一种纳米纤维膜及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物材料领域，涉及一种纳米纤维膜及其制备方法和应用，尤其涉及一种核壳结构静电纺丝纳米纤维膜及其制备方法和应用。

背景技术：

手术切除、化疗、放疗是目前癌症最常用的治疗策略，但是仍有较大的局限性，例如化疗药物超过正常组织耐受量后将产生毒性，药物进入实体肿瘤的量较低，以及放疗在临床治疗中的毒性，术后病人生存不佳。为了克服这些局限，纳米载体为基础的药物递送系统吸引了越来越多关注。相比于传统的药物注射，这些系统具有优先携带药物进入肿瘤组织的能力。在众多药物载体中，两亲性分子自组装形成核壳结构的胶束因其特殊的优点受到了广泛关注，它能够改善疏水性药物的溶解、延长血液循环时间、达到药物功能性释放。然而，静脉注射胶束从注射至靶细胞的途中仍会面临重重障碍，例如粘膜屏障，肝肾的快速清除效应，非靶器官的过度积累，进入肿瘤过分依赖EPR效应等。此外，胶束的优势——延长血液循环，有时可能导致的药物在非靶点溢出。所以，所负载药物的传递效率及治疗效果仍然是纳米胶束载体面临的重大挑战。

为了解决这些问题，原位药物递送至实体瘤成为一种较好的策略。原位载药能够保证肿瘤部位的药物浓度，延长药物作用时间，在保证治疗效率的同时减小了药物毒性，不仅如此，原位载药也减少了化疗药物的注射次数，改善了生活质量，提高了病人的生活质量。可植入的散装物(如块，膜，晶片等)和可注射的水凝胶是最常见的原位载药系统。但是，对于可植入的散装材料，其降解速率很难被调整，在药物释放和分布的可控方面仍面临挑战。

静电纺丝技术是一种制备纳米及微米纤维的简单通用方法，由于其药物加载方式简单易行，在静电纺丝处理过程中不同的药物及生物大分子很容易加载入纤维中，另外，药物在负载到纤维之中后不会发生变化，仍能保持其抗癌的性能，可以用来进行安全的原位癌治疗。因此，电纺丝制备的纳米纤维功能膜具有良好的临床应用前景。

目前，静电纺丝主要有三种载药方式，第一种是将药物与聚合物溶液事先混合，直接进行混合纺丝；第二种是先将聚合物溶液进行纺丝，纺丝完成后将药物涂抹在膜表面；第三种是采用同轴纺丝的方法，将药物混合在作为核的聚合物溶液中，纺丝得到核壳结构的纤维。三种方法相比，前两种均存在药物突释，而核壳结构的纺丝膜能很好地减少突释，达到药物缓释的效果。因此，利用核壳结构进行原位载药，可以有效的实现高抗肿瘤和低副作用，具有良好的临床应用前景。

CN103122583A公开了一种两亲性核壳结构的纳米纤维的制备方法，将静电纺丝和光固化技术相结合，用静电纺丝法制备出表面具有感光性引发剂的纳米纤维，涂覆上具有亲水性的单体进行聚合，制备具有内层亲油，外层亲水的核/壳结构的纳米复合纤维，经紫外光照固化成膜然，该纳米纤维膜需要经过特定聚合来得到亲水外壳结构，并且并没有包载药物。

CN104491932A公开了一种壳结构载药纳米防粘连膜及其制备方法，所述核/述核/壳结构载药纳米防粘连膜，由内核和外壳结构的纤维并联构成；其中：所述的内核包括治疗有效量的活性成分和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；所述的外壳为聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)，所述的外壳上设有微孔。在防粘连时对人体无超敏反应，同时与人体内的血液及周边组织具有亲和力，具有生物粘合性表面且无排异现象。

