专利名称：降解四氢呋喃的食油假单胞菌dt4及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株可降解四氢呋喃的食油假单胞菌(Pseudomonas01eovorans)DT4 及其应用。
背景技术：
四氢呋喃(THF)是工业上应用最为广泛的环醚化合物，其作为溶剂能溶解除聚乙 烯、聚丙烯及氟树脂以外的所有化合物，有“万能溶剂”之称；THF是抗感染类药和激素类药 的重要有机合成原料，其也可合成聚四氢呋喃用以生产氨纶弹性纤维和聚氨酯材料。2006 年，全球THF总消费量约为48万吨；我国约为10. 6万吨，预计2010年需求量可达21. 5万 吨。然而，THF是一种细胞色素酶P450抑制剂，可通过呼吸道、消化道、皮肤侵入机体，低浓 度时对皮肤和粘膜有刺激作用；高浓度时有麻醉作用、肝脏毒性和致死作用；长期的毒性 试验表明其对动物还有较强的致癌性；THF可抑制活性污泥中微生物的脱氢酶和好氧呼吸 作用，也影响磷酸酶、尿素酶和过氧化氢酶等的活性。随着THF消费量的逐年增加，THF的 环境污染问题日趋严重。美国地下水井中已发现有THF的污染；李海燕等发现我国某药厂 出厂水和某饮用地表水均存在THF的污染。因此，目前迫切需要一种行之有效的方法加以 去除。THF是含氧杂环类物质，通过一般的高级氧化如臭氧法难以将其降解。迄今，国 内外去除THF的方法主要有萃取-精馏法和渗透汽化_汽化渗透膜法，这些方法虽然都有 各自的优点，但设备投资与运行费用较高，不适宜于THF环境污染治理；由于其结构的特殊 性，THF 一度被认为是“不可生物降解的化合物”，多次尝试以微生物降解THF的试验均无 法成功。自从1991年德国学者Bernhardt和Diekmarm首次分离出一株能以THF为唯一 碳源生长的菌株Rhodococcus ruber 219，从而开启了 THF生物降解成为研究大门。菌株 R. ruber 219降解7. 5mM THF的速率为28. 5mg/(h *g)，然而当底物浓度大于10mM时，延滞 期和世代时间显著延长。Parales等报道一株放线菌CB1190能较快地降解THF，但世代时 间依然需要 llh0 Kohlweyer 等蹄选到了一株菌 Pseudonocardiatetrahydrofuranoxydans K1具有降解THF的能力，其在最适条件下以THF为底物生长的倍增时间为14h，并可以耐受 较高的THF浓度；但是当高于20mM时，即使额外添加氮源该菌也无法将THF彻底矿化。目 前报道的 THF 降解菌还有 Pseudonocardia sp. Ml、ENV478、以及 Cordyc印ssinesis。迄今尚未有假单胞菌降解四氢呋喃的报道。
发明内容
本发明针对现有四氢呋喃生物降解效率低、微生物世代时间长的不足，提供了一 株能高效降解四氢呋喃的菌株及其应用。本发明采用的技术方案是一株可降解四氢呋喃的食油假单胞菌(Pseudomonas Oleovorans)DT4，保藏于中 国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，430072，保藏日期2009年07月15日，
3保藏编号:CCTCC NO :M 209151。本发明所提供的THF降解菌P. Oleovorans DT4来源于绍兴某化工厂污水处理池 的活性污泥，经人工驯化、富集、分离所得到。该菌是一株革兰氏阴性菌，菌落特征如下菌 体呈短杆状，大小为(0.5 0.8) iimX (0.8 1.2) iim，无芽孢；菌落呈小圆状、透明、白 色、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长；氧化酶、硝酸盐还原、精氨酸双水解酶反 应为阳性；接触酶、V.P.反应、M.R.反应、吲哚反应为阴性；不能水解淀粉；糖发酵实验阴 性，革兰氏染色阴性，最佳生长温度37°C。本发明还涉及所述的食油假单胞菌DT4在降解四氢呋喃中的应用。具体的，所述应用为将食油假单胞菌DT4接种至含有四氢呋喃的废水或含四氢 呋喃的无机盐培养基中进行培养，对四氢呋喃进行降解。所述食油假单胞菌DT4可用于处 理含四氢呋喃的废水或废气。P. Oleovorans DT4能利用THF作为唯一碳源和能源生长，将THF完全矿化成C02 和H20。在纯培养条件下，该菌能在14h内能将无机盐培养基中10mM的THF完全降解。菌体培养及底物降解pH范围为5. 0 10. 5、温度范围为20°C 45°C。所述无机盐培养基每1000mL 含有Na2HP04 12H20 0. 1 6. 0g/L、KH2P04 0. 1 4. 0g/L、(NH4) 2S04 0. 1 3. 0g/L、MgS04 7H20 0. 05 0. 6g/L、CaCl2 2H20 0. 01 0. lg/ L,微量元素母液0. 5 5mL，四氢呋喃0. 01 5mM，pH 4. 0 10. 0。微量元素母液浓度 组成FeS04 7H20 1. 0g/L、CuS04 5H200. 