一种新型分子文库及其构建方法

专利名称：一种新型分子文库及其构建方法
技术领域：
本发明属分子文库技术，涉及分子生物学技术领域。
背景技术：
分子文库是一个大量分子的集合体，它们可以有类似的或不同的来 源，能有效、快速地筛选生物活性物质。分子文库技术操作简单，不需 要特殊的、复杂的仪器设备，在一般的分子生物学或生物化学实验室均 能开展，近年来已成为研究肽和蛋白质等生物活性物质的配体、蛋白质 间相互作用的十分重要的工具。
不同的分子文库可以通过不同的策略构建。除用组合化学方法合成 的肽库、小分子化合物库外，主要采用展示技术构建。根据文库呈现的 部位不同，目前已有噬菌体表面展示文库、细菌表面展示文库、质粒展 示文库和核糖体展示文库等。这些分子库为运用分子进化工程探索多肽 和蛋白质的结构与功能提供了有效的手段。例如噬菌体展示技术和核糖 体展示技术常用于发现新配体的研究，而酵母杂交技术则用于分析体内 蛋白质间的相互作用。
一般而言，通过建库及由多轮富集和扩增组成的筛选循环，可以从
大容量的分子库(1013 1016)中通过几轮筛选找到相应的活性分子，而
且从分子文库里找到活性成分的机会与被筛选分子库的库容大小成正 比。但目前的分子文库展示技术中，分子文库的构建及筛选必须通过体 内步骤，转染效率明显限制了库容的扩大。比如噬菌体展示技术构建在
细菌中的随机肽库，其库容限制在108 109，而用于双杂交、三杂交的酵母展示系统因其转染效率更低，库容只能达到107。于是，寻找不受细 胞转染和表达等因素影响的完全体外展示系统成为分子文库技术研究的 新方向。
根据最新文献检索结果，目前为止体外展示技术方面的研究报道不
多。主要有核糖体展示技术和mRNA展示技术。另一个是2003年日本 的一个研究小组提出的利用单分子PCR技术扩增偶联体外转录和翻译技 术所构建的分子文库。(Suang Rungpragayphan, Hideo Nakano， andTsuneo Yamane， PCR-linked in vitro expression: a novel system for high-throughput construction and screening of protein libraries, FEBS Letters 'Volume 540, I^M^J:!, 10 April 2003, Pages 147-150)。但未见后续报道。mRNA展示 技术是目前体外展示技术中的研究较多的一个领域。(Terry T. Takahashi， Ryan J. Austin and Richard W. Roberts, mRNA display: ligand discovery, interaction analysis and beyond, TRENDS in Biochemical Sciences Vol.28 No.3 March 2003)。
利用体外展示技术构建分子文库解决了体内展示分子文库转染限制 库容等问题，但目前的体外展示技术中核糖体展示技术和mRNA展示技 术均属RNA展示，由于RNA对RNA酶敏感性使得其操作条件较难控制。 单分子PCR技术虽然属于DNA展示技术但由于蛋白质与其编码的DNA 不是一一对应，使得筛选和回收较难。

发明内容
本发明提供一种新型分子文库及其构建方法，目的是利用具有顺式 结合功能的蛋白构建新型分子文库，以解决目前存在的体内歩骤限制文 库库容、现有体外技术操作烦琐、表型与基因型不是一一对应的问题。 本发明采取的技术方案是采用基因重组技术、PCR技术等体外技术构 建DNA文库，采用体外转录和翻译系统表达得到DNA与蛋白质共价展
6示的分子文库。包括以下步骤
一、设计DNA分子库包括编码顺式结合蛋白的基因序列，需要 表达的分子文库的基因序列，以及进一步体外表达所需的启动子、核糖 体结合位点、中止子相应的DNA序列；
二、 构建DNA分子文库根据步骤一中DNA分子库的设计，可采 用体外连接、重组及PCR方法构建DNA分子库，具体包括以下步骤
(1) .选择含有编码顺式结合蛋白的基因序列的商品化质粒，或在体
外通过基因重组将编码顺式结合蛋白的基因序列克隆入载体或质粒；相
应的载体或质粒除包含编码顺式结合蛋白的基因序列外，还需包含启动
子、核糖体结合位点、中止子；
(2) .分子文库的基因序列可根据步骤(l)中所设计的分子文库插入 位置位于顺式结合蛋白的上游还是下游，设计为相应的库引物；