由于纺丝纤维膜的优势，对纺丝纤维膜的研究对于医疗领域具有重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种纳米纤维膜及其制备方法和应用，特别是提供一种核壳结构静电纺丝纳米纤维膜及其制备方法和应用，所述核壳结构静电纺丝纳米纤维膜具有原位抗癌功能，可植入、生物相容性好、对正常细胞无细胞毒性、具有很好的肿瘤治疗作用。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种纳米纤维膜，所述纳米纤维膜由具有核壳结构的纤维构成，内核由聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)和聚己内酯的混合纤维组成，外壳由明胶交联京尼平的纤维组成，所述内核负载有化疗药物。

优选地，所述纳米纤维膜的纤维直径为50-500nm，例如50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、90nm、100nm、120nm、150nm、180nm、200nm、220nm、240nm、260nm、280nm、300nm、340nm、380nm、400nm、440nm、480nm或500nm，优选100-300nm。

优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸与聚己内酯的质量比为1:9-9:1，例如1:9、1:8.8、1:8.5、1:8、1:7.5、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。将二者的质量比限定在上述范围是为了避免因某种聚合物过多或过少而影响纳米纤维的形成，同时根据二者的比例可以调控纤维的降解速率，以达到合适的降解速率。

优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸的重均分子量为7.8万-10万，例如7.8万、8万、8.2万、8.4万、8.6万、8.8万、9万、9.3万、9.5万、9.8万或10万。

优选地，所述聚己内酯的重均分子量为5万-8万，例如5万、5.3万、5.5万、5.8万、6万、6.3万、6.5万、6.8万、7万、7.3万、7.5万、7.8万或8万。

优选地，所述外壳的直径为100-200nm，例如100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm或200nm。

优选地，所述明胶和京尼平的质量比为6:1-10:1，例如6:1、6.3:1、6.5:1、6.8:1、7:1、7.4:1、7.8:1、8:1、8.3:1、8.5:1、8.8:1、9:1、9.3:1、9.5:1、9.8:1或10:1。明胶与京尼平的质量比直接影响二者的交联程度，从而影响外壳的降解速度。京尼平比例低时，明胶与京尼平交联不完全，外壳容易降解。

优选地，所述化疗药物为阿霉素、盐酸阿霉素或紫杉醇中的任意一种或至少两种的组合，优选阿霉素。

阿霉素属于广谱抗癌药物，对机体可产生广泛的生物化学效应。其作用机制主要是阿霉分子嵌入DNA而抑制核酸的合成。其应于乳腺癌、肺癌、软组织肿瘤、骨肉瘤、膀胱癌、睾丸癌、甲状腺癌、神经母细胞癌、肾母细胞癌、恶性淋巴癌和急性白血病，也可用于肝癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈部肿瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、食道癌及子宫内膜瘤等。

另一方面，本发明提供了如上所述的纳米纤维膜的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将聚乳酸-羟基乙酸和聚己内酯溶于有机溶剂中，向其中加入化疗药物，混合得到溶液A；

(2)将明胶加入醋酸和水的混合溶液中，而后向其中加入京尼平，得到溶液B；

(3)将溶液A和溶液B分别在室温下搅拌8h-20h；

(4)将步骤(3)得到的溶液A作为内核溶液，溶液B作为外壳溶液进行静电纺丝，得到所述纳米纤维膜。

优选地，步骤(1)所述有机溶剂为氯仿与乙醇的混合溶剂、六氟异丙醇或四氢呋喃中的任意一种。

优选地，所述氯仿与乙醇的混合溶剂中氯仿与乙醇的体积比为(5～10):3，例如5:3、5.5:3、6:3、6.4:3、6.8:3、7:3、7.3:3、7.6:3、8:3、8.5:3、8.8:3、9:3、9.3:3、9.5:3或10:3，优选7:3。

