包含金属蛋白酶的去污剂组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含金属蛋白酶(E.C.3.4.24)的清洁和/或去污剂组合物。本发明进一步涉及所述金属蛋白酶在清洁工艺如洗碟和洗衣中的用途，且具体涉及在低温洗涤和蛋渍去除中的用途。此外，本发明涉及进行清洁，如洗碟和洗衣的方法。
【专利说明】包含金属蛋白酶的去污剂组合物
[000? ] 涉及序列表
[0002]本申请包含计算机可读形式的序列表，所述计算机可读形式通过提述并入本文。【技术领域】
[0003]本发明涉及包含金属蛋白酶(E.C3.4.24)的清洁和/或去污剂组合物。本发明进一步涉及所述金属蛋白酶在清洁工艺，如洗碟和洗衣中的用途。此外，本发明涉及进行清洁如洗碟和洗衣的方法。
[0004]发明背景
[0005]去污剂工业已在去污剂配制剂中应用不同酶超过30年，最常用的酶包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶，它们中每种均适于去除不同类型的污溃。除了酶之外，去污剂组合物通常包含成分的复杂组合。例如，多数清洁产品包含表面活性剂系统，漂白剂或助洗剂。尽管目前去污剂的复杂性，仍存在对于开发包含新的酶和/或酶共混物的去污剂组合物的需求。
[0006]金属蛋白酶是其活性绝对需要金属离子的蛋白水解酶。多数金属蛋白酶是锌依存性的，尽管某些使用其它过渡金属。金属蛋白酶广泛用于不同产业如食品和酿造工业。最良好表征的金属蛋白酶组之一是嗜热菌蛋白酶。嗜热菌蛋白酶属于M4家族金属蛋白酶，并已用于，例如肽合成工艺。为了此类应用，所述嗜热菌蛋白酶需要在高温具有活性，因此人们已经注目于增加其在高温的性能。在W02004/011619 (Stratagene)中，描述了具有改变的切割特异性的嗜热菌蛋白酶样蛋白酶的热稳定性变体。例如，一种称作嗜热菌蛋白酶的M4金属蛋白酶已被用作非特异性蛋白酶以获得供肽测序的片段，如例如EP0316725中描述的。其亦用作肽合成酶，如描述于W02000/37486，其公开了供产生人工增甜剂阿司帕坦(aspartame)的方法。另一种M4金属蛋白酶是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefa ciens)金属蛋白酶,亦称作Neutrase?,其已在多种食品和饲料产品中，和例如在酿造中用作添加剂很多年。该金属蛋白酶亦已描述用于去污剂和清洁组合物以及工艺，如描述于W02007/044993中，在去污剂中使用具储藏稳定性的金属蛋白酶，或W02009/058518，和EP I 288 282 (Unilever)，其描述了金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的共混物供用于洗碟。W02000/60042亦描述了含有金属蛋白酶的去污剂组合物。
[0007]然而，在去污剂工业中金属蛋白酶的使用非常受限，故人们已经注目于使用如金属蛋白酶Neutrase?和/或W02007/044993中提出的“NprE”。一般而言，金属蛋白酶在常规洗涤条件下和在常规去污剂组合物中非常不稳定。因此，在洗涤和清洁工艺中以及在去污剂中金属蛋白酶的使用受到限制。
[0008]人们对于改善洗涤工艺以使其更加环境友好的关注日增，导致全球出现了减少洗涤时间、PH和温度，减少会对环境造成不利影响的去污剂成分的量的趋势。本发明致力于解决这些以及其它重要的目的。
【发明内容】
[0009]本发明涉及金属蛋白酶在清洁工艺如洗衣和洗碟中的用途，并特别涉及在低温洗漆和去除蛋溃(egg stain)中的用途。本发明亦涉及包含金属蛋白酶的去污剂组合物和清洁组合物。
[0010]在一个具体实施方案中，本发明涉及金属蛋白酶在清洁工艺中的用途，其中所述清洁工艺在40 0C或更低，优选35 °C或更低，优选30 0C或更低，优选25 °C或更低，优选20 °C或更低的温度进行。[0011]在一个具体实施方案中，本发明涉及清洁方法，其包括使需要清洁的表面与金属蛋白酶在40 V或更低，优选35 V或更低，优选30 V或更低，优选25 °C或更低，优选20 V或更低的温度接触。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1显示M4域的比对。
[0013]发明详述
[0014]定义