(3) .以上述含编码顺式结合蛋白的基因序列、相应启动子、核糖体 结合位点、中止子组件的载体、质粒、或PCR片断为模板，加入库引物 及相对应引物进行PCR反应，即可得到DNA分子库；
三、 DNA分子库扩增将步骤二得到的DNA分子库用启动子区的 PCR引物和中止子区的PCR引物进一步进行PCR反应，获得进一步扩 增的DNA分子库；
四、 体外表达上述扩增产物即DNA分子库加到适于线性DNA体 外表达的S30提取物中进行DNA体外表达系统，反应后中止反应。得到 的反应后的混合物即为共价展示分子文库。
参与细菌环状DNA复制的蛋白具有断裂和连接的双重功能，某些质 粒和噬菌体的启动蛋白在复制过程中还可与断裂的DNA链共价结合。既 此类蛋白质可以使其编码DNA某单链断裂并共价结合在这段序列上，即 形成编码蛋白质的基因与其基因表达产物蛋白的共价结合物。蛋白质的 这一功能称为顺式结合功能。
本发明利用上述蛋白的顺式结合特性，通过体外操作可以将建库所需的一定长度的DNA序列插入这些蛋白质基因编码DNA的上游或下游， 构建成融合DNA分子库。然后经过无细胞的体外转录和翻译系统进行转 录和翻译，形成基因(含随机序列)与蛋白(含随机序列表达产物)共 价结合复合物，即为新型分子文库。
实现本发明首先要建立一个可以体外扩增的含相应DNA分子构件 的基因文库即DNA文库。此部分DNA的组成应包括顺式结合蛋白的基 因序列，需要表达的分子文库的基因序列，以及进一步体外表达所需的 启动子、核糖体结合位点等必需组件。其后是上述基因文库的体外表达， 形成蛋白质与其基因直接相连的复合体。
上述步骤中用于构建分子文库的DNA分子需要经过体外表达，因此 要求此DNA分子可以被扩增及转录。为保证其可被扩增，适合的核苷酸 序列应是具有复制起始区的双链DNA分子，如具有自我复制能力的质 粒。必要时还可以加入第二个复制起始位点。 一般情况，建库的核苷酸 分子可以以载体、质粒、及线性DNA的形式存在。上述载体、质粒、或 线性DNA可以选用商品化产品加以改造，亦可通过常规的分子生物学操 作进行克隆及重组。DNA分子的扩增一般采用聚合酶链式反应(PCR)。 为保证构建分子文库的DNA分子可以被用于转录需要引入相应启动子 序列，根据需要可选用可诱导型启动子或非诱导型启动子。可诱导型启 动子包括AraB， Lamda启动子，TAC或LAC。非诱导型启动子如 T7启动子，SP6或T3启动子。
本发明的基因文库上述核苷酸序列的组建可以采用体外连接、PCR 扩增等方法，但不限于此。为增加分子文库的多样性可采用随机引物、 超大引物、重叠引物等PCR策略。分子文库序列可以在顺式结合蛋白编 码区的任何位置，如氨基端、羧基端、或编码区内部。如果插入到氨基 端，且通过引物引入，需采用含适合启动子，起始区编码等的超大引物以确保其可被扩增及转录。
对上述基因文库体外表达后则可直接得到本发明的共价展示新型分 子文库。
P2噬菌体中A蛋白是具有顺势结合功能的蛋白质，对其蛋白与编码 基因A基因共价结合功能己经明确，而且还有野生型A基因的质粒已经 商品化。可以方便地获得A基因，并利用常规的基因重组技术将其插入 到基因工程载体中，以供建库所需。下面以编码顺势结合蛋白的A基因 为例，介绍利用A基因构建分子文库的方法。具体步骤如下
一、 设计DNA分子库根据筛选及建库需要设计前面所述融合DNA 分子。所设计的DNA分子库包括编码顺式结合蛋白的基因序列，如噬菌 体A基因。需要表达的分子文库的基因序列，随机肽分子文库插入编码 随机肽相应的核酸序列序列可以是(XXT/G)n或(C/A/GNN、。随机肽分 子文库编码基因与顺势结合蛋白组成的融合基因上游为核糖体结合位 点、启动子DNA序列，下游为中止子DNA序列。启动子可以是T7启 动子、SP6启动子或TAC启动子等。根据筛选需要还可以在A基因的上 游或下游插入特定的标记物基因。
二、 构建DNA分子库根据步骤1设计的DNA分子库，采用DNA 体外连接、基因重组及PCR等方法构建DNA分子库。具体包括以下歩 骤
(1)选择含有编码顺式结合蛋白的基因序列A基因的商品化质粒， 或在体外通过基因重组将编码顺式结合蛋白的基因序列A基因克隆入载 体或质粒，构建含启动子、核糖体结合位点、A基因和中止子的质粒。 将A基因可通过实验室常规的分子克隆及基因重组操作克隆至高表达质 粒启动子下游区域。启动子可以是T7启动子、SP6启动子或TAC启动 子等。根据需要还可以在A基因的上游或下游引入特定的标记物基因HA， His, Myc， GPF等。