优选地，所述溶液A中聚乳酸-羟基乙酸和聚己内酯两者的总质量体积分数为4～25w/v％，例如可以是4w/v％、5w/v％、8w/v％、10w/v％、12w/v％、15w/v％、18w/v％、20w/v％或25w/v％。所述质量体积分数过大或过小均会直接影响纳米纤维的形成。

步骤(1)将聚乳酸-羟基乙酸和聚己内酯溶于有机溶剂中是在磁力搅拌下完成的。

优选地，所述溶液A中化疗药物的质量分数为0.1-5wt％，例如可以是0.1wt％、0.5wt％、1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％、4wt％或5wt％。将化疗药物的浓度限定在此范围内是考虑到纺丝膜的应用，药物浓度过低会达不到预期抗癌效果，过高会对实验体产生毒性，存在安全问题。

优选地，所述溶液B中明胶的质量体积分数为5-30w/v％，例如可以是5w/v％、10w/v％、15w/v％、20w/v％、22w/v％、25w/v％、28w/v％或30w/v％。明胶浓度会直接影响核壳结构纤维中外壳的厚度，明胶浓度过高，外壳过厚，不利于药物的释放；明胶浓度过低，外壳厚度小，不利于核壳结构的形成。

优选地，所述溶液B中明胶与京尼平的质量比为6:1-10:1，例如6:1、6.3:1、6.5:1、6.8:1、7:1、7.4:1、7.8:1、8:1、8.3:1、8.5:1、8.8:1、9:1、9.3:1、9.5:1、9.8:1或10:1。

优选地，步骤(2)所述醋酸和水的体积比为1:1-9:1，例如可以是1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1或9:1。

本发明中，在静电纺丝前将溶液A和溶液B分别在室温下搅拌8h-20h，例如8h、9h、10h、12h、14h、16h、18h或20h，以保证聚乳酸-羟基乙酸和聚己内酯完全溶解，并与盐酸阿霉素充分混合，以及保证明胶与京尼平完全交联，但是如果时间过长，会导致有机溶剂的挥发，不利于溶液的稳定性。

优选地，步骤(3)所述搅拌为磁力搅拌。

优选地，步骤(3)所述搅拌的转速为150-600rpm，例如可以是150rpm、180rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm、400rpm、450rpm、500rpm、550rpm或600rpm。

优选地，步骤(3)所述搅拌的温度为室温。

优选地，步骤(4)所述静电纺丝包括以下步骤：

a、将溶液A和溶液B置于两个注射器中，分别利用推进器进行推动，采用同轴纺丝设备，待液滴稳定流下后调节电压至10-30kV；

b、以不锈钢滚轴为接收装置，持续纺丝得到完整纺丝膜。

优选地，步骤a所述溶液A的推进速度为0.1-3mL/h，溶液B的推进速度为0.3-24mL/h，且二者的推进速度之比为1:3-1:8。例如，溶液A的推进速度可以是0.1mL/h、0.5mL/h、1mL/h、1.5mL/h、2mL/h、2.5mL/h或3mL/h；溶液B的推进速度可以是0.3mL/h、0.5mL/h、1mL/h、2mL/h、3mL/h、4mL/h、5mL/h、10mL/h、15mL/h、20mL/h或24mL/h；二者的推进速度之比例如可以为1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5或1:8。推进速度过快会导致纺丝溶液滴出或纤维直径过大，速度过慢则会加长纺丝时间。溶液A、B的推进速度比则直接影响核壳结构的形成。

在本发明中，步骤a所述电压为10-30kV，例如可以是10kV、12kV、14kV、16kV、18kV、20kV、22kV、25kV、28kV或30kV。将电压限制在此范围内是为了保证连续的纤维的顺利形成，电压过低纺丝溶液无法形成纤维，电压过高则使纺丝过程不稳定，导致纺丝不连续。

