基因检测方法

专利名称：基因检测方法
技术领域：
本发明涉及扩增的基因的检测方法，可应用于免疫学、分子生物学、诊断学等很多领域内。
随着近年来基因工程技术的进步，设计出很多大量扩增微量基因的方法。使用这些方法有可能扩增样品中的微量基因。人们了解最多的基因扩增方法是PCR(聚合酶链式反应)方法。此方法首先制备与含有目的基因的3′端和5′端的基因序列互补的基因片断(引物)，然后将引物和作为基因材料的碱基一起与样品混合，再让称之为DNA聚合酶的基因合成酶作用后，就可合成目的基因。此方法由如下3个反应的重复(通常20-40循环)构成，(1)通过热变性将DNA双链解离，(2)与引物退火，(3)通过DNA聚合酶合成互补链。此时加热使2条链的基因解离成一条链，由于使用的DNA聚合酶来自耐热菌，所以每一循环不用重新补给DNA聚合酶，只是通过温度变化使反应反复进行，就可进行基因扩增。利用这一方法可使目的基因几十万倍、几百万倍地扩增。
现在能自动进行扩增的热循环仪市场上有很多销售，在医学、诊断学、分子生物学等领域内广泛地应用。
如上所述，虽然确立了简便地扩增基因的方法，但作为检测扩增的基因的方法主要还是电泳方法。这种方法是将样品加到聚丙烯酰胺等凝胶上进行电泳，电泳后对凝胶染色，确认基因的有无，但这种方法费事、费时。尽管基因扩增几个小时就完成了，但由于基因检测费时间，所以用于全部的基因检测中的时间就要2天至3天。这种方法不适合处理多个检测样品，基因诊断方法在临床诊断方面不普及的理由之一就是这种基因检测方法太费工夫。近年来尝试用HPLC(高速液相色谱法)、毛细管电泳等检测扩增的基因，但想要处理很多检测样品时，这些方法的效果不好。
人们尝试通过粒子凝集法检测基因，现正开拓这种技术。例如，在美国专利第5104791号中报道首先准备2种与目的基因互补的基因片断，然后让它结合在粒子上，再将这种粒子与目的基因结合，使发生凝集，通过测定由于凝集产生的信号检测目的基因的存在以及存在的量。
但是，美国专利第5104791号的方法存在的问题是对于每个目的基因必须要将不同的2种基因片断结合在粒子上。从使用与目的基因互补的基因片断来看，该美国专利需要目的基因是一条链。通常DNA以双链状态存在，使用基因扩增法后得到的样品仍是双链基因。而该美国专利需要在一条链状态下操作，形成一条链后样品中还存在互补的基因，这当然就要与粒子上的基因片断进行竞争结合反应。由此招致检测灵敏度下降，作为测定方法不太令人满意。
另外，从原理上讲使用识别目的基因的抗体检测基因是可能的。虽说是用这种方法也可能检测由粒子凝集得到的基因，但可预想到其实施是相当困难的。基因通过4种碱基序列保存信息，即作为基因的组成成分只有4种碱基，制备只对特定碱基序列反应的抗体是困难的，同时识别某一基因序列的抗体也能与这段序列非常相似的别的基因序列部分反应。这一现象称之交差反应，这成为识别基因的抗体的大问题。即使用这一方法，也必须准备各种粒子，粒子上结合了对应于每个基因的2种以上的抗体，所以很难说这是一种简便的方法。
人们都知道基因中有时存在着突变，且突变往往与疾病有密切关系。
人们已经知道很多基因突变作为起因发病的疾病和成了危险因子的疾病。这些疾病当中有人们早就知道的地中海贫血病和血友病，还有近年知道的家族性肌萎缩侧索硬化症和家族性早老性痴呆病等。这些疾病中有的是由于基因中的微小的一部分的变异，有时是碱基序列中的一个碱基变异造成的，这样的变异称为点突变。检测这样的微小变异的方法现在采用的有DGGE法、SSCP法和RFLP法。DGGE法称之为变性剂浓度梯度凝胶电泳，利用发生点突变也会使双链基因的稳定性发生变化的现象，通过在有变性剂浓度梯度的凝胶上进行电泳来检测变异。而SSCP法叫作单链DNA多型高级结构解析法，利用单链DNA按照它的碱基序列呈现特有的高级结构的特点，扩增的双链基因解离为单链之后再进行非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，迁移率上就产生了差别，以此为原理进行检测。采用这个方法，数百个碱基中既使有一个碱基变异也可检测出迁移率上的差别。
