一种壳聚糖衍生物及其制备方法和应用与流程

本发明属于海洋化工工程技术，具体涉及一种壳聚糖衍生物及其制备方法和应用。

背景技术：

为应对人口增长所带来的粮食压力，在农业生产上长期大量的使用化学农药，由此所带来的环境污染、生态破坏问题越来越突出。同时，随着人们环保意识及食品安全意识的提高，因农药残留导致的食品安全问题也日益尖锐，农药残留引起的食品安全和绿色壁垒问题也日益成为人们关注的焦点，有害残留农药已严重影响农业的可持续发展和人类健康。研制高效、低毒、低残留的生物农药已迫在眉睫。

我国是一个农业大国，同时也是一个海洋大国，利用丰富的海洋生物资源，开发新型海洋生物源农药，是一个新的应用前景广阔的研究领域。甲壳素来源于虾、蟹、昆虫等节肢动物(甲壳纲、昆虫纲)的外壳或软体动物的外壳以及真菌、低等藻类的细胞壁。其含量丰富，可再生，是含量仅次于纤维素的第二大天然生物多糖。壳聚糖作为甲壳素的脱乙酰产物，具有无毒、生物相容性好、可自然降解等特点。有研究表明，用壳聚糖处理种子，能促进种子萌芽，提高发芽率，提高粮食作物分蘗数和出穗数，改善蔬菜品质提高产量。此外，壳聚糖还能抑制植物病原真菌，改善土壤微生物菌群，诱导植物光谱抗病性。以壳聚糖、寡糖为原料研制的海洋生物源农药已有多个产品面市。然而，由于壳聚糖为天然产物，其杀菌活性与化学农药相比差距甚大，且用量大，所以推广比较困难，限制了其应用。

硫元素是构成生命的重要元素，很多含硫化合物具有多种重要的生理活性。在植物保护中，许多高效的杀虫剂、除草剂、杀菌剂都是含硫化合物。二硫代氨基甲酸酯(盐)类化合物是一类应用广泛的高效农用杀菌剂。如缩氨基硫脲化合物具有广泛的生物活性,在农药界备受关注。研究表明,该类化合物及其衍生物具有抗细菌、抗真菌活性，能与多种金属离子形成稳定的配合物,且形成配合物后活性显著增强。然而，此类杀菌剂存在毒性大的缺点。因此，急需一种环境友好、能够综合壳聚糖及含硫的杀菌剂。

技术实现要素：

本发明就是针对上述问题，提供了一种结构新颖、抑菌活性好的壳聚糖二硫杂环类衍生物及其制备方法。

为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案为：

一种壳聚糖衍生物，壳聚糖衍生物为壳聚糖二硫杂环类衍生物如通式i或式ⅱ所示，

式i，n＝20-12000。式ⅱ中，或h2，n＝20-12000。

一种壳聚糖衍生物的制备方法：

当通式i所示衍生物的制备为：

(1)壳聚糖在醇与水的混溶液中，在碱的催化下，常温下，先与二硫化碳反应5-6h，再与溴甲烷反应12h，生成壳聚糖二硫丁烷杂环衍生物；其中，以壳聚糖单糖为基准，壳聚糖、碱、二硫化碳与溴甲烷的摩尔比为1:1.5-2:1.5-2:1.5-2；

当通式i所示衍生物的制备为：

(2)壳聚糖在醇与水的混溶液中，在碱的催化下，常温下，先与二硫化碳反应5-6h，再与1,2-二溴乙烷反应12h，生成壳聚糖二硫戊烷杂环衍生物；其中，以壳聚糖单糖为基准，壳聚糖、碱、二硫化碳与1,2-二溴乙烷的摩尔比为1:1.5-2:1.5-2:1.5-2；

当r＝h2，通式ⅱ所示衍生物的制备为

(3)壳聚糖先与溶剂中溶胀12h，再与过量氯乙酰氯与70-80℃下回流18h，反应后抽滤，滤饼用醇、去离子水洗涤，于50-60℃干燥后，得壳聚糖酰乙氯衍生物；其中，壳聚糖的质量与氯乙酰氯的体积比为1:8.5-9；

