专利名称：一种磁性光酶复合催化剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新型磁性光酶复合催化剂，具体地，本发明涉及一种将二氧化钛光催化与漆酶酶催化的电子传递链耦合的磁性光酶复合催化剂及其制备方法。
背景技术：
漆酶(苯二醇氧化还原酶，EC I. 10. 3. 2)是一种含铜的多酚氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属蓝色多铜氧化酶家族。漆酶能通过4个电子将O2催化还原成水，并且伴随着一些酚类底物的氧化。漆酶氧化酚类、芳香胺类等物质的催化反应具有反应条件温和、选择性高、催化效率高的优点。漆酶是最具有应用前景的氧化还原酶之一，主要用于有机合成、环境污染物的降解和染料脱色、生物检测和电化学分析、造纸工业中的纸浆漂白和废水处理、纤维原料的降解等。
然而，在漆酶的催化氧化过程中，电子从底物向漆酶的传递是该反应的限速步骤，成为漆酶催化需要解决的核心问题之一(Oxidation of Phenols, Anilines, andBenzenethiols by Fungal Laccases: Correlation between Activity andRedox Potentials as WelI as Halide Inhibition, Feng Xuj Biochemistry,1996,35:7608-7614)。此外，由于游离漆酶易失活、无法回收且产品价格较高，造成了其应用成本的上升。利用磁性载体进行酶的固定化，不仅可以大大改善酶的稳定性、催化活性、选择性和抗抑制性，有利于固定化酶从反应体系中分离和回收，适合于大规模连续化操作，并可利用磁场控制固定化酶的运动方式和方向，提高酶的催化效率。利用半导体光催化剂处理各类污染物废水的研究已有大量的报道，其降解对象涉及酚类、染料、多环芳烃等多种重要有机化合物和部分无机化合物。光催化氧化以N型半导体为催化剂，其中TiO2活性高、对人体无害，具有稳定的化学性质、紫外屏蔽作用、耐光腐蚀、难溶，并且具有较深的价带能级，可使一些吸热的化学反应在被光辐射的表面得到实现和加速，加之无毒、成本低，所以被广泛用作光催化氧化反应的催化剂。磁性二氧化钛纳米粒子及其光催化特性的研究已有文献报道，磁核的掺杂提高了 TiO2对可见光的吸收效率(磁性二氧化钛纳米粒子的制备及其光催化性能，李和平等，分子催化，2008，6 (22) ,555-560)。在酶与TiO2协同作用处理酚类废水上，Meizler等采用表面包覆TiO2的玻璃珠进行辣根过氧化物酶的固定化，其目的是通过TiO2的光催化破坏酶氧化形成的聚合物，减少其对酶的抑制作用(A novel glasssupport for the immobilization and UV-activation of horseradish peroxidasefor treatment of halogenated phenols, Alon Meizler.，etc.，Chemical EngineeringJournal, 2011, 172:792-798)。已有的研究表明，水中O2与TiO2表面电子(e—)的结合成为TiO2光催化的限速步骤，而采用通入过量的氧或负载惰性金属的方法加快电子传递的作用是有限的(Photocatalytic oxidation of organics in water using pureand silver-modified titanium dioxide particles, Vamathevan V.，etc.，Journal ofPhotochemistry and Photobiology A:Chemistry,2002, 148:233-245.)。
漆酶的氧化还原电位在O. 5-0. 8V，其中变色栓菌漆酶的氧化还原电位为O. 8V ；以漆酶氧化的酚类物质为例，其氧化还原电位主要集中O. 5-0. 8V，这解释了底物电子向漆酶自然态中间体成为限速步骤的原因(Kinetic and biochemical properties ofhigh and low redox potential laccases from fungal and plant origin, MarcoFrasconi, etc. , Biochimica et Biophysica Acta, 2010，1804:899-908)。而在 TiO2 光催化的过程中，O2是很好的电子受体，但吸附于TiO2表面的O2与电子(e_)的结合决定于TiO2浅表层的密度，该浅表层的氧化还原电位为0. 1-0. 3V，而O2转变为·02_的氧化还原电位为-0. 28V,这是O2与电子(e-)的结合缓慢的原因(Ti02Photocatalysis:A HistoricalOverview and Future Prospects, Kazuhito Hashimoto, ProspectsJapanese Journal ofApplied Physics, 2005，44:8269-8285)。Jia等人报道了采用多孔玻璃珠固定化的漆酶与TiO2光催化协同作用进行酚类催化可提高分催化效果的研究，分析认为酶催化与光催化 分别进行，产生协同作用的原因可能是光催化过程中产生的自由基金属酶催化途径加速酶催化造成的，该方法虽然实现了漆酶催化和TiO2光催化的协同作用，但未能解决各自催化中的限速步骤问题，且固定化酶和TiO2不易回收(Degradation of high concentration2, 4-dichlorophenoI by simultaneous photocatalytic - enzymatic process usingTi02/UV and laccase, Jingbo Jia, etc. , Journal of Hazardous Materials, 2012，205-206:150-155)。