[0015]术语“蛋白酶活性”或“肽酶活性”在本文中定义为通过水解在多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键从而降解蛋白的酰胺键的能力。
[0016]术语“金属蛋白酶”如用于本文中指在结合/活性位点具有一个或多个金属离子的蛋白酶。
[0017]术语“M4金属蛋白酶家族”或“M4金属蛋白酶”或“M4”如用于本文中意指根据Rawlings等,Biochem.J., 290, 205-218 (1993)属于M4金属蛋白酶家族，并进一步描述于MEROPS-(Rawlings 等，MER0PS:the peptidase database, Nucl Acids Res, 34Databaseissue, D270-272, 2006)中的多肽。所述M4金属蛋白酶是中性金属蛋白酶，其主要含有内肽酶。该家族中的所有酶结合单个、催化性锌离子。M4金属蛋白酶家族成员包含共同的HEXXH基序，其中组氨酸残基充当锌配体，而谷氨酸是活性位点残基。M4金属蛋白酶具有主要在中性pH的最适pH。M4金属蛋白酶家族包括例如Neutrase?(分类为MEROPS亚类M04.014),嗜热菌蛋白酶，Bacillolysin,弧菌溶血素(vibriolysin), pseudolysin, Msp妝酶，coccolysin, aureolysin, vimelysin, lambda 毒素中性妝酶 B，PA 妝酶(气单胞菌(Aeromonas)类型)，griselysin, stearolysin, MprIII (交替单胞菌属菌种(Alteromonassp.)菌株0-7)，pap6肽酶，中性肽酶(高温放线菌(Thermoactinomyces)类型)，ZmpA肽酶(伯克霍尔德氏菌属菌种(Burkholderia sp.)), zpx肽酶，PrtS肽酶(发光光杆状菌(Photorhabdus Iuminescens)), protealysin, ZmpB 妝酶(伯克霍尔德氏菌属菌种)。已对M4金属蛋白酶家族的多肽进行了进一步表征，且根据MER0PS，其目前包括至少二十二个亚类，对它们分配了独特的MEROPS ID (即M04.xxx形式的标识符)，以及非肽酶同源物和未分配的肽酶。
[0018]术语“嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶”如用于本文中意指(a)MEROPS亚类M04.001的M4金属蛋白酶；(b) MEROPS亚类M04.018的M4金属蛋白酶；(c) MEROPS亚类M04.021的M4 金属蛋白酶；(d)具有活性裂口基序(active site cleft)TG[TS] [QS]DNGGVH[TI]的M4金属蛋白酶；(e)具有活性裂口基序DPDHSKRYTG[TS] [QS]DNGGVH[TI]NSGI的M4金属蛋白酶；和(f)具有活性裂口基序:NT [TS] [QS] DNGGVH [TI] NSGI的M4金属蛋白酶。在这些基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。亦在上述基序中，括号的使用表示在特定位置上的备选的氨基酸选择。所述嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶在例如Barret等(1998)Handbook of proteolytic enzymes.Academic Press, pp.350-369 中有描述。已确定了几种TLP的氨基酸序列，且已解析了几种TLP的三维结构。人们已着眼于增加TLP的热稳定性，多篇公开文献描述了芽孢杆菌属(Bacillus)TLP的热稳定性,例如Veltman等，(1998)Biochemistry37 (15): 5312-9。TLP由α-螺旋C端域和主要由β-链组成的N端域组成。这些域通过中央α-螺旋连接。该螺旋位于活性位点裂口的底部，并含有数个催化上重要的残基，如已鉴定出了四个底物结合袋(substrate binding pocket) S2, S1, S1'和S2' (Hangauer 等(1984)Biochemistry23:5730-5741)。