(2) 根据步骤(1)中所设计的分子库插入位置位于顺式结合蛋白 的上游还是下游，设计为相应的库引物。含有随机肽核苷酸序列的库引 物，根据步骤l)中质粒或DNA片段中A基因前后的碱基序列及随机序 列的插入位置前后的DNA序列设计并合成。插入的随机肽相应的核酸序 列序列可以是(XXT/G) n或(C/A/GNN) n。
(3) 以上述含编码顺式结合蛋白的基因序列、相应启动子、核糖体 结合位点、中止子组件的载体、质粒、或PCR片断为模板，加入库引物 及相对应引物(A基因上游及启动子上游区域的PCR引物或A基因下游 中止子区的PCR引物)进行PCR反应，即可得到DNA分子库。
三、DNA分子库扩增将前面两步设计并构建得到的分子库用启 动子区的PCR引物和中止子区的PCR引物进一步进行PCR反应，获得 扩增分子库。以步骤(1)的质粒或PCR片断为模板，加入步骤(2)中 的库引物及A基因上游及启动子上游区域的PCR引物或A基因下游中止 子区的PCR引物，进行线性PCR。可通过调整PCR反应中模板及引物 的量即分子数，获得不同量的DNA分子，即库容大小不同的DNA分子 文库。 一般可获得库容量在1012到1013个分子的分子库。当插入的片段 为超过20肽的较大片段时，为增加库容量即DNA分子库所含的分子数 可设计引物先分别扩增建库PCR反应即步骤(3)中的模板及库引物， 再进行步骤(3) PCR建库及此步DNA分子库的扩增。
四、将上述步骤三中的DNA文库稀释到表达体系所需的分子数，加 入到适于线性DNA体外表达的系统-大肠杆菌S30提取物中进行体外表 达，按照表达体系的最佳反应条件反应30到60分钟，表达后中止反应。 得到共价展示肽文库。
采用上述步骤可以根据需要合成多种类型的分子库。目前用其它建库方法所建的不同类型的分子文库均可采用此方法构建。根据需要如插
入的是随机短肽的DNA序列，则构建成随机肽文库，如果插入的是抗体 编码区基因的DNA序列，则构建成相应的抗体库。利用本发明根据不同 需要可制备多种类型的分子文库，如肽库、抗体库、抗原库、配体库、 受体库等。
本发明所建的分子文库同其他方法所建的分子文库一样具有相同的 功能。可以广泛应用于抗原表位分析、蛋白质一蛋白质相互作用位点分 析、酶作用底物分析、寻找具有生物功能的蛋白的模拟肽。先导化合物 的发现、分离鉴定疾病特异性抗原模拟肽等。
利用本发明新型分子文库对作用于特异耙分子的肽或蛋白质的筛 选，或以特定的生物学结构生物学活性进行筛选，与现有的分子文库筛 选技术类似可采用亲和筛选、利用标记物间接亲和筛选等方法。 一般一 个筛选周期的基本步骤如下
a. 将目标靶分子根据其性质包被在96孔板，免疫试管或磁珠、树脂 等固相支持物上。
b. 将一定数量的共价展示分子文库与筛选的靶分子进行一定时间的 特异性体外结合。
c. 分离和/或纯化与耙分子特异结合的共价展示分子文库。
d. 设计引物进行PCR反应回收与靶分子特异结合的共价展示分子文 库中含有DNA分子库的基因片段。
e. 进一歩PCR扩增上步回收得到的含有DNA分子库的基因片段。 成功回收到含有DNA分子库的基因片段，表明完成第一个筛选周期的筛 选，进一步可采用与构建分子文库相同的步骤，重新组建DNA分子库。 进入第二轮次建库、筛选周期。
ii采用本发明所建的共价展示分子文库从构建到筛选所有操作均在体
外完成，完全避免了DNA转入细胞等体内步骤，解决了目前大多数分子 文库体内步骤导致库容小，需要选择压力等局限，不仅可以根据筛选的 需要控制库容量，而且大大縮短了建库及筛选周期，提高了筛选效率。 本项目所建共价展示文库的设计思路与mRNA展示技术类似，但由于文 库组成是DNA与蛋白质的共价结合复合物，较mRNA与多肽的融合体 要稳定得多，使得P2 A共价展示分子文库比mRNA展示文库将更易于体 外操作。利用本发明方法建库并进行筛选的实践证明，本发明利用顺势 结合蛋白构建的的新型分子文库具有库容大，操作简单，可控性强，可 在较短时间内完成多轮次筛选等明显优势。是研究蛋白质、多肽间相互 作用的新方法。
本发明所构建的分子文库的组成是DNA与蛋白质的融合物，可以利 用蛋白质部分即表型设计不同的体外筛选策略寻找与目标分子特异结合 的分子。本发明对于分子文库的筛选可根据分子文库的组成采用体外亲 和筛选、功能性筛选等不同策略。筛选时根据分子文库的特点可以选用 小分子化合物做靶分子，也可用抗原、抗体、受体、配体等。筛选时可 以将靶分子固定在固相载体上，如96孔板，酶联免疫反应用试管等；也 可以不固定而处于自由状态。
