专利名称：抗菌、伤口愈合作用的壳聚糖/丝胶复合纳米纤维的制备方法
技术领域：
本发明属于复合纳米纤维伤口敷料的制备技术领域，具体涉及一种具有抗菌、伤口愈合作用的壳聚糖/丝胶复合纳米纤维的制备方法。
背景技术：
传统的伤口敷料是包扎伤口的用品，用以覆盖疮、伤口或其他损害的材料。它的主要功能是控制伤口的渗出液以及保护伤口免受细菌及尘粒的污染。目前比较常用的伤口敷料有植物纤维纱布、合成纤维纱布、薄膜类敷料、水凝胶敷料等，但是传统的伤口敷料本身没有抗菌性能，使用前必须消毒；生物相容性和降解性差，必须去除干净。随着社会的发展，人民生活水平的不断提高，传统的伤口敷料已经不能满足人们在伤口包扎上的需求。壳聚糖和丝胶复合纳米纤维敷料的出现可以很好的增强敷料的抗菌性质，复合纳米纤维敷料本身拥有很好的生物相容性，大大提高伤口愈合的速度。壳聚糖，一种聚阳离子、无毒、可降解的聚多糖生物高分子。由甲壳素脱乙酰获得，甲壳素是自然界仅次于纤维素的第二丰富的多糖聚合物。由于其原料丰富、生物相容性、可降解性、抗菌活性及对环境友好，近年来作为一种天然高分子医用材料已被广泛应用于生物医学领域。尽管壳聚糖有诸多优点，但是仅一种天然生物材料无法满足伤口敷料的多方面要求。壳聚糖和丝胶复合纳米纤维伤口敷料可以达到理想的愈合效果。丝胶是广泛存在于蚕的蚕丝腺中，它是包裹在丝素蛋白外的连续黏性层，由颗粒状和高分子蛋白质组成，具有黏性和类似凝胶的性质。由于它的生物相容性、可降解性、抗氧化、抗紫外、抗菌性质以及丝胶蛋白对细胞的增殖和黏附有促进作用，所以丝胶蛋白是一种理想的生物敷料。基于以上原因，本发明将利用静电纺丝方法制备具有优异伤口敷料性能的壳聚糖和丝胶复合纳米纤维。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗菌、伤口愈合作用的壳聚糖/丝胶复合纳米纤维的制备方法。这种抗菌、伤口愈合作用的壳聚糖/丝胶复合纳米纤维，直径为200nm 360nm,纤维连续、分布均匀；对生物细胞没有毒性、具有良好的生物相容性，并且能促进细胞生长；复合纤维具有很好的抗菌性；具有快速的伤口愈合作用，其制备过程包括如下步骤:(I)将壳聚糖和丝胶溶解在三氟乙酸或者90%质量分数的浓乙酸中，搅拌均匀至完全溶解，得到溶质质量分数为3wt% 7wt%的混合溶液，其中壳聚糖和丝胶的质量比为7:
2 1:1 ;(2)将上述混合溶液进行静电纺丝:将获得的混合溶液放入到电纺丝设备的玻璃喷丝管中，玻璃喷丝管的管头内径是1mm，电纺丝设备的工作电压为15 18千伏，以铝套为阳极，以铝箔为阴极接收产物，两极间的距离为10 15厘米，进行静电纺丝，从而在铝箔上获得复合纳米纤维膜；(3)将复合纳米纤维膜在100°C下真空干燥I 3小时，从而得到具有抗菌、伤口愈合作用的壳聚糖和丝胶复合纳米纤维。本发明的优点在于，通过静电纺丝技术将具有生物相容性、可降解性和抗菌性质的两种生物高分子壳聚糖和丝胶制备成直径分布均匀的复合纳米纤维，该制备过程简单易行，原料资源丰富，易实现工业化生产。复合纳米纤维不仅具备了传统天然生物高分子的一切特点外，而且还拥有良好的生物相容性和抗菌性质，降解速度快，制备的壳聚糖和丝胶复合纳米纤维可以增强伤口敷料与创伤组织之间的相互作用，能够达到快速促进伤口愈合的作用。本发明在伤口敷料领域具有非常好的应用前景。本发明方法中所用的壳聚糖可从国药集团化学试剂有限公司购得，丝胶可从澳特丝生物科技有限公司购得，三氟乙酸可从阿拉丁试剂(中国)有限公司购得，乙酸可从北京化工厂购得。
图1:实施例7所制得的纳米纤维扫描电镜照片；图2:实施例21所制得的纳米纤维扫描电镜照片；图3:实施例2所制得的纳米纤维对大肠杆菌抑菌圈实验照片；图4:实施例20所制得的纳米纤维对枯草杆菌抑菌圈实验照片；图5:实施例2所制得的纳米纤维对于动物伤口愈合情况照片。如图1所示，实施例7所制得的纳米纤维扫描电镜照片，可以看出本发明制备的复合纳米纤维分布均匀、形貌良好，纤维直径约为290 330nm。如图2所示，实施例21所制得的纳米纤维扫描电镜照片，可以看出本发明制备的复合纳米纤维分布均匀、形貌良好，纤维直径约为300 330nm。如图5所示，实施例2所制得的纳米纤维对动物伤口愈合照片，可以看出将本发明制备的复合纳米纤维作为伤口敷料相比于空白对照组具有非常快的伤口愈合速度，3天后伤口完全愈合，说明本发明的复合纳米纤维具有快速促进伤口愈合的作用。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式
做进一步的详细说明。实施例1:分别称取0.3500g壳聚糖和0.1OOOg丝胶，全部溶解在13.8830g三氟乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是7:2、混合溶质总质量分数为3wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入静电纺丝设备的喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为10厘米，施加电压为16千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纳米纤维的直径约为200 260nm。使用小鼠成纤细胞L929作为研究的对象，取3个96孔细胞培养板(每个板对应着培养24h、48h、72h)。3个板中每个孔接种7000个细胞，接种6排，48h培养后换培养基，每孔加入180 μ L DMEM培养液。称取2.37mg纤维膜加入到0.474ml磷酸缓冲溶液中溶解，使其浓度为5mg/mL。从原溶液中吸取20 μ L膜溶液分别加入到第一排每个板的孔中，此时孔内膜的最终浓度为500μ g/mL。将原溶液用培养基稀释一倍后加入到第二排孔中得到250 μ g/mL的最终膜浓度，以下以此类推使5排的浓度分别为125 μ g/mL>62 μ g/mL>32 μ g/mL、16 μ g/mL、0 μ g/mL。24h、48h、72h后对应的板的孔中加入20 μ L MTT，在37°C下培养4个小时后再吸每个孔液体后直接加入150 μ L 二甲基亚砜，放入酶标仪中在492nm波长下进行测试。配制Luria-Bertani 液体培养基和 Luria-Bertani 固体培养基。Luria-Bertani液体培养基由胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、去离子水IOOOmL构成。Luria-Bertani固体培养基由胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、琼脂粉15g、去离子水IOOOmL构成。将培养基在高压蒸汽中灭菌15min。将革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌枯草杆菌菌种按体积比1:100分别接种于液体培养基中摇床过夜培养。将IOmL固体培养基倒入无菌培养皿中，待固体培养基冷却后取50 μ L过夜的上述菌液均匀涂在无菌培养皿中的固体培养基的表面。配制浓度为20mg/mL上述纳米纤维的无菌水溶液，将直径为6mm无菌滤纸浸泡在纳米纤维水溶液中30分钟后放置在涂有菌液的固体培养基表面上，在37°C恒温培养箱中培养24小时后观察抑菌圈大小反应抑菌情况。动物伤口愈合实验:称取0.0150g制备的纳米纤维置于红外压片模具中压片获得直径为13mm的复合纤维敷料垫。选取两只健康白鼠，用直径8mm的角膜环钻(使用前均已消毒)在两只鼠的腿部制造伤口，将复合纤维敷料垫覆盖在一只白鼠的伤口表面，另一只鼠作为空白对照，通过伤口愈合情况来反应复合纤维敷料的伤口愈合功效。应用MTT法体外测量本例制备的复合纳米纤维对小鼠成纤细胞L929的存活率，浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%，证明壳聚糖和丝胶复合纳米纤维对生物细胞没有毒性、具有良好的生物相容性，并且能促进细胞生长。通过上述抗菌实验方法，观察到本例制备得到的壳聚糖和丝胶复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是9.4mm，对枯草杆菌的抑菌圈是8.7mm。