变异的位置一定时，通过实施RFLP法有时也可检测其变异。这一方法称为限制酶片断长度多态性方法。某一变异在一定的部位发生，通过变异有时这一部位成了某一限制酶切断的部位，有时在正常情况下可切断部位由于变异成了切不断的部位了。而RFLP法正是利用了这一特征。扩增挟有变异部位的基因，使某一限制酶作用于扩增的产物，根据变异的有无，切断部位或出现，或消失，通过电泳可检测其变化。
这些方法虽然是连一个碱基的变异也可检测的很巧妙的方法，但无论那种方法其主体仍是通过电泳检测的，所以在迅速、简便以及处理多个检测样品方面并不优越。
本发明的目的在于提供一种简便、迅速地检测扩增后的基因的方法；提供不使用同位素的安全而且高灵敏度的检测系统；提供简便而迅速地检测包含在扩增后的基因中的变异的方法。
本发明者鉴于上述情况，深入研究的结果找到了一种检测扩增的基因的方法。首先使抗原或抗体结合于扩增时用的基因片断上，通过使用结合了识别其抗原的抗体或识别其抗体的抗原的粒子，或者使用表面上结合了与抗原或抗体特异结合的物质的粒子，利用产生的凝集现象，检测扩增的基因。
另外本发明者利用上述的基因检测法，对于扩增的基因含有突变的情形，通过在扩增后让限制酶作用，发现按粒子凝集的大小可以检测基因被切断还是没被切断，根据这一现象能够检测出基因的突变。
也就是说，本发明提供的基因检测法的特征在于将使用结合了抗原或抗体的基因片断扩增的双链基因与粒子反应，这种粒子是结合了识别上述抗原的抗体或是识别上述抗体的抗原的粒子，或者是结合了可特异地与上述抗原或抗体结合的物质的粒子，通过测定反应后粒子凝集的程度，检测目的基因。
关于本发明的基因检测法，其特征是将使用结合了抗原或抗体的基因片断扩增的双链基因与粒子反应，这种粒子是结合了识别上述抗原的抗体或是识别上述抗体的抗原的粒子，或者是结合了可特异结合上述抗原或抗体的物质的粒子，通过测定反应后粒子的凝集程度检测目的基因。若上述用于扩增的基因中存在突变部位时，本发明又提供了一种检测基因突变的方法。即让限制酶作用于基因，该酶因突变部位的存在而使切断样式发生变化，该基因或被切断，或未被切断，通过测定结果生成的粒子的凝集程度的变化，就可检测基因的突变。
本发明基因检测法的原理本发明的基因检测法的原理如下。本发明的基因检测法的梗概如

图1所示。
首先将抗原或抗体预先结合在作为基因扩增原料的基因片断上，将这种基因片断作为引物对某些基因进行扩增，若样品中存在目的基因，用结合了添加的抗原或抗体的基因片断作为原料通过基因扩增法就可大量制备目的基因。因为几乎所有扩增的基因都是由结合了抗原或抗体的基因片断制造出来的，所以其两端都结合着抗原或抗体。而且，抗原或抗体的结合位置不限于基因片断的末端，无论那个位置只要结合1分子抗原或抗体就可以。结合在末端时，则结合在与扩增的方向相反的一侧。
若将结合了对抗原或抗体具有亲合性的抗体或抗原的粒子添加到基因扩增后的样品中，使粒子与扩增的基因反应后产生凝集。生成的凝集可以目测也可测定其浊度、吸光度等，用激光照射流过鞘流室中的每个粒子，通过测定产生的散射光的强度也可了解凝集的程度。利用这一方法检测扩增的基因其检测灵敏度更高。另外，若将粒子直径作得再适当些，也有可能利用电阻法进行测定。但若考虑到检测器的堵塞等问题，最好还是用光学上的方法测定。凝集粒子的检测采用全自动免疫凝集测定装置(例如东亚医用电子株式会社制、PAMIA-30)通过光学测定凝集胶乳粒子的大小，可以迅速而且高灵敏度、高精度地进行。
在突变检测方面的应用本发明的检测基因突变的方法，是将抗原结合在作为基因扩增原料的基因片断上，使用这一基因片断对某些基因进行扩增，如果样品中存在含有变异部分的目的基因，则以结合有添加抗原的基因片断为原料，利用基因扩增法就可大量制备目的基因。因为大部分扩增的基因是由结合了抗原的基因片断制造出来的，所以其两端都结合着抗原，同时扩增的基因中含有变异部分。
