要低得多)。根据一个特定的实施方案，所述培养基的所有组分都是皮肤中天然存在的(真皮组分)(constituants dermiques)。然而，为了刺激成纤维细胞的生长，可利用皮肤中不存在但却是天然的、可追踪来源并且组成明确的物质来富集这样的培养基。符合这一定义的物质为例如从乳中提取的肽混合物，或者MPC (乳肽复合物)，通过从乳中连续沉淀然后进行酶水解以分离出某些蛋白质来获得。将脱水粉末形式的该物质有利地以0. 5-5mg/ml、优选地以4-5mg/ml添加到培养基中。根据另一个优选的实施方案，本发明组合物中使用的成纤维细胞生长介质不含有 EDTA或其盐或作为金属蛋白酶抑制剂的硫辛酸。作为一个实例，本申请人已开发了满足该定义的复杂培养基，该培养基组合了如下约60种精确定量的组分
权利要求
1.用于皮下或皮内注射的组合物，其包含-硫酸葡聚糖、弹性蛋白、胶原蛋白、透明质酸、硅氧烷或聚氨酯凝胶填充剂；以及 -成纤维细胞生长介质，其不含有未追踪来源和/或组成不明确的任何细胞生长因子和任何动物或细胞来源的生物提取物。
2.权利要求1的组合物，其特征在于其由所述填充剂和所述成纤维细胞生长介质组成。
3.前述权利要求中任一项的组合物，其特征在于其为凝胶形式。
4.前述权利要求中任一项的组合物，其特征在于所述填充剂是透明质酸或其盐之一。
5.前述权利要求中任一项的组合物，其特征在于所述填充剂有利地是透明质酸并且占所述组合物重量的0. 07-3%。
6.前述权利要求中任一项的组合物，其特征在于所述成纤维细胞生长介质由真皮组分组成，并且有利地富含乳肽(MPC)混合物。
7.前述权利要求中任一项的组合物，其特征在于所述成纤维细胞生长介质包含 -核酸组分，-氨基酸， -简单和复杂的糖， -维生素，-以及含有微量元素和无机盐的无机级分。
8.包含权利要求1至7中任一项的组合物的注射器形式的试剂盒。
9.权利要求1至7中任一项的组合物或权利要求8的试剂盒，用于填充皱纹、细纹、皮肤凹陷和/或疤痕。
10.权利要求1至7中任一项的组合物用于制备旨在预防或治疗皮肤衰老的药品的用途。
11.用于填充皱纹和/或细纹的美容方法，包括注射至少权利要求1至7中任一项的组合物。
12.权利要求1至7中任一项的组合物，其作为组合产品用于同时、分开或依次施用，用于预防或治疗皱纹、细纹、皮肤凹陷和/或疤痕。
全文摘要
本发明涉及可用于皮下或皮内注射的组合物，其包含填充剂和成纤维细胞生长介质。
文档编号A61Q19/08GK102497851SQ201080032505
公开日2012年6月13日 申请日期2010年7月6日 优先权日2009年7月27日
发明者乌格斯·加托, 让-诺埃尔·托雷尔 申请人:让-诺埃尔·托雷尔