发明内容
针对现有技术中漆酶酶催化和TiO2光催化中分别存在的限速步骤问题，本发明的目的之一在于提供一种磁性光酶复合催化剂，所述催化剂采用磁性纳米TiO2作为固定化载体，通过漆酶的固定化形成漆酶与磁性纳米TiO2的复合体，漆酶在酚类催化过程中起到电子传递的作用，其直接从TiO2表面接受电子(e_)将分子氧还原为水，加速了 H+与e_的分离，解决了漆酶从底物接受电子速率慢和光生电子与O2结合缓慢的问题。本发明所述磁性光酶复合催化剂为固定化在磁性纳米TiO2上的漆酶，所述的磁性纳米TiO2为经过表面功能化的磁性纳米TiO2。优选地，本发明所述漆酶与磁性纳米TiO2的质量比为1:1-1:20 (w/w),例如I: I. I、I: I. 6、I: 2. 7、I: 3. O、I: 4. 3、I: 5. I、I: 5. 7、I: 6. 2、I: 6. 9、I: 7. 4、I: 8. O、I: 8. 4、1:8. 8、1:9. 2、1:9. 9、1:11、1:12. 8、1:14. 3、1:15. 7,1:17. 2,1:18. 8、1:19. 2等。当漆酶与磁性纳米TiO2的质量比小于1:1时，漆酶的电子传递作用弱，催化性能不好；当漆酶与磁性纳米TiO2的质量比大于1:20时，光催化效果不佳。尤其是当漆酶与磁性纳米TiO2的质量比为1:3-1:15 (w/w)，优选1:5-1:10 (w/w)时，所制备得到的磁性光酶复合催化剂的催化效果更加好。本发明所述的磁性纳米TiO2为磁性负载的纳米TiO2，本领域技术人员能够获得的磁性负载的载体均可用于本发明，例如Fe3CV Y-Fe2O3或尖晶石类物质例如NiFe2CVMnFe2O4等。同时，磁性纳米TiO2的制备方法也有很多，本领域技术人员完全有能力获得磁性纳米TiO2的制备方法，典型但非限制性的实例有溶胶-凝胶法、高速球磨法、反胶束法或水解法中的任意I种或至少2中的结合。本发明所述的磁性纳米TiO2的载体优选为Fe3O4，并且，所述磁性纳米TiO2中Fe3O4的含量为 l~4wt%,例如 I. lwt%> I. 3wt%> I. 8wt%、2. 0wt%、2. 2wt%>2. 9wt%、3. lwt%、3. 7wt%>
3.9wt%等。当磁性纳米TiO2中Fe3O4的含量小于lwt%,则磁性效果不明显；当Fe3O4的含量大于4wt%时,影响磁性纳米TiO2的催化效果。本发明所述磁性纳米TiO2的制备方法采用现有的文献报道的方法(Comparisonof magnetic-manometer titanium dioxide/ferriferous oxide (Ti02/Fe304) compositephotocatalyst prepared by acid—sol and homogeneous precipitation methods.Jinyuan Chen, Journal of Materials Science, 2010，45:6018 - 6024)制备磁性纳米 TiO2纳米颗粒。为了能够使漆酶更好的固定化在磁性纳米TiO2上，本发明优选将磁性纳米TiO2转变为铜离子鳌合修饰的磁性纳米TiO2颗粒。本发明所述的将磁性纳米TiO2转变为铜离子鳌合修饰的磁性纳米TiO2颗粒的方法有很多种，本领域技术人员可以通过查阅相关文献获 得，本发明选取的过程为将磁性纳米TiO2先通过亚氨基接枝试剂，将磁性纳米TiO2转变为具有亚氨基功能团的磁性纳米TiO2纳米颗粒，然后通过与铜离子溶液混合反应，得到铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒。本发明的目的之二是提供一种制备磁性光酶复合催化剂的方法。所述方法为将磁性纳米TiO2颗粒经过娃烧化反应、接枝反应和铜离子螯合修饰得到表面功能化的磁性纳米TiO2，然后将漆酶固定化在表面功能化的磁性纳米TiO2上，得到磁性光酶复合催化剂。具体地，本发明所述磁性光酶复合催化剂的制备方法包括如下步骤(I)配制硅烷化反应溶液；(2)进行硅烷化反应；(3)进行接枝反应；(4)进行铜离子螯合；(5)进行漆酶固化反应。本发明步骤(I)所硅烷化反应溶液包括硅烷试剂、一元醇、磁性纳米TiO2纳米颗粒和水。所述硅烷化试剂选自3-氯丙基三甲氧基硅烷、二甲基二氯硅烷、三氯甲基硅烷中的任意I种或至少2种的组合，所述组合例如3-氯丙基三甲氧基硅烷/ 二甲基二氯硅烷、二氣甲基娃烧/3-氣丙基二甲氧基娃烧、3_氣丙基二甲氧基娃烧/ 二甲基二氣娃烧/ 二氣甲基硅烷等；进一步优选为3-氯丙基三甲氧基硅烷。所述一元醇为C1-C5的直链或直链烷基一元醇中的任意I种或至少2种的组合，所述一元醇的实例有甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇、异丙醇、叔丁醇等，本发明所述一元醇进一步优选自甲醇、乙醇、正丙醇中的任意I种或至少2种的组合，所述组合例如甲醇/乙醇、乙醇/正丙醇/甲醇、正丙醇/乙醇等。以硅烷化试剂的重量为I重量份，一元醇的加入量为20-70重量份，例如一元醇的重量份数为22、27、31、39、45、52、57、63、67、69等，优选40-60重量份。所述磁性纳米TiO2纳米颗粒为磁性颗粒负载的纳米TiO2,优选为将纳米TiO2负载在Fe3O4上，并且优选载体Fe3O4占磁性纳米TiO2纳米颗粒质量的l_4wt%。以娃烧化试剂的重量为I重量份，磁性纳米TiO2纳米颗粒的加入量为0. 1-5重量份，例如磁性纳米TiO2纳米颗粒的重量份数为 0. 1,0. 5,1. 0,1. 6,2. 1,2. 8,3. 4,4. 0,4. 2,4. TA. 9 等，优选 0. 5-2重量份。