将结合了对抗原有亲和性的抗体的粒子加入到基因扩增后的样品中，使它与扩增的基因反应就会生成凝集。生成的凝集可以通过目测，也可用仪器测定其浊度、吸光度等。若让它流过上述那样的鞘流装置，使激光照射流过的每个粒子，通过测定照射产生的前方散射光强度也可了解凝集的程度。
这时，由于扩增的基因中存在着突变，若是正常的检测样品，不能被切断的基因中出现某一限制酶的切断部位时，通过该限制酶作用于扩增的基因后，若是被切断则粒子的凝集程度降低，若是没被切断，则粒子的凝集程度没有变化。因此由于突变的存在不仅会新生成限制酶切断部位，而且因突变的存在有时在正常检测样品中可被特定的限制酶切断的部位也变得不能被切断了。所以，制备限制酶作用于基因扩增后的样品后得到的产物或不让酶作用的产物，然后通过研究对应于让酶作用和不作用的凝集反应可以了解该基因中有无突变。
另外，无论是在基因与结合抗体的粒子反应前或反应后添加限制酶都没关系。但反应前添加有利于直接使用市售的粒子凝集测定装置(例如，东亚医用电子(株)的PAMIA系列)。
通过本发明的方法能够检测的突变包括很多以前用RFLP法测定的家族性肌萎缩性侧索硬化症、家族性高胆固醇血症、红细胞酶异常症、血支友病等。本发明的方法与以前用电泳检测的RELP法相比较，使用本方法可以更简便地进行基因诊断。
作为结合在作为引物使用的与含有目的基因区域的3′端以及5′端的基因序列互补的基因片断上的抗原或抗体有很多种可以利用，但尽可能使用分子量小的，以避免基因扩增时的麻烦。从这个意义上讲最好是结合低分子的抗原、即半抗原，如生物素、FITC(异氰酸荧光素)等。
下面叙述使用结合了抗原的基因片断的情况。
结合抗原的基因片断可利用本行业众所周知的方法制备。例如，要制备生物素化的引物，利用生物素化核苷酸(BIOTINdXTM、从和光纯药工业(株)可得到)和通常的核苷酸，通过ABI社的自动合成装置可以合成。如上所述，生物素分子最理想是结合在3′末端和5′末端，但也不局限于此，只要不妨碍下面的扩增反应也可结合在引物的中间部分。而利用寡核苷酸生物素标记试剂盒(ァマシャム社制)等也可以在寡核苷酸的末端结合上1分子生物素。另外，想要的生物素化的引物也可委托宝酒造(株)等公司合成。
以结合了如上所述制备的抗原的基因片断作为引物，利用PCR等方法扩增基因。基因扩增可采用本行业众所周知的方法进行。例如运用结合抗原的引物，核苷酸混合物、DNA聚合酶，使用Perkin Elmer公司的热循环仪进行PCR反应，就可得到双链基因。
另外要制备结合了识别上述抗原的抗体或制备结合了与上述抗原特异结合的物质的粒子。
作为粒子可使用各种各样的粒子，但粒子流经鞘流室进行分析时，粒径均一是很重要的，为此目的人们认为粒径均一的胶乳粒子是最有用的。关于粒径，若是能检测凝集程度的粒子，就不太受限制，例如可使用从积水化学工业(株)得到的粒径为0.8μm的无泡的聚苯乙烯胶乳等。
作为结合于粒子表面的抗体可使用各种各样的抗体，本发明的理想的状态下，扩增的基因其两端有相同的抗原，从这点看使用相应于该抗原的单克隆抗体是可行的。通常不能单独应用于凝集法的单克隆抗体也可以通过使用这一方法用一种抗体引起粒子的凝集。
上述美国第5104791号专利，使用2种与目的基因互补的基因片断，让它与目的基因结合产生凝集。但这个方法存在的问题是对于每一个目的基因，粒子上必须结合两种不同的基因片断。而本发明的优点是用于检测的抗体结合粒子只要使用同样标记的抗原，只用一种基因片断就够了。所以，检测任意基因时也只用一种粒子就可检测，这是本发明的最大优点。
还有，本发明使用的抗体并不是对目的基因的抗体，可选择任意抗体，所以通过使用特异性高的抗体，或通过使用绝对进不到待测样品中的抗原，就能够准确、高灵敏度地进行目的反应。这也是本发明所能提供的测定系统。
另外，只要能与本发明使用的抗原特异结合的物质，不只是抗体，都可用于结合到粒子上。例如，可利用生物素-抗生物素蛋白或是生物素-链球菌抗生物素蛋白，配体-受体，糖链-凝集素，或是酶-抑制剂的特异结合，将其中一方结合在引物上，另一方结合在粒子上就可使用了。这种情况下，结合了抗原的引物必须不能妨碍基因扩增。