02g/L、H3B03 0 . 0 1 4g/L、MnS04 4H20 0. 10g/L、 ZnS04 7H20 0. 10g/L、Na2Mo04 2H20 0. 02g/L、CoCl2 6H20 0. 02g/L，溶剂为水。所述食油假单胞菌DT4还可应用于降解苯或甲苯。所述食油假单胞菌DT4还可以四氢呋喃为共代谢基质降解乙苯或二甲苯。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一株四氢呋喃的高效降解菌，该菌 株为好氧非发酵型革兰氏染色阴性菌，能够以四氢呋喃为唯一碳源与能源生长同时高效降 解该底物；该菌株能降解苯和甲苯，并且以共代谢的方式降解乙苯和二甲苯；本发明为生 物法净化含THF废水及废气的工程应用奠定了基础。
图1为P. Oleovorans DT4降解THF及菌体生长情况；图2为不同pH对于菌体浓度和THF降解率的影响；图3为不同温度下菌体浓度(a)及THF浓度(b)随时间变化情况；图4为P. Oleovorans DT4降解苯和甲苯的进程曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 :P. 01eovoransDT4的分离与鉴定(1)样品采集及驯化现场采集绍兴某化工厂污水处理池的活性污泥，以THF为唯一碳源和能源，进行 驯化、富集。数月后，经富集后的活性污泥，接种到含50mLBSM培养基的250mL密封盐水瓶
4中，以THF作为唯一碳源和能源，继续培养、富集。实验需恒温(30士 1°C)，并保持在好氧条 件下进行。BSM 按如下组成配制4. 5g Na2HP04 12H20、1. 0g KH2P04、1. 8g (NH4) 2S04、0. 2g MgS04 7H20、0. 03g CaCl2 2H20, lmL 微量元素母液，水补足至 1000mL。微量元素母液浓度组成:FeS04 7H20 1. Og/L、CuS04 5H20 0. 02g/L、H3B03 0. 014g/L、MnS04 .4H20 0. 10g/L、ZnS04 7H20 0. 10g/L、Na2Mo04 2H20 0. 02g/L、CoCl2 6H20 0. 02g/L，溶剂为水。(2)菌株分离与鉴定将在盐水瓶中经过多次传代富集的混合菌液，进行稀释涂布，依据菌体群落的差 异性，挑取单菌落。对单菌落进行多次划线分离后，再接至以THF为唯一碳源和能源的BSM 中，测试降解活性。选择具有THF降解能力的纯菌，进一步分离纯化，获得有四氢呋喃降解 活性的菌株DT4。菌株DT4细胞呈短杆状，大小为(0. 5 0. 8) ii mX (0. 8 1. 2) ii m，无芽孢；菌落 呈小圆状、透明、白色、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长。DT4的生理生化特征为好氧，氧化酶反应呈阳性能、硝酸盐还原、精氨酸双水解 酶反应为阳性；接触酶、V.P.反应、M.R.反应、吲哚反应为阴性；不能水解淀粉；糖发酵实验 阴性，革兰氏染色阴性，最佳生长温度37 °C。上述特征与文献(《常见细菌鉴定手册》)编录的假单胞菌属的生理生化性状相吻 合。该菌株经16S rDNA同源性与Biolog系统分析，结合以上生理生化的菌学特征，将其鉴 定为食油假单胞菌(PseudomonasOleovorans)。实施例2 :P. Oleovorans DT4 降解 THF 的特性以THF作为P. Oleovorans DT4的唯一碳源，从种子液中接菌体至50mL BSM培养 基，使初始菌体浓度(以干重计)为3. 2mg/L ；加入THF使初始THF浓度为5mM。放入温度 为30°C、转数为160r/min的摇床中培养，每隔2h取一次样，结果见图1。随着时间的延长， 菌体浓度逐渐增大，至14h时，菌体浓度达到275. 6mg/L(以干重计)。本实施例说明降解菌 P. Oleovorans DT4可利用四氢呋喃作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并且具有高效降解 四氢呋喃的能力。用Imol/LNaOH 或 HC1 溶液调节 BSM 培养基为不同 pH 值(5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0、 7. 5,8. 0,8. 5,9. 0,9. 5、10. 0,10. 5)，在初始THF浓度为5mM的条件下，接入原菌液，使各平 行样中的初始菌体浓度为3.2mg/L。将样品于3(TC、160r/min恒温摇床里振荡培养，培养 10h后取样，测菌体及反应液中残余THF的浓度。实验过程中，设计3个平行样和一个空白 对照(下同)，结果见图2。可见，在pH5. 0 10. 5，微生物均能降解THF并伴随细胞浓度的增加；随着pH从 5. 0增大到10. 5，菌体浓度及THF降解率均先增大后减小，P. Oleovorans DT4降解THF的 较适宜的pH值为7. 5。说明菌株DT4在中性和偏碱性的较宽pH范围内能较好得降解THF， 为其在不同PH环境的应用提供了保证。在初始THF浓度为5mM的BSM培养基中，接入原菌液，使各平行样中的初始菌体 浓度为3.2mg/L(以干重计)。将各个样品分别置于温度为20°C、25°C、3(TC、35°C、37°C、 40°C、45°C摇床中恒温振荡培养(摇床转数均为160r/min)，定时取样，测菌体及反应液中