本发明所述的磁性纳米TiO2纳米颗粒釆用现有的文献报道的方法(Comparisonof magnetic-manometer titanium dioxide/ferriferous oxide (Ti02/Fe304) compositephotocatalyst prepared by acid—sol and homogeneous precipitation methods.Jinyuan Chen, Journal of Materials Science，2010，45:6018 - 6024)制备磁性纳米TiO2纳米颗粒,其主要步骤包括①合成PEG修饰的Fe3O4磁流体,②调节磁流体pH并加入Ti (SO4)2，③加入尿素在加热搅拌条件下进行水解和中和反应，合成磁性纳米TiO2纳米颗粒，④将磁性纳米TiO2纳米颗粒经磁分离、洗涤后备用。优选地,本发明所述磁性纳米TiO2纳米颗粒中Fe3O4含量为l_4%(w/w),其含量通过调控磁流体中固形物含量来调节，经超声使其分散于去离子水中，形成稳定的悬浮液，浓度为2-10% (w/v)，例如悬浮液的质量/体积浓度为2. 1、2·4、2·9、3·5、4· 1、4. 8、5. 3、6. O、
7.5、8. 7、9. 4、9. 8等，然后放入冰箱中冷藏备用。所述水为实验室用水，是本领域技术人员所熟知的实验试剂，本发明所述水优选去离子水、蒸馏水、二次蒸馏水中的任意I中。以硅烷化试剂的重量为I重量份，水的加入量为 5-20 重量份，例如谁的重量份数为 5. 1,5. 6,6. 0,6. 3,6. 9,7. 3,7. 8,8. 4,9. 0,9. 8,10. 4、10. 6,11. 3,11. 8,12. 4,12. 9,13. 4,13. 9,14. 8,14. 9 等，优选 10-15 重量份。优选地,步骤(I)所述娃烧化反应溶液按重量份数包括如下组分
硅烷化试剂I 一元醇20-70
磁性纳米TiO2纳米颗粒0.1-5
水5-20；所述的硅烷化反应溶液的各组分的重量份数均以硅烷化试剂为I重量份为基准计算得到的。进一步优选地,步骤(I)所述娃烧化反应溶液按重量份数包括如下组分
硅烷化试剂I 一元醇40-60
磁性纳米TiO2纳米颗粒0.5-2
水10-15；所述的硅烷化反应溶液的各组分的重量份数均以硅烷化试剂为I重量份为基准计算得到的。优选地，步骤(I)所述硅烷化反应溶液的配制过程为在室温、搅拌条件下，向反应容器中依次加入配方量的硅烷化试剂、一元醇、磁性纳米TiO2纳米颗粒、水，调节pH值，制得硅烷化反应溶液；所述搅拌速率可以选择200-300转/分，也可根据实际情况进行其他范围的选择，例如150转/分、或500转/分等。
优选地，步骤(I)所述pH值为3-5，例如3. 1,3. 4,3. 9,4. 2,4. TA. 9等。pH值小于3硅烷化反应溶液易水解，不稳定，缩合也不彻底；pH值大于5，一元醇不稳定，硅烷化反应进行不彻底。本发明步骤(2)所述硅烷化反应为将步骤(I)得到的硅烷化反应溶液在保护气氛中，进行超声辅助反应，然后经过磁分离得到磁性纳米TiO2颗粒。优选地，步骤(2)所述硅烷化反应的温度为30_50°C，例如31-48 °C、40-45°C、31 °C、38°C、43°C、47°C、49°C等，温度低于30°C反应速率太慢，温度高于50°C温度太高，反应物容易聚合；反应时间为 20-60min，例如 25-57min、29-42min、21min、28min、33min、37min、47min、59min等，时间小于20min,反应不彻底，反应时间为60min后,基本达到反应平衡。考虑到步骤(2)的硅烷化反应的反应温度，本发明步骤(2)优选在水浴加热中进行。所述的硅烷化反应优选在装有回流装置的反应器中进行。
优选地，步骤(2)所述超声的功率为60-120W，例如61W、67W、75W、82W、88W、96W、102W、107W、113W、117W等，超声功率低于60W，反应速率太低，所需反应时间太长，超声功率太高，得到的硅烷化改性的磁性纳米TiO2的结构不好。优选地,步骤(2)所述保护气选自氮气、氦气、氩气、氖气、氪气或氙气中的任意I种或至少2种的组合,所述组合例如氮气/氦气、氩气/氮气、氦气/氪气/氩气、氙气/氮气/氦气等，优选氮气、氦气或氩气中的任意I种或至少2种的组合,进一步优选氮气。步骤(3)所述接枝反应为将步骤(2)得到的产物加入到接枝反应试剂中，在保护气氛中，搅拌进行接枝反应，然后经过磁分离得到具有亚氨基功能团的磁性纳米TiO2纳米颗粒。优选地，所述接枝反应试剂为亚氨基二乙酸钠溶液；所述接枝反应在水浴加热中进行；所述接枝反应在装有回流装置的反应器中进行；所述搅拌的转速为100-300转/分，例如 110-290 转 / 分、100-287 转 / 分、101 转 / 分、105 转 / 分、110 转 / 分、143 转 / 分、167转/分、187转/分、190转/分、196转/分等。所述保护气选自氮气、氦气、氩气、氖气、氪气或氙气中的任意I种或至少2种的组合,所述组合例如氮气/氦气、氩气/氮气、氦气/氪气/氩气、氙气/氮气/氦气等，优选氮气、氦气或氩气中的任意I种或至少2种的组合，进一步优选氮气。优选地，步骤(3)所述的接枝反应的pH范围8-10，例如8. 1,8. 4,8. 8,9. 2,9. 5、
9.8,9. 9 等；反应温度 40-80°C，例如 41°C、47°C、53°C、44°C、59°C、63°C、66°C、72°C、77°C、79°C等；反应时间 30_90min,例如 31min、35min、38min、42min、49min、57min、69min、73min、78min、84min、88min、89min 等。优选地，步骤(3)所述的亚氨基二乙酸钠溶液的浓度优选0.5-2% (w/v)，例如O. 51%,O. 56%,O. 63%,O. 79%,O. 85%,O. 93%、I. 32%、I. 54%、I. 85%、I. 92%、I. 96% 等；所述步骤