如上所述，本发明的优点是只要将相同抗原结合在引物上，无论要检测的目的基因是什么，用于检测的结合抗体粒子只要一种就够了。因为粒子上的抗体与结合在基因片断上的抗原结合，所以检测任意的基因时也只用一种粒子就可检测了。而且即使改变结合在每个引物的3′端和5′端的抗原也没关系。但必须准备结合了对应于各个抗原的抗体的粒子。为了使试剂的组成简单化，最好是将结合于引物上的抗原作成相同的。
可以采用本行业众所周知的方法将与抗体或抗原特异结合的物质结合到粒子上，如，物理吸附法，共价结合法等方法，其中物理吸附法操作简单。作为一般的方法，例如，可将抗体溶液与粒子悬浊液混合，4℃下让它反应一夜或在25℃下反应数小时来完成。
将扩增的双链基因与结合了一种物质的粒子反应，该物质是一种与识别上述抗原的抗体结合的或与上述抗原特异结合的物质。通过抗原抗体反应而产生粒子的凝集，获得2聚体，3聚体、4聚体等凝集体。每个凝集体或未凝集的粒子通过鞘流室时通过测定激光照射后生成的散射光强度就可知道凝集的程度。这些操作若采用上面例举的全自动免疫测定装置，则测定简便、快速。图2给出了采用这样的全自动免疫测定装置所得到的粒度分布。凝集体的存在表示样品中存在目的基因。采用本发明的方法可以简单地测定出目的基因的存在和存在的量。
可以使用本发明的基因检测法检测的目的基因不仅包括DNA，也包含RNA。例如目的基因是mRNA时，只要预先用逆转录酶制备出cDNA后就可以进行基因扩增。
以下用实施例详细说明本发明，但本发明的范围不局限于此。实施例1通过检测使用了生物素化引物的PCR产物来检测人基因组DNA。
生物素化引物的调制扩增人基因组DNA中β球蛋白区域的DNA(参照Saiki，R.K.等(1988)Science，239，487-491)，利用胶乳凝集检测其产物。
检测的样品是人白血球，引物是宝酒造(株)销售的β球蛋白引物试剂盒中具有与PC03和KM38引物相同的碱基序列的末端结合了1分子生物素的生物素化引物。通过PC03和KM38扩增的基因片断的大小是167bp。
作成的引物的碱基序列如下所示。
PC03-BiotinBiotin-ACACAACTGTGTTCACTAGCKM38-BiotinTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG-Biotin上面的生物素化引物是使用ABI社的自动合成装置合成的。样品制备使用人血液作为样品。柠檬酸三钠盐用作抗凝剂，将采集的血液离心分离(3000rpm，15分钟)取淡黄色层(buffy coat)。再用生理盐水稀释采取的淡黄色层，制成每10μl含有大约100000，10000，1000个白血球的样品，使用自动血球计数装置F-800(东亚医用电子株式会社)测定白血球数。因为血液中的DNA大部分是来自白血球，所以使用异硫氰酸胍方法(分子细胞生物学基础实验法，南江堂)从白血球中制备PCR用的DNA样品。基因扩增使用Perkin Elmer公司的热循环仪进行PCR反应。
用于PCR反应的溶液组成如下缓冲液(200mM Tris buffer，pH8.4；15mM MgCl21mg/ml BSA) 5μl精制水 39.5μl10mM d NTP混合液 1μl生物素化的引物(各10μM)各1μlPC03-BiotinKM38-BiotinTaq DNA聚合酶(Ampli TaqTM，宝酒造(株)0.5μl提取的DNA溶液2μl
PCR反应共进行20循环，每一循环反应如下94℃45秒，55℃25秒，72℃3分钟。