(4)将步骤(3)中的壳聚糖酰乙氯衍生物混悬于溶剂中，加入过量85％水肼，回流反应8-10h，反应后抽滤，滤饼用醇洗涤，于50-60℃干燥后，得壳聚糖酰乙肼衍生物；其中，壳聚糖酰乙氯衍生物与85％水肼的质量体积比为1:1-2；

当通式ⅱ所示衍生物的制备为：

(5)将步骤(4)中的壳聚糖酰乙肼在醇与水的混溶液中，在氢氧化钠的催化下，常温下，先与二硫化碳反应5-6h，再与溴甲烷反应8-12h，生成壳聚糖酰乙肼二硫丁烷杂环衍生物；其中，以壳聚糖单糖为基准，壳聚糖酰乙肼、氢氧化钠、二硫化碳与溴甲烷的摩尔比为1:1.5:1.5-2:1.5-2；

当通式ⅱ所示衍生物的制备为：

(6)将步骤(4)中的壳聚糖酰乙肼在醇与水的混溶液中，在氢氧化钠的催化下，常温下，先与二硫化碳反应5-6h，再与1.2-二溴乙烷反应8-12h，生成壳聚糖酰乙肼二硫丁烷杂环衍生物；其中，以壳聚糖单糖为基准，壳聚糖酰乙肼、氢氧化钠、二硫化碳与1,2-二溴乙烷的摩尔比为1:1.5:1.5-2:1.5-2。

所述制备通式i或通式ⅱ所示衍生物时，反应后抽滤，滤饼用醇洗，于50-60℃干燥，得纯化后通式i或通式ⅱ所示衍生物。

所述壳聚糖的分子量为3200-2000000。

所述步骤(1)、(2)、(5)和(6)中，反应溶剂中的醇为甲醇或乙醇，醇与水的体积比为1-4:1，其中，混合溶剂体积与壳聚糖质量比为25:1-2。

所述步骤(3)中，反应溶剂为三氯甲烷或二氯甲烷与吡啶的混合液，体积比为1:1；其中，混合溶剂体积与壳聚糖质量比为10:1。

所述步骤(4)中，反应溶剂四氢呋喃或n,n-二甲基甲酰胺，其中，溶剂体积与壳聚糖质量比为20:1-2。

所述醇洗所用的醇为甲醇或乙醇。

所述通式i或通式ⅱ所示所示衍生物在制备抑菌剂中的应用。

原理：壳聚糖分子的氨基或引入的肼基，可与二硫化碳发生亲核反应，生成氨基二硫代甲酸盐，在小分子单溴化物或多溴化物的存在下，再进一步发生亲电取代，最终生成2位取代的二硫环。

本发明的优点：

氨基二硫代甲酸酯类农药是农业上一大类杀虫、杀菌类的农药，其二硫活性基团，具有较高的活性，而二硫杂环就是二硫代甲酸酯类的衍生化方向之一；本发明采用活性亚结构拼接原理，以无毒、易降解的壳聚糖为先导化合物，将二硫杂环衍生物的生物活性基团引入到天然产物壳聚糖骨架中，使其产生协同效应，制备出抑菌活性得到显著提高，切具有诱导抗病活性的新型壳聚糖衍生物，同时合成的衍生物能保持壳聚糖天然无毒、易降解、生物相容性好的特性。以此来减少化学农药的用量、降低残留、减少污染，为开发新型生物农药的开辟了新途径。