利用本发明分子文库进行筛选，每一轮筛选之后，用蛋白酶消化掉 蛋白质部分，回收DNA部分，利用PCR法进行体外扩增，得到此轮筛 选后的DNA分子库。将此DNA分子库直接投入到下一轮筛选。如此反 复，经多轮筛选后可以富集得到与靶分子高亲合力特异性结合的配体。
本发明利用不同类型的分子库可以进行生物化学、免疫学等领域分 子识别、分子进化、及分子工程的研究。利用本发明筛选到的特异性结 合分子可以用于生物医药各领域的研究、开发。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明新型分子文库的建库方法作进一步详细的 描述，该实施例是用于解释该发明，不以任何方式限制本发明。 实施例l:构建A基因上游六肽库的方法
一、 设计DNA分子库设计含有6肽随机肽文库编码序列的融合 DNA分子。根据筛选及建库需要所设计的DNA分子库应包括编码顺式 结合蛋白的基因序列，需要表达的分子文库的基因序列，以及进一步体 外表达所需的启动子、核糖体结合位点、中止子相应的DNA序列。含有 6肽随机肽文库编码序列的DNA文库的融合DNA分子的构成为核糖 体结合位点、T7启动子、6肽随机肽文库编码序列、T7启动子控制下的 A基因，中止子。需要表达的分子文库的基因序列，随机肽分子文库插入 编码随机肽相应的核酸序列(XXT/ G) 6位于A基因的上游启动子下游。
二、 根据步骤一设计DNA分子库，采用DNA体外连接、基因重组 及PCR等方法构建DNA分子库。具体操作步骤如下
(1) 选择含有编码顺式结合蛋白的基因序列A基因的商品化质粒， 线性质粒pEN21，该质粒由Novagen公司产品质粒pET21a衍生，包含核 糖体结合位点、T7启动子、T7启动子控制下的P2野生型A基因，中止 子，该质粒具有氨苄抗性。
(2) 分子文库可根据步骤1中所设计的DNA分子库中6肽随机肽 文库编码序列位于A基因上游，含有6肽随机肽文库编码序列的DNA 序列插入位置位于顺式结合蛋白的上游，设计为相应的库引物(引物B) 为5' — CGA TCC CGC GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACC ACA ACG GTT TCC Ctc tag aAA TAA TTT TGT TTA ACT TTA AGA AGG AGA TAT ACC ATG (NNT/G)6 GCC GTT AAA GCC TCC GGG —3'， i亥引物为含有144个核 苷酸的超大引物，含18个碱基的随机序列及一个Xbal酶切位点。(3)以上述含编码顺式结合蛋白的基因序列、相应启动子、核糖体
结合位点、中止子组件的线性质粒pEN21为模板，加入库引物B及相对 应的与下游T7中止子区互补的引物D: 5' —CAAAAAACCCCTCAAGACCCG _3'，进行PCR反应，即可得到DNA分子库。在50ulPCR反应体系中 模板DNA (pEN21)10ng，0. lpmol/ml lul，引物B (25pmol/ml) 2ul，引 物D (25pmol/ml) lul， lOmMdNTP (New England Biolabs) lul， 10X De印 Vent PCR Buffer 5ul， De印Vent Polymerase lul，加去离子水至50ul 。 放入PCR仪中设置反应程序94°C 4， ， 94°C 30"， 55°C 30"， 72°C 2，， n=25，产物为合成的DNA分子库。
三、 DNA分子库扩增根据步骤2中DNA分子库的分子数，将其均分 为5份，以每一份为模板，进一步以T7启动子上游引物5' —AGATCTCGA TCC CGC GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG G—3'，和T7中止子区互补 的引物5' _CAA AAA ACC CCT CAA GAC CCG—3'，为引物进行PCR，扩 增DNA分子库，放入PCR仪中设置反应程序94°C 4， ， 94°C 30" , 55 °C 30" , 72°C 2，， n=25,进行PCR反应扩增DNA分子库。PCR后电泳鉴 定确定片段大小正确后为，DNA纯化试剂盒纯化DNA后序列分析，确定 随机序列插入到正确位置。根据半定量电泳分析及紫外分析估算DNA文 库的分子数为10l3。