(2)得到的磁性纳米TiO2纳米颗粒的浓度为l_4%(w/v)，例如I. 1%、1· 6%、2· 1%、2· 9%、3· 5%、
4.0%、1· 23%、I. 38%、I. 72%,2. 34%,3. 96%,3. 41% 等。步骤(4)所述铜离子螯合为将步骤(3)得到的产物加入到铜离子溶液中，室温条件下振荡反应，经磁分离、洗涤后获得铜离子鳌合修饰的磁性纳米TiO2纳米颗粒。本发明所述铜离子溶液是为了通过铜离子将磁性纳米TiO2纳米颗粒进行螯合修饰，得到铜离子鳌合修饰的磁性纳米TiO2纳米颗粒。所述铜离子溶液为可溶性的含有二价铜离子的溶液，例如氯化铜溶液、硫酸铜溶液、硝酸铜溶液或醋酸铜溶液中的任意I种或至少2种的组合，所述组合例如氯化铜溶液/硫酸铜溶液、硝酸铜溶液/氯化铜溶液、氯化铜溶液/硫酸铜溶液/醋酸铜溶液等。优选地，步骤(4)所述铜离子溶液优选硫酸铜溶液。优选地，步骤(4)所述铜离子溶液的浓度优选为2-5% (w/v),例如2. 1%、2· 6%、3. 0%、3· 6%、4· 2%、4· 8%、4· 9%等，例如浓度为2. 3% (w/v)的硫酸铜溶液和/或浓度为4. 25%(w/v)的氯化铜溶液。步骤(5)所述漆酶固化反应为将步骤(4)制备获得的铜离子鳌合修饰的磁性纳米TiO2颗粒与漆酶溶液混合，在室温条件下，振荡，进行漆酶固定化反应，然后经磁分离、洗涤后获得磁性光酶复合催化剂。优选地，步骤(5)所述漆酶溶液为溶于缓冲液中的游离漆酶，所述缓冲液典型但非限制性的实例有柠檬酸缓冲液、酒石酸缓冲液、醋酸缓冲液、磷酸缓冲液等。本发明所述缓冲液均为本领域技术人员所熟知的缓冲液，其配制过程简单易操作，本发明中，选用何种缓冲液溶解漆酶，本领域技术人员可以根据自己掌握的专业知识和实际的实验条件进行选 择。优选地，步骤(5)所述漆酶选自真菌漆酶中的I种或至少2种的组合，典型但非限制性的实例有Trametes漆酶、Agaricus漆酶、Podospora漆酶、Rhizoctonia漆酶、Polyporus 漆酶、Pholiota 漆酶、Coriolus 漆酶、Neurosporus crassa 漆酶或 Plebiaradiata漆酶等，所述组合例如Agaricus漆酶/Podospora漆酶、Rhizoctonia漆酶/Plebiaradiata 漆酶 /Pholiota 漆酶、Coriolus 漆酶 /Neurosporus crassa 漆酶 /Podospora 漆酶等；所述漆酶分子量范围优选为50-100kDa，例如51kDa、55kDa、58kDa、62kDa、69kDa、71kDa、76kDa、85kDa、90kDa、94kDa、98kDa 等。优选地，步骤(5)所述漆酶溶液的浓度为O. 1-0. 8g/L,例如O. Ilg/L、0. 17g/L、0.23g/L、0.31g/L、0. 37g/L、0. 42g/L、0. 48g/L、0. 57g/L、0. 63g/L、0. 68g/L、0. 73g/L、0. 78g/L、0. 79g/L 等。优选地，步骤(5)所述漆酶与铜离子鳌合修饰的磁性纳米TiO2颗粒的质量比为(O. 1-0. 4):1,例如 O. 11:1、0· 13:1、0· 18:1、0· 25:1、0· 34:1、0· 41:1、0· 42:1、0·31:1、O. 37:1,0. 39:1 等。优选地，步骤(5)所述漆酶固化反应的pH值为3-6，例如3. I、3. 4、3. 7、4. 2、4. 7、
5.1,5. 6,5. 9 等。优选地，步骤(5)所述漆酶固化反应的时间为60_120min,例如61min、63min、67min、75min、84min、91min、99min、103min、108min、112min、115min、119min 等。作为优选技术方案，本发明所述磁性光酶复合催化剂的制备方法是以磁性纳米TiO2为漆酶固定化载体，以硅烷化试剂为偶联剂，加入一定量的一元醇，在酸性条件下，通过超声、磁分离后，加入适量亚氨基二乙酸钠溶液，碱性条件下，通过搅拌、磁分离、洗涤后，加入一定浓度CuSO4溶液，经搅拌、磁分离后获得鳌合金属离子的磁性纳米TiO2纳米颗粒。在一定浓度漆酶溶液中加入适量鳌合金属离子的磁性纳米TiO2纳米颗粒，通过振荡、磁分离和洗涤后，最终得到新型磁性光酶复合催化剂。进一步优选地，本发明所述的磁性光酶复合催化剂的制备方法包括以下步骤A、磁性纳米TiO2纳米颗粒的表面功能化(I)在室温、搅拌条件下，反应体系中依次加入硅烷化试剂、一元醇、磁性纳米TiO2纳米颗粒、水，其中，基于I重量份硅烷化试剂，加入一元醇40-60重量份、磁性纳米TiO2纳米颗粒O. 5-2重量份、水10-15重量份，调节pH值；(2)将步骤(I)得到的混合溶液在通入氮气保护、水浴加热和加装回流装置的条件下进行超声辅助的硅烷化反应，经磁分离获得硅烷化磁性纳米TiO2纳米颗粒；(3)将步骤(2)得到的产物加入到亚氨基二乙酸钠溶液中，在搅拌、通入氮气保护、水浴加热和加装回流装置的条件下进行接枝反应，经磁分离、洗涤后得到具有亚氨基功能团的磁性纳米TiO2纳米颗粒；(4)将步骤(3)得到的产物加入到的硫酸铜溶液中，室温条件下振荡反应，经磁分离、洗涤后获得铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒。B、表面功能化磁性纳米TiO2纳米颗粒的漆酶固定化 (5)将制备获得的表面铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒与溶于缓冲液中的游离漆酶混合，在室温条件下，振荡，进行漆酶固定化反应，经磁分离、洗涤后获得磁性光酶复合催化剂。