结合抗生物素抗体的胶乳的制备将粒径0.78μm的聚苯乙烯胶乳(积水化学社制)于10mM PBS，pH7.0缓冲液中配成5％(w/v)浓度的溶液，然后向里面加入抗生物素抗体(单克隆抗体Biodesign公司制)，比例是每1ml胶乳分散液加50μg。于4℃下反应24小时。然后离心(12000rpm，10分钟)，再添加与开始量相同的含1mg/mlBSA的0.1M PBS缓冲液使粒子分散。再进行一次离心，使粒子在同样的缓冲液中分散，就制成了结合抗生物素抗体的胶乳。凝集反应向10μl PCR反应后的样品中加入10μl结合了抗生物素抗体的胶乳粒子(0.5％)；再加入80μl含有1mg/ml BSA的0.1M磷酸缓冲液，于45℃下反应15分钟，然后测定胶乳粒子的凝集率。这个反应以及测定是利用全自动免疫测定装置PAMIA-30(东亚医用电子株式会社)，测定前方散射光强度。
凝集率用凝集的粒子数相对于总粒子数的百分数表示的。下面的表1给出了测定结果。就象表1所表明的那样即使从每10μl有1000个白血球的样品也可得到很高的凝集率。若是不含有白血球DNA的样品(用于PCR的溶液组成中不含提取的白血球DNA)，就不会形成胶乳凝集；若是含有白血球DNA的样品就会看到凝集。由此可以理解胶乳试剂通过与PCR产物的生物素反应而产生了凝集。白血球数(个/10μl) 100000 1000010000凝集率(P/T％) 43.240.5 35.93.4实施例2人血红蛋白基因突变的检测采用本发明的方法进行了人血红蛋白基因突变的检测。生物素化引物的制备引物用的是与宝酒造(株)销售的β球蛋白引物试剂盒的碱基序列相同的引物。其中，有6种部位不同的引物在销售，通过它们的组合可扩增9种不同大小的基因片段。
在本实施例中合成了与PC03和PC04引物相同的碱基序列，制备了其末端结合1分子生物素分子的引物，用作生物素化引物。利用PC03和PC04扩增的基因片断的大小是110bp。制备的引物的碱基序列如下PC03Biotin-ACACAACTGTGTTCACTAGCPC04CAACTTCATCCACGTTCACC-Biotin上面的生物素化引物是委托宝酒造合成的。试样配制用上述的一组引物可检测的突变有codon 17 mutant allele。(密码17变异的等位基因)这一突变是在无意义区发生了由A向T的突变，这一变异使用限制酶NheI，用RFLP法可以检测，也就是若是正常的检测样品通过这一组引物生成的PCR产物，用NheI是切不开的，酶作用后即使进行电泳也只在110bp处检测出一条带，但发生突变的检测样品出现了利用酶可以切断的位置，电泳上就变成了87bp带，若是混合样品就应出现两条带110bp和87bp。
样品制备根据Clin，Biochem，26 497-503，1993的方法进行。使用的样品有正常的人血液和已知在上述部位发生突变的人血液。
在基因组DNA提取时使用了Pharmacia公司的Rapid PrepGonomic DNA Isolation Kits for Blood制备出PCR使用的样品。基因扩增PCR是使用Perkin Elmer公司的热循环仪进行的，使用的试剂是宝酒造(株)的Gene Amp。
PCR反应液的组成如下缓冲液(200mM Tris Buffer，pH8.4，15mMMgCl21mg/ml BSA) 5μl精制水 39.5μl10mM d NTP混合液1μl生物素化引物(各10μm) 1μlTaq DNA聚合酶 0.5μl
PCR反应一个循环包括94℃1分钟，55℃2分钟，68℃2分钟，共进行35个循环。结合抗生物素抗体的胶乳的制备将粒径0.78μm的聚苯乙烯胶乳于20mM Tris-buffer pH7.0中配成5％(w/v)的浓度，然后向其中添加抗生物素抗体(单克隆抗体Biodesign公司制)。每1ml胶乳液加50μg抗体，于40℃下反应24小时。然后离心(12000rpm，10分钟)，再添加与起初同样量的含有1mg/mlBSA的0.1M PBS溶液使粒子分散。再进行一次离心，使粒子再在同样的溶液中分散制成结合抗生物素抗体的胶乳。凝集反应首先为了确认通过PCR基因是否扩增了，向10μl的PCR后的样品中加入10μl结合了抗生物素抗体的胶乳粒子(0.5％)，再加入80μl含有1mg/ml的BSA的0.1M磷酸缓冲液，于45℃反应15分钟后测定胶乳粒子的凝集率。测定采用了东亚医用电子(株)制全自动免疫测定装置PAMIA-30。