[0019]术语“M7金属蛋白酶家族”或“M7金属蛋白酶”或“M7”或“snapalysin家族”如用于本文中意指属于根据Rawlings等，Biochem.J.，290, 205-218 (1993)所述，并在MEROPS-(Rawlings 等，MEROPS: the peptidase database, Nucl Acids Res, 34 Databaseissue, D270-272, 2006)中进一步描述的M7金属蛋白酶家族的多肽。蛋白酶家族M7包括一种金属内肽酶，snapalysin。snapalysin在中性pH具活性。其唯一已知的活性是切割脱脂乳的蛋白，从而在生长中的细菌菌落周围形成清晰的噬斑。锌结合于HEXXHXXGXXD序列基序中的两个组氨酸和一个天冬氨酸；谷氨酸是催化残基。M7蛋白酶具有由SignalP预测程序识别的明显的信号肽。其均具有可切割去的前肽。
[0020]术语“M35金属蛋白酶家族”或“M35金属蛋白酶”或“M35”或“deuterolysin家族”如用于本文中意指属于根据Proteolysis in Cell Function, ppl3-21, IOSPress, Amsterdam(1997), Rawlings 等,Biochem.J., 290, 205-218 (1993)所述，并进一步描述于 MEROPS-(Rawlings 等，MEROPS: the peptidase database, Nucl AcidsRes, 34Database issue, D270-272, 2006)M35金属蛋白酶家族中的多肽。家族M35成员在HEXXH基序中含有两个锌结合组氨酸和催化性谷氨酸。在组氨酸锌配体C端的GTXDXXYG基序中存在第三个锌配体，一个Asp (参见比对)。就此原因，该家族中的蛋白酶有时称作“aspzincin”，尽管其中第三个锌配体是Asp的肽酶亦存在于家族M6，M7和M64。
[0021]术语“分离的多肽”如用于本文中指从来源分离的多肽。在一个方面，所述变体或多肽为至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，最优选至少90%纯和甚至最优选至少95%纯，如通过SDS-PAGE确定。
[0022]术语“基本上纯的多肽”在本文中指多肽制备物，其按重量计含有最多10%，优选最多8%，更优选最多6%，更优选最多5%，更优选最多4%，更优选最多3%，甚至更优选最多2%，最优选最多1%，甚至最优选最多0.5%与其天然或重组结合的其它多肽物质，因此，优选所述基本上纯的多肽按制备物中存在的总多肽物质的重量计为至少92%纯，优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，更优选至少98%纯，甚至更优选至少99%，最优选至少99.5%纯，甚至最优选100%纯。本发明的多肽优选为基本上纯的形式。这可通过例如，藉由公知的重组方法或经典的纯化方法制备所述变体或多肽来实现。
[0023]术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
[0024]参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，TrendsGenet.16:276-277;http://emboss, org),优选 3.0.0 版或更新版本的 Needle 程序中所执行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443-453)来确定。使用的参数为缺口开放罚分(gap open penalty)为10,缺口延伸罚分(gap extensionpenalty)为 0.5 和 EBL0SUM62 (BL0SUM62 的 EMBOSS 版)取代矩阵。使用 Needle 标记为“最高同一'I"生(longest identity) ”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一'I"生百分t:匕，并计算如下:
[0025](同样的残基X100)/(比对长度一比对中缺口的总数)
[0026]就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，见上文；http://emboss, org),优选3.0.0版或更新版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970,见上文)来确定。使用的参数为缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下:
[0027](同样的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度一比对中缺口的总数)