具体地，本发明的通过磁性纳米TiO2纳米颗粒表面功能化和漆酶固定化制备磁性光酶复合催化剂的方法可包括以下步骤(I，)采用现有的文献报道的方法(Comparison of magnet ic-manometertitanium dioxide/ferriferous oxide (Ti02/Fe304)composite photocatalyst preparedby acid—sol and homogeneous precipitation methods. Jinyuan Chen, Journal ofMaterials Science, 2010，45:6018 - 6024)制备磁性纳米TiO2纳米颗粒，其中Fe3O4含量为1-4% (w/w),经超声使其分散于去离子水中，形成稳定的悬浮液,浓度为2-10% (w/v),然后放入冰箱中冷臧备用；(I)在室温(约25°C )、200-400转/分搅拌的条件下反应体系中依次加入硅烷化试齐U、一元醇、磁性纳米TiO2纳米颗粒、水，其中，基于I重量份硅烷化试剂,优选地,加入一元醇8-12重量份、磁性纳米TiO2纳米颗粒0. 1-0. 4重量份、水2_3重量份，调节pH值至3_5，充分搅拌10-30min ；(2)将步骤(2)得到的混合溶液在通入氮气保护、水浴加热、加装回流装置、60-120W的超声条件下进行硅烷化反应，反应温度30-50°C，反应时间20_60min，所得硅烷化磁性纳米TiO2纳米颗粒经磁分离后，无需洗涤，备用；(3)将步骤(3)得到的产物加入到0. 5-2% (w/v)亚氨基二乙酸钠溶液中，其中，硅烷化磁性纳米TiO2纳米颗粒的浓度为1-4% (w/v),调节pH至8-10，在100-300转/分搅拌、通入氮气保护、水浴加热和加装回流装置的条件下进行接枝反应，反应温度40-80°C，反应时间30-90min,经磁分离、洗漆后得到具有亚氨基功能团的磁性纳米TiO2纳米颗粒；(4)将步骤(4)得到的产物加入到2-5% (w/v)的硫酸铜溶液中，其中，硅烷化磁性纳米TiO2纳米颗粒的浓度为2-6% (w/v),室温条件下，100-200转/分振荡反应，反应时间45-90min，经磁分离、洗涤后获得铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒；(5)将制备获得的表面铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒与溶于缓冲液中的游离漆酶混合，其中，漆酶的浓度为0. 1-0. 8g/L，游离漆酶与表面铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒的混合比例是0. 1-0. 4g漆酶/Ig载体，pH3-6，在室温条件下，100-200转/分振荡进行漆酶固定化反应，反应时间60-120min，经磁分离、洗涤后，获得磁性光酶复合催化剂。
所述的一元醇选自甲醇、乙醇、正丙醇中的一种或者两者的混合物。所述的漆酶选自真菌漆酶中的一种或者多种的混合物，漆酶分子量范围为50_100kDa。本发明的目的之三是提供一种磁性光酶复合催化剂的用途，所述磁性光酶复合催化剂用于有机合成、环境污染物的降解和染料脱色、生物检测和电化学分析、造纸工业中的纸浆漂白和废水处理、纤维原料的降解；优选用于降解酚类、染料、多环芳烃等污染环境的有机化合物和部分无机化合物。本发明所述的磁性光酶复合催化剂以磁性纳米TiO2为固定化载体，通过金属离子鳌和亲和修饰的手段实现漆酶与磁性纳米TiO2复合体的组建，所述催化剂实现了催化氧化过程中电子在漆酶与TiO2间的传递，解决了漆酶从底物接受电子速率慢和光生电子与O2结合缓慢的问题，利用酶催化和光催化的协同作用提高催化氧化效率，可实现对氧化还原电位较高底物及大分子底物的氧化，该催化剂具有超顺磁性，可以在外加磁场的作用下进行方便有效的控制和分离，制备工艺简单，易于放大。尤其是当所述催化剂中漆酶与磁性纳米 TiO2的质量比为1:5-10，其中用于催化剂制备的磁性纳米TiO2的Fe3O4含量为1_4% (w/w)时，效果更好。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(I)本发明提供的磁性光酶复合催化剂可以实现催化氧化过程中电子在漆酶与TiO2间的传递，解除了两者催化反应中的电子传递限速步骤，利用酶催化和光催化的协同作用提高催化氧化效率；(2)本发明提供的磁性光酶复合催化剂可实现对氧化还原电位较高底物及大分子底物的氧化；(3)本发明提供的磁性光酶复合催化剂具有超顺磁性，可以在外加磁场的作用下进行方便有效的控制和分离；(4)本发明提供的磁性光酶复合催化剂的制备工艺简单，易于放大。
具体实施例方式为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。实施例I( I ’ )将制备获得的磁性纳米TiO2纳米颗粒分散于去离子水中形成悬浮液，磁性纳米TiO2的Fe3O4含量为4% (w/w)，磁性纳米TiO2的浓度为2% (w/v)，然后放入冰箱中冷藏备用。(I)在室温(25°C)、200转/分搅拌的条件下反应体系中依次加入硅烷化试剂2g、一元醇120g、磁性纳米TiO2纳米颗粒4g、水30g,调节pH值至5,充分搅拌30min后,得娃烧化反应溶液；(2)将硅烷化反应溶液在通入氮气保护、水浴加热50°C、加装回流装置、120W超声条件下反应20min，所得产物经磁分离后，得硅烷化磁性纳米TiO2纳米颗粒；(3)将硅烷化磁性纳米TiO2纳米颗粒加入到2% (w/v)的亚氨基二乙酸钠溶液中，颗粒浓度为4%(w/v)，调节pH至10，在300转/分搅拌、通入氮气保护、水浴加热80°C和加装回流装置的条件下反应时间30min，经磁分离、洗涤后得到具有亚氨基功能团的磁性纳米TiO2纳米颗粒；(4)将步骤(3)得到的纳米颗粒加入到5% (w/v)的硫酸铜溶液中，颗粒浓度为6%(w/v),室温条件下，200转/分振荡反应45min，经磁分离、洗涤后获得铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒；(5)以步骤(4)得到的铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒作为载体与溶于PH3. O酒石酸缓冲液中的O. lg/L游离漆酶混合，纳米颗粒的浓度lg/L，在室温条件下，100转/分振荡反应60min，经磁分离、洗涤后，获得磁性光酶复合催化剂。催化活性测试以苯酚为底物进行催化活力测定，复合催化剂的活力较等量游离漆酶和磁性纳米TiO2的催化活力之和提高50%。