优选地，步骤b所述接收装置的接收距离为8-25cm，例如可以是8cm、10cm、15cm、18cm、20cm、22cm或25cm。

优选地，步骤b所述不锈钢滚轴的滚动速度为500-1500rpm，例如可以是500rpm、800rpm、1000rpm、1200rpm或1500rpm。

优选地，步骤b所述纺丝时间为1-24h，例如可以是1h、2h、5h、8h、10h、15h、20h、22h或24h。将纺丝时间限制在此范围主要是为了控制纺丝膜的厚度。时间过短，膜过薄；时间过长，膜过厚，均会限制纺丝膜的应用。

优选地，对步骤(4)静电纺丝得到的纺丝膜进行冷冻干燥和真空干燥，而后包装消毒。

优选地，所述冷冻干燥的温度为-80℃～-20℃，例如-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、-30℃或-20℃。

优选地，所述冷冻干燥时间为12-24h，例如12h、15h、18h、20h、22h或24h。将冷冻时间控制在此范围内是为了尽可能除去有机溶剂。

优选地，所述真空干燥时间为24-72h，例如24h、36h、48h或72h。

作为优选技术方案，本发明所述的纳米纤维膜的制备方法具体包括以下步骤：

(1)将聚乳酸-羟基乙酸和聚己内酯溶于有机溶剂中，向其中加入化疗药物，混合得到溶液A，所述溶液A中聚乳酸-羟基乙酸和聚己内酯两者的总质量体积分数为4-25w/v％，化疗药物的质量分数为0.1-5wt％；

(2)将明胶加入体积比为1:1-9:1的醋酸和水的混合溶液中，而后向其中加入京尼平，得到溶液B，溶液B中明胶的质量体积分数为5-30w/v％，明胶与京尼平的质量比为6:1-10:1；

(3)将溶液A和溶液B分别在室温下搅拌8-20h；

(4)将步骤(3)得到的溶液A作为内核溶液，溶液B作为外壳溶液，将溶液A和溶液B置于两个注射器中，分别利用推进器进行推动，溶液A和溶液B的推进速度分别为0.1-3mL/h和0.3-24mL/h，且二者速度比为1:3-1:8，采用同轴纺丝设备，待液滴稳定流下后调节电压至10-30kV，以不锈钢滚轴为接收装置，接收距离8-25cm，静电纺丝1-24h，而后将得到的纺丝膜在-80℃～-20℃下冷冻干燥12-24h后，真空干燥24-72h，包装消毒，得到所述纳米纤维膜。

另一方面，本发明提供了所述纳米纤维膜在制备纳米抗癌材料中的应用。

本发明的纳米纤维膜可以作为载药纳米抗癌材料用于治疗癌症，其具有纳米核壳结构，可以主动靶向于肿瘤部位，其内核中负载的抗癌药物具有缓释的效果，产生持续的抗肿瘤疗效，增强对肿瘤的治疗作用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的具有核壳结构的静电纺丝纳米纤维膜的纤维直径小且均一，具有良好的机械性能，且生物相容性好，对正常细胞无明显的细胞毒性，具有良好的肿瘤靶向性，负载的抗癌药物具有缓释的效果，产生持续的抗肿瘤疗效，增强对肿瘤的治疗作用。

(2)本发明使用同轴静电纺丝技术制备纳米纤维膜，可以防止不稳定的化合物分解，可达到分子药物的持续释放，明显改善药物突释现象。此外，同轴静电纺丝技术具有一步成型的特点，在纤维成丝过程中，纺丝液溶剂快速挥发，使残留在核壳结构中的溶剂较少，静电纺丝膜以固体形式保存，保存期长，该制备方法简单、条件温和，成本低，易于推广和应用。