附图说明

图1为壳聚糖的红外光谱图，其红外特征吸收(cm^-1)：1650，1589，1374，1315，1024，893。

图2为壳聚糖衍生物1的红外光谱图，其红外特征吸收(cm^-1)：1645，1539，1372，1311，1209，1024，894。

图3为壳聚糖衍生物2的红外光谱图，其红外特征吸收(cm^-1)：1591，1524，1373，1311，1025。

图4为壳聚糖衍生物3的红外光谱图，其红外特征吸收(cm^-1)：1646，1590，1373，1316，1058，1024，893：

图5为壳聚糖衍生物4的红外光谱图，其红外特征吸收(cm^-1)：1635，1521，1372，1312，1025。

图6为壳聚糖衍生物5的红外光谱图，其红外特征吸收(cm^-1)：1633，1584，1522，1373，1025，894。

具体实施方式

下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。

进一步的说通式i或式ⅱ所示衍生物的制备：

通式i衍生物：将壳聚糖混悬于甲醇或乙醇与去离子水的混合溶剂中，加入适量氢氧化钠溶液，常温搅拌1h，再滴加适量二硫化碳，常温反应5-6h，再加入溴甲烷或1,2-二溴乙烷的，常温反应12h；然后反应物通过抽滤、洗涤、干燥，即为壳聚糖二硫丁烷杂环或壳聚糖二硫戊烷杂环衍生物。加入的壳聚糖、氢氧化钠、二硫化碳与溴甲烷或1,2-二溴乙烷的摩尔比为1:1.5:1.5-2:1.5-2。

通式ⅱ衍生物：壳聚糖先制备成氯乙酰壳聚糖，再进一步制备成壳聚糖酰乙肼，以壳聚糖酰乙肼为原料按照通式i衍生物的合成过程，制得壳聚糖酰乙肼基二硫烷基环。氯乙酰的制备方法：按一定比例混合二氯甲烷或三氯甲烷与吡啶，加入壳聚糖，溶胀，再滴加氯乙酰氯，滴加完毕，升温回流，反应产物经过滤、洗涤、干燥，即为氯乙酰壳聚糖；反应溶剂二氯乙烷或三氯乙烷与吡啶的体积比为1:1，混合溶剂的体积与壳聚糖质量比为10:1，壳聚糖质量与氯乙酰氯的体积比为1：8.5-9，反应温度70-80℃，反应时间为18-20h，洗涤液为甲醇或乙醇、去离子水，干燥温度为50-60℃。壳聚糖酰乙肼的制备方法为：将氯乙酰壳聚糖与四氢呋喃或n、n-二甲基甲酰胺混合，加入85％水肼，加热，过滤，醇洗，水洗，干燥，即为壳聚糖酰乙肼；氯乙酰壳聚糖的质量与反应溶剂的体积比例为1:10-15，氯乙酰壳聚糖质量与85％水肼的体积比为1:2-5，反应温度60-70℃，反应时间8-10h，洗涤液为甲醇或乙醇、去离子水，干燥温度为50-60℃。

实施例1衍生物1的制备

将2g分子量为180万的壳聚糖加入到20ml乙醇中，加入5ml去离子水，搅拌，缓慢滴加2ml45％naoh溶液，滴加完毕，碱化1h；将1.035ml二硫化碳，缓慢滴加到上述反应体系中，常温反应5h；将1.5ml溴甲烷，加到上述反应体系中，常温反应6h；反应完毕，抽滤，滤饼用无水乙醇洗涤2次，用去离子水洗涤1次，60℃烘干，得2.2g，黄白色粉末，即为衍生物1：壳聚糖-2-亚胺-1,3-二硫丁烷。结构见通式ⅰ

红外光谱表明：壳聚糖衍生物1的红外谱图(图2)与壳聚糖的红外谱图(图1)相比，位于1589cm^-1的nh的特征吸收峰减弱，表明nh2已经发生反应；且1539cm^-1处出现为c＝n特征吸收峰；1209cm^-1处出现n＝c-s特征吸收峰；综上，证明衍生物1合成成功。