5残余THF的浓度。由图3可知，在20°C 45°C温度范围内，P.mendocina DT4均能生长，但 温度在30°C以下时，DT4的生长明显较高温的缓慢。当温度为37°C，细胞生长速率最快，9h 即达稳定期，菌体浓度达254. 3mg/L,体系中的THF被完全降解，去除率达到100%。随着温 度的进一步提高，菌株的生长和降解能力开始下降。实施例3 :P. Oleovorans DT4降解苯、甲苯、乙苯和二甲苯分别以苯、甲苯作为P. Oleovorans DT4的唯一碳源，将于甲苯中驯化培养过的种 子液接种至50mL BSM培养基，使初始菌体浓度为3. 2mg/L、初始底物(苯或甲苯)浓度为 ImM,于30°C、160r/min的摇床中进行降解实验。结果苯与甲苯分别在18和24h时被降解 完全，如图4所示。于50mL BSM培养基中加入2mM THF与2mM乙苯，接入P. Oleovorans DT4菌液使 初始浓度达到3. 2mg/L(以菌体细胞干重计)，于30°C、160r/min的摇床中进行降解实验。 结果当THF降解完全后，乙苯开始被降解。采用相同的方法，P. Oleovorans DT4也可以以 THF为共代谢基质降解二甲苯。实施例4 :P. Oleovorans DT4 净化 THF 废气 在生物滴滤塔中接种P. Oleovorans DT4菌液连续处理浓度为300mg/m3的THF废 气。经过15天的挂膜启动后，在停留时间为30s的条件下，THF去除率达95%以上，此后系
统能一直稳定运行。
权利要求
降解四氢呋喃的食油假单胞菌(Pseudomonas Oleovorans)DT4，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，430072，保藏日期2009年07月15日，保藏编号CCTCC NOM 209151。
2.如权利要求1所述的食油假单胞菌DT4，其特征在于所述食油假单胞菌DT4菌落特 征如下菌体呈短杆状，大小为(0. 5 0. 8) y mX (0. 8 1. 2) y m，无芽孢；菌落呈小圆状、 透明、白色、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长；氧化酶、硝酸盐还原、精氨酸双 水解酶反应为阳性；接触酶、V. P.反应、M. R.反应、吲哚反应为阴性；不能水解淀粉；糖发酵 实验阴性，革兰氏染色阴性，最佳生长温度37°C。
3.如权利要求1或2所述的食油假单胞菌DT4在降解四氢呋喃中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为将食油假单胞菌DT4接种至含 有四氢呋喃的废水或含四氢呋喃的无机盐培养基中进行培养，对四氢呋喃进行降解。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述培养在pH5.0 10. 5、20°C 45°C条件 下进行。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述无机盐培养基每1000mL含有 Na2HP04 12H20 0. 1 6. 0g、KH2P04 0. 1 4. 0g、(NH4) 2S04 0. 1 3. 0g、MgS04.7H20 0. 05 0. 6g、CaCl2 *2H20 0. 01 0. lg，微量元素母液 0. 5 5mL，四氢呋喃 0. 01 5mM，pH 4. 0 10. 0。
7.如权利要求1或2所述的食油假单胞菌DT4在降解苯或甲苯中的应用。
8.如权利要求1或2所述的食油假单胞菌DT4在以四氢呋喃为共代谢基质降解乙苯或二甲苯中的应用。
全文摘要
本发明提供了一株可高效降解四氢呋喃的食油假单胞菌(Pseudomonas Oleovorans)DT4，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，430072，保藏日期2009年07月15日，保藏编号CCTCC NOM 209151。本发明提供的四氢呋喃降解菌为好氧非发酵型革兰氏染色阴性菌，能够以四氢呋喃为唯一碳源与能源生长同时高效降解该底物；该菌株能降解苯和甲苯，并且以共代谢的方式降解乙苯和二甲苯；本发明为生物法净化含THF废水及废气的工程应用奠定了基础。
文档编号A62D101/28GK101845408SQ200910154838
公开日2010年9月29日 申请日期2009年11月24日 优先权日2009年11月24日
发明者周玉央, 金小君, 陈东之, 陈建孟 申请人:浙江工业大学