附图说明

图1A为实施例1制备得到的纺丝膜的扫描电镜图，标尺为1μm；

图1B为实施例2制备得到的纺丝膜的扫描电镜图，标尺为1μm；

图1C为实施例3制备得到的纳米纤维膜的扫描电镜图，标尺为1μm；

图2A为实施例3制备的纳米纤维膜的透射电镜图，标尺为200nm；

图2B为实施例4制备的纳米纤维膜的透射电镜图，标尺为200nm；

图2C为实施例5制备的纳米纤维膜的透射电镜图，标尺为200nm；

图3为实施例3制备的纳米纤维膜体外降解2周的SEM图，标尺为5μm；

图4为实施例3制备的纳米纤维膜负载的药物DOX的释放曲线；

图5为实施例7中通过CCK-8比色法测试得到的本发明的核壳结构纳米纤维膜对B16细胞活力的影响结果图；

图6为实施例8中利用倒置荧光显微镜观察到的不同处理组B16细胞生长情况图，其中A图为正常未处理的细胞组，B图为利用本发明的核壳结构纳米纤维膜处理的细胞组，C图为利用阿霉素处理的细胞组；

图7为PBS处理的肿瘤细胞(阴性对照)、经本发明的核壳结构纳米纤维膜处理的肿瘤细胞、外壳空膜处理的肿瘤细胞以及阿霉素处理的肿瘤细胞的生曲线；

图8为利用PBS、本发明的核壳结构纳米纤维膜、外壳空膜以及阿霉素处理后的肿瘤细胞大小的比较图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

在本实施例中，通过以下方法制备外壳部分的静电纺丝膜，具体包括以下步骤：

1)将7.5g明胶及0.75g京尼平溶于50mL醋酸和水(体积比9:1)的混合溶剂中，室温磁力搅拌12h，得到质量体积分数为16.5％的外壳溶液

2)将溶液进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，电压20KV，接收距离为15cm，纺丝液进液速率为1mL/h，纺丝5h。得到厚度为250μm左右的载药膜。

3)将得到的纤维膜浸于室温下通风橱中干燥72h，保证残余溶剂充分挥发。

对实施例1制备的纺丝膜进行扫描电镜观察，结果如图1A所示，该静电纺丝膜的直径在140-150纳米左右。

实施例2

在本实施例中，通过以下方法制备内核部分的静电纺丝膜，具体包括以下步骤：

1)将3g聚乳酸-羟基乙酸、3g聚己内酯溶于20mL六氟异丙醇中，再加入0.0625g DOX，室温磁力搅拌12h，得到质量体积分数为30w/v％的内核溶液。

2)将溶液进行静电纺丝，以不锈钢平桌为接收装置，电压20KV，接收距离为15cm，纺丝液进液速率为0.17mL/h，纺丝5h。得到厚度为250μm左右的载药膜。

3)将得到的纤维膜浸于室温下通风橱中干燥72h，保证残余溶剂充分挥发。

对实施例2制备的纺丝膜进行扫描电镜观察，结果如图1B所示，该静电纺丝膜的直径在70-80纳米左右。

实施例3

在本实施例中，通过以下方法制备核壳结构的纳米纤维膜，具体包括以下步骤：

1)将3g聚乳酸-羟基乙酸(重均分子量为8万)、3g聚己内酯(重均分子量为6万)溶于20mL六氟异丙醇中，再加入0.0625g DOX，室温磁力搅拌12h，得到质量体积分数为30w/v％的内核溶液A。

2)将7.5g明胶及0.75g京尼平溶于50mL醋酸和水(体积比9:1)的混合溶剂中，室温磁力搅拌12h，得到质量体积分数为16.5％的外壳溶液B；

3)将溶液进行静电纺丝，将溶液A和溶液B置于两个注射器中，分别利用推进器进行推动，溶液A和溶液B的推进速度分别为0.17mL/h和1mL/h，待液滴稳定流下后调节电压至20KV，以不锈钢滚轴为接收装置，接收距离为15cm，纺丝5h，得到厚度为250μm左右的纺丝膜。