实施例2衍生物2的制备

将2g分子量为150万的壳聚糖加入到20ml乙醇中，加入5ml去离子水，搅拌，缓慢滴加2ml48％naoh溶液，滴加完毕，碱化1h；将2.5ml1,3-二溴乙烷，缓慢滴加到上述反应体系中，常温反应6h；反应完毕，抽滤，滤饼用无水乙醇洗涤2次，用去离子水洗涤1次，60℃烘干，得2.2g，米黄色粉末，即为壳聚糖-2-亚胺-1,3-二硫戊烷。即为衍生物2：壳聚糖-2-亚胺-1,3-二硫戊烷。结构见通式i

红外光谱表明：壳聚糖衍生物1的红外谱图(图3)与壳聚糖的红外谱图(图1)相比，位于1589cm^-1的nh的特征吸收峰减弱，表明氨基已经发生反应；且1524cm^-1处出现为c＝n特征吸收峰；综上，证明衍生物2合成成功。

实施例3衍生物3的制备

将20g分子量为180万的壳聚糖加入到200ml二氯甲烷与吡啶(1:1)的混合溶液中，溶胀12h；缓慢滴加120ml氯乙酰氯，65℃回流10h，补加60ml氯乙酰氯，继续回流8h，停止加热，将至室温，抽滤，滤饼用95乙醇洗涤2次，50％乙醇洗涤一次，抽滤，滤饼60℃烘干，得19.8g米黄色固体，即为氯乙酰壳聚糖。

取10g氯乙酰壳聚糖，加入到100ml四氢呋喃中，再加入8ml85％水合肼，搅拌，60℃回流8h，将至室温，抽滤，滤饼用95乙醇洗涤2次，常温真空干燥，得9.37g黄白色固体，即为壳聚糖酰乙肼。即为衍生物3：壳聚糖-酰乙肼。结构见通式ⅰ(r＝h2,n＝20-12000)

红外光谱表明：壳聚糖衍生物1的红外谱图(图4)与壳聚糖的红外谱图(图1)相比，位于1590cm^-1的nh的特征吸收峰增强，表明肼基连接上；且1646cm^-1处c＝o特征吸收峰增强；1058cm^-1、1024cm^-1处仍未三峰，表明环上羟基未取代，说明酰基连在壳聚糖-nh2上；综上，证明衍生物3合成成功。

实施例4衍生物4的制备

将10g分子量为180万的壳聚糖加入到100ml二氯甲烷与吡啶(1:1)的混合溶液中，溶胀12h；缓慢滴加55ml氯乙酰氯，65℃回流10h，补加30ml氯乙酰氯，继续回流8h，停止加热，将至室温，抽滤，滤饼用95乙醇洗涤2次，50％乙醇洗涤一次，抽滤，滤饼常温下真空干燥12h，得9g米黄色固体，即为氯乙酰壳聚糖。

取8g氯乙酰壳聚糖，加入到100ml四氢呋喃中，再加入5ml85％水合肼，搅拌，70℃回流8h，将至室温，抽滤，滤饼用95乙醇洗涤2次，常温真空干燥，得6.9g黄白色固体，即为壳聚糖酰乙肼。

取2g壳聚糖酰乙肼加入到20ml乙醇中，加入5ml去离子水，搅拌，缓慢滴加2ml46％naoh溶液，滴加完毕，碱化1h；将1.03ml二硫化碳，缓慢滴加到上述反应体系中常温反应5h；将1.3ml溴甲烷，加到上述反应体系中，常温反应10h；反应完毕，抽滤，滤饼用无水乙醇洗涤2次，用去离子水洗涤1次，60℃烘干，得2.2g，黄白色粉末，即衍生物4：为壳聚糖-酰乙基-2-亚肼-1,3-二硫丁烷。结构见通式ⅱ

红外光谱表明：壳聚糖衍生物1的红外谱图(图5)壳聚糖酰乙肼谱图(图4)相比，位于1590cm^-1的n-h的弯曲吸收峰减弱，肼基上有反应；且1521cm^-1处出现c＝n伸缩振动峰；1208cm^-1处出现n＝c-s特征吸收峰；综上，证明衍生物4成成功。