通过上述动物伤口愈合实验观察到复合纤维敷料处理的伤口 4天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例2:分别称取0.5000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在22.6330g三氟乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是5:2、混合溶质总质量分数为3wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为12厘米，施加电压为16千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为250 300nmo将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是9mm (如图3)，对枯燥杆菌的抑菌圈是8.4mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 3天后伤口完全愈合(如图5)，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例3:分别称取0.3000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在16.1667g三氟乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是3:2、混合溶质总质量分数为3wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为10厘米，施加电压为15千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为260 310nmo将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是8.7mm,对枯燥杆菌的抑菌圈是8mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 4天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例4:分别称取0.2000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在12.9330g三氟乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是1:1、混合溶质总质量分数为3wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为12厘米，施加电压为17千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为270 320nm。将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是8.3mm,对枯燥杆菌的抑菌圈是8mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 3天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例5:分别称取0.7000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在17.1OOOg三氟乙酸中，搅
拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是7:2、混合溶质总质量分数为5wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为10厘米，施加电压为18千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为220 270nmo将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是9.5mm,对枯燥杆菌的抑菌圈是8.3mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 5天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例6:分别称取0.5000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在13.3000g三氟乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是5:2、混合溶质总质量分数为5wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为12厘米，施加电压为17千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为280 320nm。将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是9.4mm,对枯燥杆菌的抑菌圈是8.5mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 4天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例7:分别称取0.3000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在9.5000g三氟乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是3:2、混合溶质总质量分数为5wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为10厘米，施加电压为15千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为290 330nm (如图1)。将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是9mm,对枯燥杆菌的抑菌圈是8.4mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 3天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例8:分别称取0.2000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在7.6000g三氟乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是1:1、混合溶质总质量分数为5wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为12厘米，施加电压为16千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°c下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为300 340nm。将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是8.8mm，对枯燥杆菌的抑菌圈是7.8mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 3天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例9:分别称取0.7000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在11.9570g三氟乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是7:2、混合溶质总质量分数为7wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为14厘米，施加电压为18千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为260 300nmo将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是9mm,对枯燥杆菌的抑菌圈是8.4mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 5天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例10:分别称取0.5000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在9.3000g三氟乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是5:2、混合溶质总质量分数为7wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为10厘米，施加电压为16千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为280 