[0028]术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽，其中所述片段具有蛋白酶活性。
[0029]术语“多肽的功能性片段”或“其功能性片段”用于描述来源于更长的多肽例如成熟多肽的多肽，且所述多肽在N端区和/或C端区经截短以生成亲本多肽的片段。作为功能性多肽，所述片段必须保持全长/成熟多肽的蛋白酶活性的至少20%，优选至少40%，更优选至少50%，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，和甚至最优选至少100%。可截短金属蛋白酶从而去除特定域以生成功能性片段，其可为从成熟金属蛋白酶去除少 于200个氨基酸的多肽，优选地，少于150个氨基酸，更优选少于120、100、80、60、40、30个氨基酸，甚至更优选少于20个氨基酸，和最优选少于10个氨基酸从成熟多肽去除。
[0030]术语“亚序列”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端去除一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸，其中所述亚序列编码具有蛋白酶活性的片段。
[0031]术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
[0032]术语“变体”意指在一个或多个(几个)位置包含改变，即一个或多个(几个)氨基酸残基的取代、插入和/或缺失的、具有金属蛋白酶活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在邻接着占据某位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。
[0033]术语“清洁组合物”和“清洁配制剂”指可用于从待清洁的物品如织物、地毯、餐具包括玻璃器皿、接触镜、硬表面如瓷砖、锌、地板、和桌表面、毛发(香波)、皮肤(肥皂和乳霜)、牙齿(漱口液、牙膏)等去除不合意的化合物的组合物。该术语涵盖为清洁组合物的合意的具体类型和产品形式(例如液体、凝胶、颗粒或喷雾组合物)选用的任何材料/化合物，只要所述组合物与用于该组合物的金属蛋白酶和其它酶相容即可。清洁组合物材料可考虑待清洁的表面、物品或织物，以及组合物对于使用时的清洁条件合意的形式而容易地作出选择。这些术语进一步指任何适于对任何物体和/或表面进行清洁、漂白、消毒和/或灭菌的组合物。该术语意图包括但不限于去污剂组合物(例如液体和/或固体洗衣去污剂和精纺织物(fine fabric)去污剂；硬表面清洁配制剂,如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗的；地毪清洁剂；烤箱清洁剂；织物清凉剂(fabric freshener);织物软化剂；和纺织品和待洗衣物预处理剂(pre-spotter)，以及洗碟去污剂)。[0034]术语“去污剂组合物”，除非另行指明，包括颗粒或粉末形式的通用或重质(heavy-duty)洗涤剂，特别是清洁去污剂；液体、凝胶或糊剂形式的通用洗涤剂，特别是所谓重质液体(HDL)类型；液体精纺织物去污剂；手洗洗碟剂(hand dishwashing agent)或轻质(light duty)洗碟剂，特别是那些高起泡(high-foaming)类型的；机洗洗碟剂(machine dishwashing agent),包括用于家用和公用(houshold and institutional use)的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂(rinse-aid)类型的；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗类型的，清洁条(cleaning bar),漱口液,义齿清洁剂,汽车或地毪香波,浴室清洁剂；毛发香波和毛发洗剂(hair shampoos and hair-rinse);沐浴液(shower gel),泡泡浴(foam bath);金属清洁剂，以及清洁助剂如漂白添加剂和“固色棒(stain_stick) ”或预处理类型的。