实施例2( I ’ )将制备获得的磁性纳米TiO2纳米颗粒分散于去离子水中形成悬浮液，磁性纳米TiO2的Fe3O4含量为1% (w/w)，其浓度为10% (w/v)，然后放入冰箱中冷藏备用；(I)在室温(25°C)、200转/分搅拌的条件下反应体系中依次加入硅烷化试剂2g、一元醇80g、磁性纳米TiO2纳米颗粒lg、水20g,调节pH值至3,充分搅拌IOmin后,得娃烧化反应溶液；(2)将硅烷化反应溶液在通入氮气保护、水浴加热30°C、加装回流装置、60W超声条件下反应60min,所得娃烧化磁性纳米TiO2纳米颗粒经磁分离后,得娃烧化磁性纳米TiO2纳米颗粒；(3)将硅烷化磁性纳米TiO2纳米颗粒加入到O. 5% (w/v)亚氨基二乙酸钠溶液中，颗粒浓度为1% (w/v)，调节pH至8，在100转/分搅拌、通入氮气保护、水浴加热40°C和加装回流装置的条件下反应时间90min，经磁分离、洗涤后得到具有亚氨基功能团的磁性纳米TiO2纳米颗粒；(4)将步骤(3)得到的纳米颗粒加入到2% (w/v)的硫酸铜溶液中，颗粒浓度为2%(w/v),室温条件下，100转/分振荡反应90min，经磁分离、洗涤后获得铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒；(5)以步骤(4)得到的铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒作为载体与溶于PH6. O磷酸缓冲液中的O. 8g/L游离漆酶混合，颗粒浓度2g/L，在室温条件下，200转/分振荡反应120min，经磁分离、洗涤后，获得磁性光酶复合催化剂。催化活性测试以苯酚为底物进行催化活力测定，复合催化剂的活力较等量游离漆酶和磁性纳米TiO2的催化活力之和提高40%。实施例3( I ’ )将制备获得的磁性纳米TiO2纳米颗粒分散于去离子水中形成悬浮液，磁性纳米TiO2的Fe3O4含量为2% (w/w)，其浓度为5% (w/v)，然后放入冰箱中冷藏备用；(I)在室温(25°C)、300转/分搅拌的条件下反应体系中依次加入硅烷化试剂2g、一元醇100g、磁性纳米TiO2纳米颗粒2. 5g、水25g,调节pH值至4,充分搅拌20min后,得硅烷化反应溶液；
(2)将硅烷化反应溶液在通入氮气保护、水浴加热40°C、加装回流装置、90W超声条件下反应40min,所得娃烧化磁性纳米TiO2纳米颗粒经磁分离后,得娃烧化磁性纳米TiO2纳米颗粒；(3)将硅烷化磁性纳米TiO2纳米颗粒加入到1% (w/v)亚氨基二乙酸钠溶液中，颗粒浓度为2% (w/v)，调节pH至9，在200转/分搅拌、通入氮气保护、水浴加热60°C和加装回流装置的条件下反应时间60min，经磁分离、洗涤后得到具有亚氨基功能团的磁性纳米TiO2纳米颗粒；(4)将步骤(3)得到的纳米颗粒加入到3% (w/v)的硫酸铜溶液中，颗粒浓度为4%(w/v),室温条件下，150转/分振荡反应60min，经磁分离、洗涤后获得铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒；(5)以步骤(4)得到的铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒作为载体与溶于PH4. 5柠檬酸缓冲液中的O. 3g/L游离漆酶混合，颗粒浓度lg/L，在室温条件下，150转/分振荡反应90min，经磁分离、洗涤后，获得磁性光酶复合催化剂。 催化活性测试以苯酚为底物进行催化活力测定，复合催化剂的活力较等量游离漆酶和磁性纳米TiO2的催化活力之和提高70%。实施例4( I ’ )将制备获得的磁性纳米TiO2纳米颗粒分散于去离子水中形成悬浮液，磁性纳米TiO2的Fe3O4含量为3% (w/w)，其浓度为4% (w/v)，然后放入冰箱中冷藏备用；(I)在室温(25°C)、200转/分搅拌的条件下反应体系中依次加入硅烷化试剂2g、一元醇90g、磁性纳米TiO2纳米颗粒3g、水30g,调节pH值至4. 5,充分搅拌30min后,得娃烧化反应溶液；(2)将硅烷化反应溶液在通入氮气保护、水浴加热30°C、加装回流装置、60W超声条件下反应50min,所得娃烧化磁性纳米TiO2纳米颗粒经磁分离后,得娃烧化磁性纳米TiO2纳米颗粒；(3)将硅烷化磁性纳米TiO2纳米颗粒加入到I. 5% (w/v)亚氨基二乙酸钠溶液中，颗粒浓度为3% (w/v)，调节pH至8. 5，在150转/分搅拌、通入氮气保护、水浴加热50°C和加装回流装置的条件下反应时间80min，经磁分离、洗涤后得到具有亚氨基功能团的磁性纳米TiO2纳米颗粒；(4)将步骤(3)得到的纳米颗粒加入到4% (w/v)的硫酸铜溶液中，颗粒浓度为5%(w/v),室温条件下，120转/分振荡反应80min，经磁分离、洗涤后获得铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒；(5)以步骤(4)得到的铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒作为载体与溶于PH5醋酸缓冲液中的O. 6g/L游离漆酶混合，颗粒浓度2g/L，在室温条件下，120转/分振荡反应IOOmin,经磁分离、洗涤后，获得磁性光酶复合催化剂。催化活性测试以苯酚为底物进行催化活力测定，复合催化剂的活力较等量游离漆酶和磁性纳米TiO2的催化活力之和提高60%。实施例5