四、 体外表达上述扩增产物即DNA分子库加到含有T7RNA聚合酶 的S30提取物的线性DNA体外表达系统中，采用大肠杆菌S30抽提物进 行体外表达，将步骤3中含编码随机序列的DNA文库lug与大肠杆菌S30 抽提物混合表达，50ul反应体系包括15ul大肠杆菌S30抽提物，20ul 缓冲液，2. 5ul 20mM的甲硫氨酸，5ul融合DNA文库，7. 5ul去DNA酶 的水，37"C反应1小时后，冰浴终止反应。采用Western Blot检测基因 的表达。Western Blot结果证明上述DNA分子库均表达成功，即得到共
14价展示分子文库。反应后中止反应得到反应后的S30提取物混合物中即 含有共价展示分子文库。
实施例2:构建共价展示十肽库的方法
一、 设计DNA分子库设计含有IO肽随机肽文库编码序列的融合 DNA分子。根据筛选及建库需要所设计的DNA分子库应包括编码顺式 结合蛋白的基因序列，需要表达的分子文库的基因序列，以及进一步体 外表达所需的启动子、核糖体结合位点、中止子相应的DNA序列。含有 10肽随机肽文库编码序列的DNA文库的融合DNA分子的构成为核糖 体结合位点、T7启动子、IO肽随机肽文库编码序列、T7启动子控制下的 A基因，中止子。需要表达的分子文库的基因序列，随机肽分子文库插入 编码随机肽相应的核酸序列(XXT/ G),()位于A基因的上游启动子下游。
二、 根据步骤一设计DNA分子库，采用DNA体外连接、基因重组 及PCR等方法构建DNA分子库。具体操作步骤如下
(1) 选择含有编码顺式结合蛋白的基因序列(如A基因)的商品化 质粒，线性质粒pEN21，该质粒由Novagen公司产品质粒pET21a衍生， 包含核糖体结合位点、T7启动子、T7启动子控制下的P2野生型A基因， 中止子，该质粒具有氨苄抗性。
(2) 分子文库可根据步骤(1)中所设计的DNA分子库中10肽随 机肽文库编码序列位于A基因上游，含有10肽随机肽文库编码序列的 DNA序列插入位置位于顺式结合蛋白的上游，设计为相应的库引物(引 物B)为5' — CGA TCC CGC GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACC ACA ACG GTT TCC Ctc tag aAA TAA TTT TGT TTA ACT TTA AGA AGG AGA TAT ACC ATG (NNT/G)GCC GTT AAA GCC TCC GGG —3'， i亥引物为含有 144个核苷酸的超大引物，含30个碱基的随机序列及一个Xbal酶切位点。
(3) 以上述含编码顺式结合蛋白的基因序列、相应启动子、核糖体结合位点、中止子组件的线性质粒pEN21为模板，加入库引物B及相对 应的与下游T7中止子区互补的引物D: 5' —CAAAAAACCCCTCAAGACCCG 一3'，进行PCR反应，即可得到DNA分子库。在50ulPCR反应体系中 模板DNA (pEN21)10ng，0. lpmol/ml lul，引物B (25pmol/ml) 2ul，引 物D (25pmol/ml) lul， lOmMdNTP(New England Biolabs) lul， 10X De印 Vent PCR Buffer 5ul, De印Vent Polymerase lul,加去离子水至50ul。 放入PCR仪中设置反应程序94°C 4， ， 94°C 30", 55°C 30"， 72°C 2，， n二25，产物得到的DNA片段为构建的DNA分子库。
三、 DNA分子库扩增根据步骤2中DNA分子库的分子数，将其均分 为若干份，以每一份为模板，进一步以T7启动子上游引物5'—AGA TCT CGA TCC CGC GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG G—3'，和T7中止子区互补 的引物5' —CAA AAA ACC CCT CAA GAC CCG—3'，为引物进行PCR，扩 增DNA分子库，放入PCR仪中设置反应程序94°C 4， ， 94°C 30" , 55 °C 30" , 72°C 2'， n=25,进行PCR反应扩增DNA分子库。PCR后电泳鉴 定确定片段大小正确后，Invitrogen DNA纯化试剂盒纯化DNA后序列分 析，确定随机序列插入到正确位置。根据半定量电泳分析及紫外分析估 算DNA文库的分子数为1012。