310nmo将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是8.8mm，对枯燥杆菌的抑菌圈是8.2mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 4天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例11:分别称取0.3000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在6.6430g三氟乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是3:2、混合溶质总质量分数为7wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为12厘米，施加电压为16千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为290 330nmo将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是8.7mm，对枯燥杆菌的抑菌圈是8.2mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 4天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例12:分别称取0.2000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在5.3140g三氟乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是1:1、混合溶质总质量分数为7wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为10厘米，施加电压为15千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为300 350nmo将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是8.4mm，对枯燥杆菌的抑菌圈是7.8mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 5天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例13:分别称取0.3500g壳聚糖和0.1OOOg丝胶，全部溶解在13.8830g90%质量分数的浓乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是7:2、混合溶质总质量分数为3wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为10厘米，施加电压为15千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为210 260nm。将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是9.3mm，对枯燥杆菌的抑菌圈是8.7mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 5天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例14:分别称取0.5000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在22.6330g90%质量分数的浓乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是5:2、混合溶质总质量分数为3wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为12厘米，施加电压为16千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为250 290nm。将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是9.1mm,对枯燥杆菌的抑菌圈是8.5mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 7天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例15:分别称取0.3000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在16.1667g90%质量分数的浓乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是3:2、混合溶质总质量分数为3wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为10厘米，施加电压为15千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为270 310nm。将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是9mm,对枯燥杆菌的抑菌圈是8.4mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 6天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例16:分别称取0.2000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在12.9330g90%质量分数的浓乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是1:1、混合溶质总质量分数为3wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为15厘米，施加电压为17千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为280 330nm。将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。
将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是8.4mm，对枯燥杆菌的抑菌圈是7.8mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 5天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例17:分别称取0.7000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在17.1000g90%质量分数的
浓乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是7:2、混合溶质总质量分数为5wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为14厘米，施加电压为18千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为230 280nm。将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是9.4mm,对枯燥杆菌的抑菌圈是8.5mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 5天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例18:分别称取0.5000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在13.3000g90%质量分数的浓乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是5:2、混合溶质总质量分数为5wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为12厘米，施加电压为16千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为250 290nm。将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是9.1mm,对枯燥杆菌的抑菌圈是8mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 5天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例19:分别称取0.3000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在9.5000g90%质量分数的浓乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是3:2、混合溶质总质量分数为5wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为10厘米，施加电压为15千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为240 300nm。