[0035]术语“去污剂组合物”和“去污剂配制剂”用于指旨在用于洗涤介质以供清洁经污染的物体的混合物。在一些实施方案中，该术语用于指洗涤织物和/或衣物(例如“洗衣去污剂”)。在其他实施方案中，该术语指其它去污剂，如用于清洁碟、刀叉等的那些(例如“洗碟去污剂”)。不意欲本发明限于任何具体去污剂配制剂或组合物。旨在除了根据本发明的金属蛋白酶之外，该术语还涵盖含有下述的去污剂:例如表面活性剂，助洗剂(builders),螯合剂,漂白系统或漂白组分，聚合物，织物调理剂(fabric conditioners)包括黏土、增泡剂(foam boosters)、抑泡剂(suds suppressors)、香料(perfumes)、晦暗抑制剂(tarnish inhibitors)、光学增亮剂(optical brighteners)、杀细菌剂(bactericides)、杀真菌剂(fungicides)、悬污剂(soil-suspending agents)、抗腐蚀剂(ant1-corrosion agents)、酶抑制剂或稳定剂(enzyme inhibitors or stabilizers)、酶活化剂(enzyme activators)、转移酶、水解酶、氧还酶、增蓝剂和突光染料(bluing agentsand fluorescent dyes)、抗氧化剂和增溶剂。
[0036]术语“织物”涵盖任何纺织品材料。因此，该术语旨在涵盖衣物，以及织物、纱线、纤维、无纺材料、天然材料、合成材料，和任何其它纺织品材料。
[0037]术语“纺织品”指机织织物，以及定长纤维(staple fiber)和适于转化为或用作纱线的细丝(filament)，机织、针织和无纺织物。该术语涵盖从天然以及合成(例如制造的)纤维制成的纱线。术语“纺织品材料”是纤维、纱线中间物(yarn intermediate)、纱线、织物和从织物制成的产品(例如衣物和其它制品)的上位术语。
[0038]术语“非织物去污剂组合物”包括非纺织品表面去污剂组合物，包括但不限于洗碟去污剂组合物，口腔去污剂组合物，义齿去污剂组合物，和个人清洁组合物。
[0039]术语“有效量的酶”指在特定应用中，例如在限定的去污剂组合物中达成所需的酶活性所必需的酶的量。此类有效量可由本领域一般技术人员方便地确定，并基于多种因素，如使用的具体酶，清洁应用，去污剂组合物的具体组成，和是否需要液体或干燥(例如颗粒、条)的组合物，等等。术语金属蛋白酶的“有效量”指例如在限定的去污剂组合物中达成合意水平的酶活性的前述金属蛋白酶的量。
[0040]术语酶“洗涤性能”指酶对洗涤的贡献，与不将酶添加至组合物的去污剂相比，提供额外的清洁性能。将洗涤性能在相应的洗涤条件下进行比较。酶的洗涤性能方便地通过其在合适的测试条件下去除某些代表性污溃的能力来量度。在这些测试系统中，可控制其它相关因素，如去污剂组合物，去污剂浓度，水硬度，洗涤力学，时间，PH和/或温度，使其模仿某个市场领域中的家庭应用的典型条件。
[0041]术语“水硬度”或“硬度(degrees of hardness) ”或“dH”或“。dH”如用于本文中指德国硬度(German degrees of hardnes)。一度定义为每升水10毫克的氧化钙。
[0042]术语“相关的洗涤条件”在本文中用于指实际用于去污剂市场领域中家用的条件，特别是洗涤温度，时间，洗涤力学，去污剂浓度，去污剂的类型和水硬度。
[0043]术语“改善的性质”用于指与不用该酶进行的相同工艺相比，在某个性质方面获得更好的最终结果。优选在本发明的工艺中改善的示例性质包括洗涤性能，酶稳定性，酶活性和底物特异性。
[0044]术语“改善的洗涤性能”用于指与不含酶或与参照酶相比，在相关的洗涤条件下从经洗涤的物品(例如织物或餐具和/或刀叉)去除污溃方面获得更好的最终结果，或相对于不含酶或相对于参照酶，获得相同的最终结果需要的酶更少(基于重量)。在此语境中，改善的酶性能也可以是在更短的洗涤时间内获得相同的效果，例如污溃去除效果，例如，所述酶在测试条件下更快地起效。
[0045]术语“保持的洗涤性能”用于指某种酶的洗涤性能，基于重量，在相关的洗涤条件下相对于另一种酶为至少80%。