其次，为了进行突变的检测，取同样的PCR后的样品10μl，添加10μl缓冲液制成一种溶液，另外再取同样的10μl PCR后样品，但添加10μl含有Nhe I10个单位的缓冲液制成另一种溶液，将两种溶液在37℃温育过夜，然后各自进行与上述相同的操作，之后再与粒子反应，通过PAMIA-30测定。凝集率以凝集的粒子数占整个粒子数的百分比来表示。
测定结果如下所示，正常检测样品即使让限制酶作用凝集率也不变化，而密码17中有突变的检测样品，虽然不进行酶反应的样品的凝集率与正常检测样品一样没有太大变化，但让酶作用后，却看到了凝集率下降。这是由于在有突变的检测样品中因突变出现了NheI的切点，限制酶切断了PCR产物，使得胶乳引起的凝集反应下降。由此表明，利用胶乳凝集反应有可能检测出点突变。
不含限制酶的样品含限制酶的样品正常检测样品21.3％ 20.4％含突变检测样品 22.9％ 5.6％
凝集率(P/T)％(凝集的粒子总数/总粒子数)×100使用本发明可以简便、迅速而且高精度地检测出扩增后的基因。本发明的最大优点是若予先制备结合了一种与识别抗原的抗体或抗原特异地结合的物质，则不管目的基因的种类如何，只要用这种粒子就可测定目的基因的存在以及存在的量。同时由于本发明的基因检测法不使用同位素，所以很安全。本发明的基因检测法不仅可用于DNA的检测，也适用于RNA的检测，因此可用于爱滋病、肝炎等很多疾病的诊断，特别是它能迅速地进行许多样品的诊断，所以这种方法是非常有用的。
另外若使用本发明的检测基因中突变的方法，可以在非常短的时间内简便地检测出以前用RFLP等方法检测的突变。
附图的简单说明图1表示本发明的基因检测法的简图。
图2采用全自动免疫测定装置得到的粒度分布图。
权利要求
1.一种基因检测法，其特征在于，将使用结合了抗原或抗体的基因片断扩增的双链基因与一种粒子反应，该粒子是结合了识别上述抗原的抗体或是识别上述抗体的抗原的粒子，也可以是结合了与上述抗原或抗体特异结合的物质的粒子，通过测定反应后粒子的凝集程度检测目的基因。
2.一种检测基因突变的检测法，是将使用结合了抗原或抗体的基因片断扩增的双链基因与一种粒子反应，该粒子是结合了识别上述抗原的抗体或是识别上述抗体的抗原的粒子，也可以是结合了与上述抗原或抗体特异结合的物质的粒子，通过测定反应后粒子的凝集程度来检测目的基因，当用于上述扩增的基因中存在着突变部位时，使由于该突变部位的存在其切断形式发生变化的限制酶作用，酶作用后，基因被切断，或未被切断，通过测定结果生成的粒子凝集程度的变化，就可检测基因的突变。
3.权利要求1或2中记载的方法，其特征是上述粒子是粒径均一的胶乳。
4.权利要求1或2中记载的方法，其特征是通过用光照射流过鞘流池中的粒子产生的散射光强度来测定凝集程度。
5.权利要求4中记载的方法，其中散射光是前方散射光。
6.权利要求1或2中记载的方法，其中，结合于基因片断的是抗原，粒子表面上结合的是识别上述抗原的抗体。
7.权利要求6中记载的方法，其中，抗原是半抗原。
8.权利要求6或7中记载的方法，其中，抗体是单克隆抗体。
9.权利要求6-8中任一项记载的方法，其中，基因片断上结合的抗原是1种，而且粒子表面结合的抗体是1种单克隆抗体。
全文摘要
本发明提供一种简便、快速检测扩增后的基因的方法。其特征是将使用结合了抗原或抗体的基因片断扩增的双链基因与一种粒子反应，该粒子是结合了识别上述抗原的抗体或是识别上述抗体的抗原的粒子，也可以是结合了与上述抗原或抗体特异结合的物质的粒子。通过测定反应后粒子的凝集程度来检测目的基因。同时本发明也提供了利用上述方法检测基因中突变的方法。
文档编号C12Q1/68GK1163939SQ9710314
公开日1997年11月5日 申请日期1997年3月13日 优先权日1997年3月13日
发明者福田滋弘 申请人:东亚医用电子株式会社