四、 体外表达上述扩增产物即DNA分子库加到含有T7RNA聚合酶 的S30提取物的线性DNA体外表达系统中，采用大肠杆菌S30抽提物进 行体外表达，将步骤3中含编码随机序列的DNA文库lug与大肠杆菌S30 抽提物混合表达，50ul反应体系包括15ul大肠杆菌S30抽提物，20ul 缓冲液，2. 5ul 20mM的甲硫氨酸，5ul融合DNA文库，7. 5ul去DNA酶 的水，37。C反应l小时后，冰浴终止反应。采用Western Blot检测基因 的表达。Western Blot结果证明上述DNA分子库均表达成功，即得到共 价展示分子文库。反应后中止反应得到反应后的S30提取物混合物中即
16含有共价展示分子文库。
实施例3:含HA标记物的三十肽库建库方法
一、 设计DNA分子库根据筛选及建库需要设计前面所述融合DNA 分子。所设计的含HA标记物的三十肽库DNA分子库包括编码顺式结合 蛋白的基因序列A基因全部编码序列。需要表达的分子文库的基因序列， 随机肽分子文库插入编码随机肽相应的核酸序列(C/A/GNN:b()。随机肽分 子文库编码基因位于A基因的下游，A基因上游为核糖体结合位点、启 动子DNA序歹U，随机30肽文库编码区域下游HA基因序列及中止子DNA 序列。启动子SP6启动子及TAC启动子的组合等。根据筛选需要还可以 在A基因的上游或下游插入特定的标记物基因HA基因序列。
二、 构建DNA分子库根据步骤1设计的DNA分子库，采用DNA 体外连接、基因重组及多步PCR的方法构建DNA分子库。具体包括以 下步骤
(1) 在体外通过基因重组将编码顺式结合蛋白的基因序列A基因克 隆入载体或质粒构建含启动子、核糖体结合位点、A基因和中止子的质 粒。将A基因可通过实验室常规的分子克隆及基因重组操作克隆至高表 达质粒启动子下游区域，构建质粒pTacP2A-HA。该质粒是A蛋白羧基 端融合H A的质粒。将克隆的A基因首先用PCR方法在其编码序列的3' 端引入XhoI酶切位点，将PCR产物亚克隆至中间载体，以便在A蛋白 羧基端加入不同的标记物。切下融合蛋白编码区的NcoI-SWI片断重新克 隆至pSPTac载体。加入HA标记物时，质粒用X/ioI和EcoRI双酶切插 入含编码HA标记物的序列及一对中止子序列的寡核苷酸。pSPTac载体 是用合成的含有Tac启动子和操纵子序列的寡核苷酸序列替换 pSPUTK(Stratagene公司产品)质粒的5'端非翻译区而得。
(2) 根据步骤(1 )质粒pTacP2A-HA的序列及(C/A/GNN)3Q的插入位置设计合成库引物引物5'-GAG TGG ACA CTC GAG GGT ACC (KNN)30 ATG TAC CCG TAC GAC GTT CCG GAC T-3'，以此引物用于羧 基端随机三十肽库的构建，
(3)为保证库容量，建库前分别将建库用DNA片段以及库引物进 行PCR扩增。具体方法如下
首先，以质粒pTacP2A-HA为模板PCR扩增得到建库用DNA片段。 PCR反应体系中pTacP2A-HA质粒10ng/ul，引物5'CTC GAG TGT CCA CTC CAT TAC TGT 3 ， ， 25pmol/ml;反向弓I物5 ，GTG TAG CAT CTG GCT TACTGAAGC3，，25pmol/ml 。 100ul反应体系中模板lul，引物各lul， 5mMdNTP4ul， 25mMMgCl26ul，含(,4)2804的10XPCR Buffer lOul，Taq 酶0.5ul( 2.5u)，加去离子水至lOOul。放入PCR仪中94°C 2，， 94°C 30"， 62°C 30"，72°C 30"n=30，扩增得到大片段DNA。
其次，库引物进行PCR扩增。模板为材料2中的138个碱基的寡核 苷酸片段，5'-GAG TGG ACA CTC GAG GGT ACC (KNN)3。 ATG TAC CCG TAC GAC GTT CCG GAC T-3'， lul约255ng。引物为5，-CG GTC GCT