[0046]术语“酶去污性”或 “去污性”或“去污作用”在本文中定义为相对于不含酶的相同去污剂，酶对去污剂增加的有利的作用。可由酶提供的重要的去污性益处有:在洗涤和/或清洁之后，污溃去除至不存在或仅存在极微的可见污物，防止或减少在洗涤工艺中释放的污物的再沉积(该作用亦称“抗再沉积”)，完全或部分地恢复原本是白色，但在反复使用和洗涤之后外观变为灰白色或浅黄色的纺织品的白度(whiteness)(亦称作增白的作用)。纺织品护理上的益处——其不直接涉及催化性污溃去除或污物再沉积的阻止——对于酶去污性上的益处也是重要的。此类纺织品护理上的益处的实例是:阻止或减少染料从一片织物至另一片织物或相同织物的另一部分的转移(亦称作染料转移抑制或抗返沾色(ant1-back staining)的作用)，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的起球或起毛(亦称为抗起球的作用)，改善织物柔度(fabric-softness),织物的颜色澄清和捕获于织物或衣物纤维中的颗粒状污物的去除。酶漂白是另一种酶去污性益处，其中催化活性一般地用于催化漂白组分如过氧化氢或其它过氧化物的形成。
[0047]术语“抗再沉积”用于本文中描述减少或阻止溶解或悬于洗涤液剂中的污物再沉积于经清洁的物体。再沉积可见于一次或多次洗涤循环之后(例如作为灰化(greying)、黄化(yellowing)或其它变色(discoloration))。
[0048]术语“辅助物质”意指对于合意的去污剂组合物的具体类型和产品的形式(例如液体、颗粒、粉末、条、糊剂、喷雾剂、片剂、凝胶或泡沫组合物)而选择的任何液体、固体或气体物质，所述物质亦优选与组合物中使用的金属蛋白酶相容。在一些实施方案中，颗粒组合物为“紧凑(compact) ”形式，而在其它实施方案中，液体组合物为“浓缩”形式。
[0049]术语“污溃去除酶”如用于本文中描述协助从织物或硬表面去除污溃或污物的酶。污溃去除酶作用于特异性底物，例如蛋白酶作用于蛋白，淀粉酶作用于淀粉，脂肪酶和角质酶作用于脂质(脂肪和油)，果胶酶作用于果胶，而半纤维素酶作用于半纤维素。污溃通常是不同组分的复杂混合物的沉积，其本身导致所述材料的局部变色，或在物体上留下粘性表面，粘性表面可吸引溶解于洗涤液剂中的污物，从而导致污染区域的变色。当酶作用于其存在于污溃中的特异性底物时，所述酶降解或部分降解其底物，从而协助在洗涤工艺中与所述底物结合的污物和污溃组分的去除。例如，当蛋白酶作用于草溃时，其降解草中的蛋白组分，并允许在洗涤过程中释放绿色/棕色
[0050]术语“减少的量”在本文上下文中意指组分的量少于在其它相同的条件下在参照工艺中会使用的量。在一个优选实施方案中，所述量减少例如至少5%，如至少10%，至少15%，至少20%，或如本文中另行描述的。
[0051]术语“低去污剂浓度”系统包括在洗涤水中存在低于约SOOppm去污剂组分的去污剂。亚洲例如日本去污剂通常视为低去污剂浓度系统。
[0052]术语“中等去污剂浓度”系统包括在洗涤水中存在约800ppm至2000ppm去污剂组分的去污剂。北美去污剂一般视为中等去污剂浓度系统。
[0053]术语“高去污剂浓度”系统包括在洗涤水中存在大于约2000ppm去污剂组分的去污剂。欧洲去污剂一般视为高去污剂浓度系统。
[0054]金属蛋白酶
[0055]本发明一般地涉及分离的金属蛋白酶的用途，尤其涉及M4金属蛋白酶的用途，所述金属蛋白酶包括Neutrase?和来自枯草芽孢杆菌的NprE,还包括嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶，M7金属蛋白酶，和M35金属 蛋白酶。
[0056]本发明人令人意想不到地发现金属蛋白酶在低温洗涤和蛋溃去除中特别有用。
[0057]已知金属蛋白酶具热稳定性，因此，金属蛋白酶在根据本发明的去污剂清洁组合物和工艺，如低温洗涤和蛋溃去除中具有活性是令人意想不到的。
[0058]在一个具体实施方案中，所述金属蛋白酶是Neutrase? (来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的 SEQ ID NO:1) (Uniprot:P06832),或与其具有至少 90%同一'I"生的多肽。
[0059]在一个具体实施方案中，所述金属蛋白酶是SEQ ID N0:2(Uniprot:P68736)的来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的NprE，或与其具有至少90%同一性的多肽。
[0060]在一个具体实施方案中，所述金属蛋白酶是嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶。根据本发明有用的例示性嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶包括:
[0061](a) MEROPS 亚类 M04.001 的 M4 金属蛋白酶；
[0062](b) MEROPS 亚类 M04.018 的 M4 金属蛋白酶；
[0063](c)MEROPS 亚类 M04.021 的 M4 金属蛋白酶；
[0064](d)具有活性裂口基序(active cleft motif)TG[TS] [QS]DNGGVH[TI]的 M4 金属蛋白酶；
[0065](e)具有活性裂口基序:DTOHYSKRYTG[TS] [QS]DNGGVH[TI]NSGI 的M4金属蛋白酶；和[0066](f)具有活性裂口基序:NT[TS] [QS]DNGGVH[TI]NSGI的M4金属蛋白酶。
[0067]在上述基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。亦在上述基序中，括号的使用表示在特定位置上的备选的氨基酸选择。本发明使用下式的例示性分离的嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶来说明。这些嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶中的一些是公众可获得的，或者是作为完整表达的蛋白，或在序列数据库中作为从基因组测序计划获得的开读框。
[0068]下面是用于说明本发明并可应用于本发明的所有用途的嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶的列表。
_9] 例示性嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶
【权利要求】
1.金属蛋白酶在清洁工艺中的用途，其中所述清洁工艺在40°c或更低，优选35°C或更低，优选30 V或更低，优选25 °C或更低，优选20 V或更低的温度进行。
2.权利要求1的用途，其中所述清洁工艺是洗衣工艺。
3.权利要求1的用途，其中所述清洁工艺是洗碟工艺。
4.前述任一项权利要求的用途，其中所述金属蛋白酶是包含活性裂口基序:TG[TS][QS]DNGGVH[TI]的嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶。
5.前述任一项权利要求的用途，其中所述金属蛋白酶是包含活性裂口基序:DPDHYSKRYTG[TS] [QS]DNGGVH[TI]NSGI的嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶。
6.权利要求1-3任一项的用途，其中所述金属蛋白酶是包含活性裂口基序:NT[TS][QS]DNGGVH[TI]NSGI的嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶。
7.前述任一项权利要求的用途，其中所述金属蛋白酶是选自下组的嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶: a)MEROPS亚类M04.001的M4金属蛋白酶； b)MEROPS亚类M04.018的M4金属蛋白酶；和 c)MEROPS亚类M04.021的M4金属蛋白酶。
8.权利要求1-3任一项的用途，其中所述金属蛋白酶是M7金属蛋白酶。
9.权利要求1-3任一项的用途，其中所述金属蛋白酶是M35金属蛋白酶。
10.前述任一项权利要求的用途，其中所述金属蛋白酶包含与SEQID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13的成熟多肽具有至少80%，优选至少85%，优选至少90%，优选至少95%序列同一性的氨基酸序列。
11.前述任一项权利要求的用途，其中所述金属蛋白酶包含与SEQID NO:1或2的成熟多肽具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
12.前述任一项权利要求的用途，其中所述清洁工艺在5.5至9，优选6至8的pH进行。
【文档编号】C11D3/386GK103476915SQ201280018800
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年2月15日 优先权日:2011年2月16日
【发明者】A.贝尼, J.C.F.诺特泽尔, R.T.伦哈德, P.R.奥斯特加德, E.P.弗里斯 申请人:诺维信公司