实施例5衍生物5的制备

壳聚糖酰乙肼的制备同实施例4。

取2g壳聚糖酰乙肼加入到20ml乙醇中，加入5ml去离子水，搅拌，缓慢滴加2ml46％naoh溶液，滴加完毕，碱化1h；将1.03ml二硫化碳缓慢滴加到上述反应体系中，常温反应5h；将1.65ml1,3-二溴乙烷，加到上述反应体系中，常温反应12h；反应完毕，抽滤，滤饼用无水乙醇洗涤2次，用去离子水洗涤1次，60℃烘干，得2.0g，黄白色固体，即衍生物4：为壳聚糖-酰乙基-2-亚肼-1,3-二硫戊烷。结构见通式ⅱ

红外光谱表明：壳聚糖衍生物1的红外谱图(图6)与壳聚糖的红外谱图(图4)相比，位于1590cm^-1的n-h的弯曲吸收峰减弱，肼基上有反应；且1522cm^-1处出现c＝n特征吸收峰，1202cm^-1处出现n＝c-s特征吸收峰；综上，证明衍生物5成成功。

抑菌活性测定

采用生长速率法测定样品对辣椒疫霉(phytophthoracapsici)的抑菌活性。测试在3个样品浓度下即：100μg/ml、200μg/ml、400ug/ml，对辣椒疫霉的抑制效果。

实验以相同浓度的好普寡糖药剂(市售为2％的水剂)为阳性对照，以蒸馏水为阴性对照。将培养基均匀倒入2个直径为9cm的培养皿中，待完全凝固后，在每个培养皿中接种3块直径为5mm的菌饼。在27℃下培养48小时后，测量菌落直径，计算样品的抑菌率。每次处理设置2个培养皿，每皿接种3个菌落，对每个菌落测定最大直径(dmax)和最小直径(dmin)，取平均值为样品抑菌圈直径d样品，全部试验重复一次。根据下式计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(d空白－d样品)/(d空白－5)×100％

实验结果见表1

表1部分通式1壳聚糖衍生物对辣椒疫霉的抑制活性

根据以上数据和衍生物结构分析：

本发明的衍生物杀菌活性，与壳聚糖相比明显得到提高，且活性比商业化的杀菌剂好谱寡糖高，尤其是衍生物3和4，最高活性比伊维菌素高出18个百分点。同时，根据测量，活性基团的取代度为20％左右，若以此计算，在400mg/ml浓度下，活性基团的当量浓度为80mg/ml，在此当量浓度下，衍生物1和2同对照好谱寡糖400mg/ml的活性持平，而衍生物3、4和5，超过好谱寡糖此浓度下的活性很多。因此衍生物具有较好的杀菌活性，尤其是衍生物3和4，具有最高活性。本发明衍生物，二硫基团活性基团为小分子，切仅连接在20％左右的单糖上，空间位阻很小，不改变壳聚糖主要结构，因此不影响壳聚糖链的植物调节作用。故，本发明衍生物，同时具体杀菌作用，及植物调节功能，由此可发挥双重作用，提高效果。本发明的衍生物，以壳聚糖为基质。壳聚糖由天然多糖几丁质经脱乙酰得到，制备工艺简单，来源丰富易得，同时，天然无毒，与生物相容性好。在连接活性基团后，大量的氨基葡萄糖骨架，遮盖了二硫活性基团的毒性，所得产物低毒。重要的是，寡糖链不能被皮肤直接吸收，故对皮肤无毒，这是一般二硫代氨基甲酸酯(盐)类农药所不具备的优势。另外，壳聚糖能够被微生物利用作为碳源，易降解，能够迅速发挥杀菌作用，不易积累及残留毒性，因此对环境友好。相对于寡糖，壳聚糖的成本更低，更易衍生物处理，且本发明衍生物所含有的二硫代甲酸酯类活性基团，具有其他的杀虫、杀线活性。以壳聚糖为基质开发新的杀菌剂，是另一个热点方向。

综上，本发明为调高杀菌效果，为减少化学农药的用量、降低残留、减少污染，为开发新型生物农药的开辟了新途径。