GAG GGT ACC -3，和5，-GCT CCG TCG TCA TCC GAC GCC TGC TAT CAA CGA GCG TAG TCC GGA ACG TCG TAC GGG TA -3 ， 。 1 OOul反应 体系中模板O.lpmol/ml lul，引物各lul (25pmol/ml)， 5mMdNTP 4ul，25mMMgCl2 6ul，含(顺4)2804的10XPCR Buffer 10ul, Taq酶0.5ul (2.5u)，加去离子水至lOOul。放入PCR仪中94°C 2，， 94°C 30"， 64 °C 30",72°C 30"n=10,得到扩增后的库引物(小片段DNA)。
最后，PCR构建DNA分子库。模板为上述两步PCR扩增产物的混 合物，二者以等摩尔比混合做为模板。引物为5'AAGCTTACTCCCCAT CCCCCT3'， 25pmol/ml ; 5，GCT CCG TCG TCA TCC GAC GCC TG 3，25pmol/ml。 1 OOul反应体系中模板小片段(扩增后的库引物)lul约40ng， 大片段2.5ul约500ng，引物各lul， 5mMdNTP 4ul，25mMMgCl2 6ul，含 (NH4)2S04的10XPCR Buffer lOul, Taq : Vent(50u :lu) 0.5ul,加去离子水至 lOOul。放入PCR仪中94°C 2'，94。C 30",62。C 30", 72。C 30，，n=30， PCR 扩增得到构建的DNA文库。
三、 DNA分子库扩增根据重复步骤1中的PCR反应，扩增DNA 分子库，以上步得到的DNA分子库为模板，引物为5'AAGCTTACTCCC CATCCCCCT3，，； 5,GCT CCG TCG TCATCC GAC GCC TG 3，。引物 25pmol/ml各lul， 5mMdNTP 4ul,25mMMgCl2 6ul，含(NH4)2S04的10XPCR Buffer 10ul， Taq : Vent(50u :lu) 0.5ul,加去离子水至100ul。放入PCR仪中 94°C 2，， 94°C 30", 62°C 30", 72°C 30"n=30， PCR扩增得到扩增后的 DNA文库。采用半定量电泳分析及紫外分析估算DNA文库的含量，用 去DNA酶的蒸馏水溶解至lug/ul ， -2(TC保存。
四、 体外表达采用用于线性模板体外表达的T7S30提取物，将含 编码随机序列的DNA文库与大肠杆菌S30抽提物混合，50ul反应体系包 括15ul大肠杆菌S30抽提物，20ul缓冲液，2.5ul 20mM的甲硫氨酸， 5ul融合DNA文库(含文库DNAlug)， 7.5ul去DNA酶的蒸馏水，37 。C反应l小时后，冰浴终止反应。得到含HA标记物的三十肽库。 实施例4利用标记物进行体外亲和筛选
上述构建的含有HA标记及A蛋白的30肽随机肽文库，以抗HA抗 体(aHA)包被在96孔板或其它固相载体上，进行体外亲和筛选。具体 筛选步骤如下
1、抗HA抗体(25ug/ml,PBS稀释)100ul/管包被筛选用免疫试管， 4'C过夜。用PH7.2 PBS缓冲液润洗两次后用含0.2m g / m 1鱼精蛋白 DNA及2.5%干奶粉的封闭液封闭1小时，再 PH7.2 PBS缓冲液润洗两次。
2、 50ul反应体系中含T7RNA聚合酶的S30提取物15ul，文库DNA lug及2.5倍反应缓冲液共计34.5ul， 200mM甲硫氨酸0.5ul， 37'C反应 60分钟后置于冰上中止反应，待用。S30提取物混合物用含0.2m g /m
1鱼精蛋白DNA、 2.5%干奶粉、0.05%吐温20的PBS稀释10倍，100u1/ 管加入到封闭后的反应管中，室温反应l小时。
3、 反应后，充分润洗用含吐温20的PBS缓冲液洗涤3次，用含 0.2m g / m 1鱼精蛋白DNA、 2.5%干奶粉、0.05%吐温20的PBS润洗 3次，再用PBS缓冲液润洗5次。
4、 含50ug/ml蛋白酶K及0.5%SDS的TE缓冲液200ul/管加入到反 应管中，50。C反应30分钟洗脱，采用乙醇一氯仿法抽提DNA，然后用 醋酸钠沉淀DNA，离心20分钟后沉淀物用70%乙醇洗后，空气中风干， 溶解于不含RNA酶的去离子水中。得到第一轮筛选后回收的分子文库 DNA。经PCR扩增后，电泳鉴定，得到正确的DNA片段。经DNA序 列分析证实回收得到DNA分子文库。富集实验表明第一轮筛选可富集 200倍。