4)将得到的纺丝膜在-20℃下冷冻干燥12h后，真空干燥24h，包装消毒，得到所述纳米纤维膜。

对实施例3制备的纳米纤维膜进行扫描电镜观察，结果如图1C所示，该静电纺丝膜的纤维直径在80-140纳米左右。

利用透射电镜对实施例3制备的纳米纤维膜进行表征，结果如图2A所示，所述纳米纤维膜具有核壳结构，外壳直径为175纳米，内核直径为145纳米。

实施例4

在本实施例中，通过以下方法制备核壳结构的纳米纤维膜，具体包括以下步骤：

1)将3g聚乳酸-羟基乙酸(重均分子量为10万)、3g聚己内酯(重均分子量为8万)溶于20mL四氢呋喃中，再加入0.0625g DOX，室温磁力搅拌12h，得到质量体积分数为30w/v％的内核溶液A。

2)将7.5g明胶溶于50mL醋酸和水(体积比9:1)的混合溶剂中，室温磁力搅拌12h，得到质量体积分数为15％的外壳溶液B；

3)将溶液进行静电纺丝，将溶液A和溶液B置于两个注射器中，分别利用推进器进行推动，溶液A和溶液B的推进速度分别为0.17mL/h和0.034mL/h，待液滴稳定流下后调节电压至20KV，以不锈钢滚轴为接收装置，接收距离为15cm，纺丝5h，得到厚度为250μm左右的纺丝膜。

4)将得到的纺丝膜在-20℃下冷冻干燥12h后，真空干燥24h，包装消毒，得到所述纳米纤维膜。

利用透射电镜对实施例4制备的纳米纤维膜进行表征，结果如图2B所示，所述纳米纤维膜具有核壳结构，外壳直径为145纳米，内核直径为71纳米。

实施例5

在本实施例中，通过以下方法制备核壳结构的纳米纤维膜，具体包括以下步骤：

在本实施例中，通过以下方法制备核壳结构的纳米纤维膜，具体包括以下步骤：

1)将4g聚乳酸-羟基乙酸(重均分子量为7.8万)、4g聚己内酯(重均分子量为5万)溶于20mL氯仿与乙醇的混合溶剂(氯仿与乙醇的体积比为7:3)中，再加入0.0625g DOX，室温磁力搅拌12h，得到质量体积分数为40w/v％的内核溶液A。

2)将7.5g及0.75g京尼平明胶溶于50mL醋酸和水(体积比9:1)的混合溶剂中，室温磁力搅拌12h，得到质量体积分数为16.5％的外壳溶液B；

3)将溶液进行静电纺丝，将溶液A和溶液B置于两个注射器中，分别利用推进器进行推动，溶液A和溶液B的推进速度分别为0.17mL/h和1mL/h，待液滴稳定流下后调节电压至25KV，以不锈钢滚轴为接收装置，接收距离为15cm，纺丝5h，得到厚度为250μm左右的纺丝膜。

4)将得到的纺丝膜在-20℃下冷冻干燥12h后，真空干燥24h，包装消毒，得到所述纳米纤维膜。

利用透射电镜对实施例4制备的纳米纤维膜进行表征，结果如图2C所示，，所述纳米纤维膜具有核壳结构，外壳直径为155纳米，内核直径为133纳米。

实施例6

在本实施例中，通过SEM观察核壳结构纳米纤维膜的降解情况，其方法如下：

将一定量的实施例3制备得到的核壳结构纳米纤维膜放入装有20mL生理盐水的瓶里，拧紧盖并放在37℃的恒温培养箱里，14天取出来，置于37℃干燥箱干燥两天后，用冷场发射扫描电镜S4800做SEM。

图3为核壳结构纳米纤维膜体外降解2周的SEM图，由图3可以看出2周时，纤维结构已发生变化：部分纤维由于收缩作用而以扭曲形式叠加在一起，大多数纤维发生融合，直径显著增大，多孔空间结构发生塌陷。