( I’)将制备获得的磁性纳米TiO2纳米颗粒分散于去离子水中形成悬浮液，磁性纳米TiO2的Fe3O4含量为I. 4% (w/w)，其浓度为4. 2% (w/v)，然后放入冰箱中冷藏备用；(I)在室温(25°C)、200转/分搅拌的条件下反应体系中依次加入硅烷化试剂2g、一元醇40g、磁性纳米TiO2纳米颗粒O. 2g、水IOg,调节pH值至3. 7,充分搅拌30min后,得硅烷化反应溶液；(2)将硅烷化反应溶液在通入氮气保护、水浴加热35°C、加装回流装置、100W超声条件下反应45min,所得娃烧化磁性纳米TiO2纳米颗粒经磁分离后,得娃烧化磁性纳米TiO2纳米颗粒；(3)将硅烷化磁性纳米TiO2纳米颗粒加入到O. 7% (w/v)亚氨基二乙酸钠溶液中，颗粒浓度为3. 7%(w/v)，调节pH至9. 4，在180转/分搅拌、通入氦气/氩气保护、水浴加热62°C和加装回流装置的条件下反应时间45min，经磁分离、洗涤后得到具有亚氨基功能团的磁性纳米TiO2纳米颗粒； (4)将步骤(3)得到的纳米颗粒加入到2. 4% (w/v)的硫酸铜溶液中，颗粒浓度为
4.1% (w/v),室温条件下，125转/分振荡反应50min，经磁分离、洗涤后获得铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒；(5)以步骤(4)得到的铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒作为载体与溶于pH5醋酸缓冲液中的O. 2g/L游离漆酶混合，颗粒浓度lg/L，在室温条件下，120转/分振荡反应75min,经磁分离、洗涤后，获得磁性光酶复合催化剂。催化活性测试以苯酚为底物进行催化活力测定，复合催化剂的活力较等量游离漆酶和磁性纳米TiO2的催化活力之和提高55%。实施例6( I ’ )将制备获得的磁性纳米TiO2纳米颗粒分散于去离子水中形成悬浮液，磁性纳米TiO2的Fe3O4含量为3. 8% (w/w)，其浓度为8. 8% (w/v)，然后放入冰箱中冷藏备用；(I)在室温(25°C)、200转/分搅拌的条件下反应体系中依次加入硅烷化试剂2g、一元醇140g、磁性纳米TiO2纳米颗粒IOgdjC 40g,调节pH值至4. 7,充分搅拌55min后,得硅烷化反应溶液；(2)将硅烷化反应溶液在通入氮气保护、水浴加热45°C、加装回流装置、115W超声条件下反应25min,所得娃烧化磁性纳米TiO2纳米颗粒经磁分离后,得娃烧化磁性纳米TiO2纳米颗粒；(3)将硅烷化磁性纳米TiO2纳米颗粒加入到I. 6% (w/v)亚氨基二乙酸钠溶液中，颗粒浓度为I. 2%(w/v)，调节pH至8. 5，在280转/分搅拌、通入氦气/氩气保护、水浴加热77°C和加装回流装置的条件下反应时间85min，经磁分离、洗涤后得到具有亚氨基功能团的磁性纳米TiO2纳米颗粒；(4)将步骤(3)得到的纳米颗粒加入到4. 7% (w/v)的硫酸铜溶液中，颗粒浓度为3. 7% (w/v),室温条件下，150转/分振荡反应85min，经磁分离、洗涤后获得铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒；(5)以步骤(4)得到的铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒作为载体与溶于PH5酒石酸缓冲液中的O. 6g/L游离漆酶混合，颗粒浓度4. 2g/L，在室温条件下，180转/分振荡反应105min，经磁分离、洗涤后，获得磁性光酶复合催化剂。催化活性测试以苯酚为底物进行催化活力测定，复合催化剂的活力较等量游离漆酶和磁性纳米TiO2的催化活力之和提高75%。 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
权利要求
1.一种磁性光酶复合催化剂，其特征在于，所述磁性光酶复合催化剂为固定化在磁性纳米TiO2上的漆酶，所述的磁性纳米TiO2为经过表面功能化的磁性纳米Ti02。
2.如权利要求I所述的磁性光酶复合催化剂，其特征在于，所述表面功能化的磁性纳米TiO2为铜离子鳌合修饰的磁性纳米TiO2颗粒； 优选地，所述磁性纳米TiO2的Fe3O4含量为l-4wt% ； 优选地，所述漆酶与磁性纳米TiO2的质量比为1:1-1:20 (w/w),优选1:3-1:15 (w/w),进一步优选 1:5-1:10 (w/w)。
3.—种如权利要求I或2所述的磁性光酶复合催化剂的制备方法，其特征在于，所述方法为将磁性纳米TiO2颗粒经过硅烷化反应、接枝反应和铜离子螯合修饰得到表面功能化的磁性纳米TiO2,然后将漆酶固定化在表面功能化的磁性纳米TiO2上，得到磁性光酶复合催化剂； 优选地，所述方法包括如下步骤 (1)配制硅烷化反应溶液； (2)进行娃烧化反应； (3)进行接枝反应； (4)进行铜离子螯合； (5)进行漆酶固化反应。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述硅烷化反应溶液按重量份数包括如下组分 硅烷化试剂I一元醇20-70 磁性纳米TiO2纳米颗粒0.1-5 水5-20； 优选地，步骤(I)所述硅烷化反应溶液按重量份数包括如下组分 硅烷化试剂I一元醇40-60磁性纳米TiO2纳米颗粒0.5-2水10-15; 优选地，步骤(I)所述硅烷化反应溶液的配制过程为在室温、搅拌条件下，向反应容器中依次加入配方量的硅烷化试剂、一元醇、磁性纳米TiO2纳米颗粒、水，调节pH值，制得硅烷化反应溶液； 优选地，步骤(I)所述硅烷化试剂选自3-氯丙基三甲氧基硅烷、二甲基二氯硅烷、三氯甲基硅烷中的任意I种或至少2种的组合； 优选地，步骤(I)所述一元醇选自甲醇、乙醇、正丙醇中的任意I种或至少2种的组合； 优选地，步骤(I)所pH值为3-5。