将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是8.8mm，对枯燥杆菌的抑菌圈是7.8mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 6天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例20:分别称取0.2000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在7.6000g90%质量分数的浓乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是1:1、混合溶质总质量分数为5wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为10厘米，施加电压为15千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为260 310nm。将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是8.6mm，对枯燥杆菌的抑菌圈是7.7mm (如图4)。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 6天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例21:分别称取0.7000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在11.9570g90%质量分数的浓乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是7:2、混合溶质总质量分数为7wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为11厘米，施加电压为17千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为300 330nm (如图2)。将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是9.3mm,对枯燥杆菌的抑菌圈是8.5mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 5天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例22:分别称取0.5000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在9.3000g90%质量分数的浓
乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是5:2、混合溶质总质量分数为7wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为10厘米，施加电压为15千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为300 340nm。将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是9mm,对枯燥杆菌的抑菌圈是8.4mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 6天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例23:分别称取0.3000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在6.6430g90%质量分数的浓乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是3:2、混合溶质总质量分数为7wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为12厘米，施加电压为16千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为300 350nm。将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是8.9mm,对枯燥杆菌的抑菌圈是8.4mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 5天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。实施例24:分别称取0.2000g壳聚糖和0.2000g丝胶，全部溶解在5.3140g90%质量分数的浓乙酸中，搅拌至完全溶解，得到混合溶质壳聚糖和丝胶的质量比是1:1、混合溶质总质量分数为7wt%的壳聚糖和丝胶混合溶液。将混合好的溶液放入喷丝管中，喷丝头的内径是I毫米，以铝套作为阳极，以铝箔作为阴极接收产物，两极间距离为15厘米，施加电压为16千伏进行纺丝。将得到的纳米纤维放在真空烘箱中100°C下干燥I小时后待用，得到的纤维直径约为310 360nm。将获得的复合纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行MTT法体外测量小鼠成纤细胞L929的存活率，结果表明浓度从16 μ g/mL 250 μ g/mL的五组纤维水溶液对L929细胞的存活率24h均大于90%、48h均大于95%、72h均大于100%。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行抗菌实验，观察到复合纳米纤维对大肠杆菌的抑菌圈是8.7mm,对枯燥杆菌的抑菌圈是8mm。将获得的纳米纤维膜按照实施例1中的方法进行动物伤口愈合实验，观察到复合纤维敷料处理的伤口 6天后伤口完全愈合，而空白对照12天后伤口完全愈合。
权利要求
1.一种抗菌、伤口愈合作用的壳聚糖/丝胶复合纳米纤维的制备方法，其步骤如下: (1)将壳聚糖和丝胶溶解在三氟乙酸或者90%质量分数的浓乙酸中，搅拌均匀至完全溶解，得到溶质质量分数为3wt% 7wt%的混合溶液，其中壳聚糖和丝胶的质量比为7:2 I:1 ; (2)将上述混合溶液进行静电纺丝，从而获得复合纳米纤维膜； (3)将复合纳米纤维膜在100°C下真空干燥I 3小时，从而得到具有抗菌、伤口愈合作用的壳聚糖和丝胶复合纳米纤维。
2.如权利要求1所述的一种抗菌、伤口愈合作用的壳聚糖/丝胶复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:静电纺丝设备玻璃喷丝管的管头内径是1mm，电纺丝设备的工作电压为15 18千伏，以铝套为阳极，以铝箔为阴极接收产物，两极间的距离为10 15厘米。
3.如权利要求1所述的一种抗菌、伤口愈合作用的壳聚糖/丝胶复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:复合纳米纤维的直径为200nm 360nm。
全文摘要
抗菌、伤口愈合作用的壳聚糖/丝胶复合纳米纤维的制备方法，属于复合纳米纤维伤口敷料制备技术领域。是将壳聚糖和丝胶溶解在三氟乙酸或者90%质量分数的浓乙酸中，然后进行静电纺丝获得复合纳米纤维膜；将复合纳米纤维膜在100℃下真空干燥1～3小时，从而得到具有抗菌、伤口愈合作用的壳聚糖和丝胶复合纳米纤维。由此方法制备的壳聚糖和丝胶复合纳米纤维形貌良好，纤维直径在200nm～360nm之间。本发明的优点在于制备的壳聚糖和丝胶复合纳米纤维具有良好的生物相容性、很好的抗菌性质和极佳的伤口愈合速度，在伤口敷料领域具有非常好的应用前景。
文档编号D01D5/00GK103194856SQ20131011361
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月2日 优先权日2013年4月2日
发明者李响, 赵锐, 王策 申请人:吉林大学