图4为核壳结构纳米纤维膜负载的药物DOX的释放曲线，由图4可知，在pH 7.4的条件下，时间延长至144h(6天)，纤维释药量可达80％左右。

实施例7

在本实施例中，通过CCK-8比色法对实施例3制备的核壳结构纳米纤维膜对B16细胞活力的影响进行考察，其方法如下：

(1)细胞培养

将鼠源黑色素瘤细胞B16培养于含有10％胎牛血清的DMEM或1640液体培养基中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养。

(2)细胞活力测定

以1万细胞/孔密度，将细胞接种于48孔板中。贴壁24h后，将所有孔分为3组，向一组细胞加入含阿霉素质量分数为0.1wt％的核壳结构纺丝膜(来自实施例3)，同时另外一组按10μM加入盐酸阿霉素，第三组细胞不作处理，作为对照组。在分别处理1天、2天、3天后，撤掉培养基；每孔加入110μL，含10％(体积比)CCK-8的细胞培养液，在培养箱中孵育2h后，在酶标仪上测定450nm处吸光度值，600nm作为参比波长。每组吸光度值扣除空白溶液吸光度值后，每孔对应值除以对照组的吸光度值作为细胞活力。每组设置6个平行孔。

细胞活力测定结果如图5所示，与对照组相比，实施例3制备的核壳结构纳米纤维膜对B16细胞的活力有显著性影响，3天时其细胞活力降低至15％左右，说明有明显的细胞毒性。阿霉素直接处理组的细胞活力低于核壳结构纺丝膜处理组，说明纳米纤维膜存在药物缓释作用。

实施例8

在本实施例中，利用倒置荧光显微镜观察实施例3制备的核壳结构纳米纤维膜对B16细胞生长产生的影响，其方法如下：

(1)细胞培养

将鼠源黑色素瘤细胞B16培养于含有10％胎牛血清的DMEM或1640液体培养基中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养。

(2)细胞活性观察

以1万细胞/孔密度，将细胞接种于48孔板中。贴壁24h后，将所有孔分为3组，向一组细胞加入含阿霉素质量分数为0.1wt％的核壳结构纺丝膜(来自实施例3)，同时另外一组按10μM加入盐酸阿霉素，第三组细胞不作处理，作为对照组。在分别处理1天、2天、3天后，撤掉培养基；每孔加入PBS洗三次，再加入稀释1000倍的钙黄绿素染料，在培养箱中孵育40分钟后，在倒置荧光显微镜下观察细胞的数目及状态。

结果如图6所示，A图为正常未处理的细胞组，B图为利用本发明的核壳结构纳米纤维膜处理的细胞组，C图为利用阿霉素处理的细胞组，由结果可知，在倒置荧光显微镜下可以看到，核壳结构纳米纤维膜处理的细胞数目明显少于正常未处理组，而与阿霉素直接处理组类似。

实施例9

在本实施例中，对实施例3中制备的核壳结构纳米纤维膜的抑瘤效果进行测定，方法如下：

选取4-5周雌性C57小鼠，右后腿部位皮下接种1000万个鼠源黑色素瘤细胞B16，待肿瘤长到合适的大小后，将老鼠分为4组，一组为阴性对照，尾静脉注射PBS；一组尾静脉注射3mg mL^-1阿霉素100μL；另外两组分别手术植入实施例1和3中制备的外壳空膜及核壳结构纺丝膜。治疗之后，每隔两天用游标卡尺测量肿瘤大小。术后2周，处死所有小鼠，解剖得到所有肿瘤，分组拍照。

图7是肿瘤的生长曲线，图8是肿瘤大小图，可以看出植入纳米纤维膜的组的肿瘤生长明显受到了抑制，肿瘤抑制情况好于相同药量的静脉注射的阿霉素组。而植入外壳空膜组以及静脉注射PBS组肿瘤生长情况相近，都不能明显抑制肿瘤生长，说明本发明的载药纳米纤维膜可以有效抑制肿瘤生长。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。