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述硅烷化反应为将步骤(I)得到的硅烷化反应溶液在保护气氛中，进行超声辅助反应，然后经过磁分离得到磁性纳米TiO2颗粒； 优选地，步骤(2)所述硅烷化反应的温度为30-50°C，反应时间为20-60min ； 优选地，步骤(2)所述超声的功率为60-120W ； 优选地,步骤(2)所述保护气选自氮气、氦气、氩气、氖气、氪气或氙气中的任意I种或至少2种的组合，优选氮气、氦气或氩气中的任意I种或至少2种的组合，进一步优选氮气；优选地，步骤(2)所述硅烷化反应在水浴加热中进行； 优选地，步骤(2)所述硅烷化反应在装有回流装置的反应器中进行。
6.如权利要求3-5之一所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述接枝反应为将步骤 (2)得到的产物加入到接枝反应试剂中，在保护气氛中，搅拌进行接枝反应，然后经过磁分离得到具有亚氨基功能团的磁性纳米TiO2纳米颗粒； 优选地，步骤(3)所述接枝反应的反应试剂为亚氨基二乙酸钠溶液； 优选地，步骤(3 )所述的接枝反应的pH范围8 -10，反应温度40 -8 (TC，反应时间30_90min ； 优选地,步骤(3)所述保护气选自氮气、氦气、氩气、氖气、氪气或氙气中的任意I种或至少2种的组合； 优选地，步骤(3)所述接枝反应在水浴加热中进行； 优选地，步骤(3)所述接枝反应在装有回流装置的反应器中进行； 所述搅拌的转速为100-300转/分。
7.如权利要求3-6之一所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述铜离子螯合为将步骤(3)得到的产物加入到铜离子溶液中，室温条件下振荡反应，经磁分离、洗涤后获得铜离子鳌合修饰的磁性纳米TiO2纳米颗粒； 优选地，步骤(4)所述铜离子溶液优选硫酸铜溶液。
8.如权利要求3-7之一所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述漆酶固化反应为将步骤(4)制备获得的铜离子鳌合修饰的磁性纳米TiO2颗粒与漆酶溶液混合，在室温条件下，振荡，进行漆酶固定化反应，然后经磁分离、洗涤后获得磁性光酶复合催化剂； 优选地，步骤(5)所述漆酶溶液为溶于缓冲液中的游离漆酶； 优选地，步骤(5 )所述漆酶选自真菌漆酶中的I种或至少2种的组合，所述漆酶分子量范围优选为50-100kDa ； 优选地，步骤(5)所述漆酶溶液的浓度为0. 1-0. 8g/L ； 优选地，步骤(5)所述漆酶与铜离子鳌合修饰的磁性纳米TiO2颗粒的质量比为1:1-1:20 (w/w),优选 1:3-1:15 (w/w),进一步优选 1:5-1:10 (w/w)； 优选地，步骤(5)所述漆酶固化反应的pH值为3-6 ； 优选地，步骤(5)所述漆酶固化反应的时间为60-120min。
9.如权利要求3-8之一所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤 (I)在室温、搅拌条件下，反应体系中依次加入硅烷化试剂、一元醇、磁性纳米TiO2纳米 颗粒、水，其中，基于I重量份硅烷化试剂,加入一元醇40-60重量份、磁性纳米TiO2纳米颗粒0. 5-2重量份、水10-15重量份，调节pH值3-5 ；(2)将步骤(I)得到的混合溶液在通入氮气保护、水浴加热和加装回流装置的条件下进行超声辅助的硅烷化反应，经磁分离获得硅烷化磁性纳米TiO2纳米颗粒； (3)将步骤(2)得到的产物加入到亚氨基二乙酸钠溶液中，在搅拌、通入氮气保护、水浴加热和加装回流装置的条件下进行接枝反应，经磁分离、洗涤后得到具有亚氨基功能团的磁性纳米TiO2纳米颗粒； (4)将步骤(3)得到的产物加入到的硫酸铜溶液中，室温条件下振荡反应，经磁分离、洗涤后获得铜离子鳌合的磁性纳米TiO2纳米颗粒。
(5)将步骤(4)制备获得的铜离子鳌合修饰的磁性纳米TiO2纳米颗粒与溶于缓冲液中 的游离漆酶混合，在室温条件下，振荡，进行漆酶固定化反应，经磁分离、洗涤后获得磁性光酶复合催化剂。
10.一种如权利要求I或2所述的磁性光酶复合催化剂的用途，其特征在于，所述磁性光酶复合催化剂用于有机合成、环境污染物的降解和染料脱色、生物检测和电化学分析、造纸工业中的纸浆漂白和废水处理、纤维原料的降解；优选用于降解酚类、染料、多环芳烃等污染环境的有机化合物和部分无机化合物。
全文摘要
本发明涉及一种磁性光酶复合催化剂及其制备方法，所述磁性光酶复合催化剂为固定化在经过表面功能化的磁性纳米TiO2上的漆酶，尤其是固定化在铜离子鳌合修饰的磁性纳米TiO2颗粒上的漆酶。本发明提供的磁性光酶复合催化剂实现了催化氧化过程中电子在漆酶与TiO2间的传递，解决了漆酶从底物接受电子速率慢和光生电子与O2结合缓慢的问题，利用酶催化和光催化的协同作用提高催化氧化效率，可实现对氧化还原电位较高底物及大分子底物的氧化，该催化剂具有超顺磁性，可以在外加磁场的作用下进行方便有效的控制和分离，制备工艺简单，易于放大。
文档编号A62D3/02GK102728410SQ20121019390
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月12日 优先权日2012年6月12日
发明者刘春朝, 王 锋, 郭晨 申请人:中国科学院过程工程研究所