5、 对上述第一轮筛选后回收的DNA分子库进行PCR扩增(小片段 PCR)及再建库以上步第一轮筛选后回收的DNA为模板，lul模板约 含DNA 1 —2ng。引物为5TAT GCT CTT CTG CAC CAT CTG CCA GAC TGA C 3， (25pmol/ml)及5，GAT TAC GTC CAG TTC GAG ACG CTA CGC TCC GTC GTC ATC CGA CGC CTG 3， (25pmol/ml)。 lOOul反应体 系中模板lul，引物各lul， 5mMdNTP4ul， 25mMMgCl26ul，含(NH4)2S04 的10XPCRBuffer 10ul,Taq酶0.5ul ( 2.5u)，加去离子水至lOOul。放入 PCR仪中94°C 2，, 94°C 30"， 64°C 30", 72°C 40" n=30,产物为550bp。上 述回收扩增的小片段经Sapl酶切后，与建库用的大片断混合做为模板。弓l物为5，AAGCTTACTCCCCATCCCCCT3，，25pmol/ml; 5'GATTAC GTCCAGTTCGAG ACGCTAC3，25pmol/ml。 100ul反应体系中模板 小片段lul约30—40ng，大片段2.5ul约500ng，引物各lul， 5mMdNTP 4ul， 25mMMgCl2 6ul，含(丽4)2 S04的10XPCRBuffer lOul， Taq : Vent(50u :lu) 0.5ul，加去离子水至100u,放入PCR仪中94°C 2，, 94°C 30"， 62°C 30"， 72°C 30" n=30，进行PCR扩增，得到的产物即为新建的DNA分子文库。 此文库可用于第二轮筛选。第二轮筛选步骤与第一轮完全相同，只是筛 选包被的抗HA抗体浓度降低100倍，具体步骤如6 9
6、 抗HA抗体(250ng/ml,PBS稀释)100ul/管包被筛选用免疫试管， 4t:过夜。用PH7.2 PBS缓冲液润洗两次后用含0.2m g / m 1鱼精蛋白 DNA及2.5%干奶粉的封闭液封闭1小时，再用PH7.2 PBS缓冲液润洗 两次。
7、 50ul反应体系中含T7RNA聚合酶的S30提取物15ul，文库DNA 10ng及2.5倍反应缓冲液共计34.5ul， 200mM甲硫氨酸0.5ul， 37。C反应 60分钟后置于冰上中止反应，待用。S30提取物混合物用含0.2m g / m
1鱼精蛋白DNA、 2.5%干奶粉、0.05%吐温20的PBS稀释10倍，lOOul/ 管加入到封闭后的反应管中，室温反应l小时。
8、 反应后，充分润洗用含吐温20的PBS缓冲液洗涤3次，用含 0.2m g / m 1鱼精蛋白DNA、 2.5%干奶粉、0.05%吐温20的PBS润洗 3次，再用PBS缓冲液润洗5次。
9、 含50ug/ml蛋白酶K及0.5%SDS的TE缓冲液200ul/管加入到反 应管中，5(TC反应30分钟洗脱，采用乙醇一氯仿法抽提DNA，然后用 醋酸钠沉淀DNA，离心20分钟后沉淀物用70%乙醇洗后，空气中风干， 溶解于不含RNA酶的去离子水中。得到第二轮筛选后的回收的分子文库 DNA。经PCR扩增后，电泳鉴定，得到正确的DNA片段。经DNA序
21列分析证实回收得到DNA分子文库。富集实验表明第二轮筛选后可富集 100倍。两轮筛选后富集倍数达20， 000倍。
实施例5构建的6肽库对beta-2糖蛋白I体外亲和筛选
上述构建6肽随机肽文库，以beta-2糖蛋白I为筛选靶分子抗HA抗 体(aHA)进行体外亲和筛选。具体筛选步骤如下
1、 beta-2糖蛋白I (5ug/ml， PBS稀释)100ul/管包被筛选用96孔板， 4"C过夜。用PH7.2 PBS缓冲液润洗两次后用含0.2m g / m 1鱼精蛋白 DNA及2.5%干奶粉的封闭液封闭1小时，再用PH7.2 PBS缓冲液润洗 两次。
2、 50ul反应体系中含T7RNA聚合酶的S30提取物15ul，文库DNA 5ug及2.5倍反应缓冲液共计34.5ul， 200mM甲硫氨酸0.5ul， 37。C反应 60分钟后置于冰上中止反应，待用。S30提取物混合物用含0.2mg /m
1鱼精蛋白DNA、 2.5%干奶粉、0.05%吐温20的PBS稀释10倍，100u1/
管加入到封闭后的反应管中，室温反应l小时。
3、反应后，充分润洗用含吐温20的PBS缓冲液洗涤3次，用含 0.2m g / m 1鱼精蛋白DNA、 2.5%干奶粉、0.05%吐温20的PBS润洗 3次，再用PBS缓冲液润洗5次。
4、 含50ug/ml蛋白酶K及0.5%SDS的TE缓冲液200ul/孔加入到96 孔板中，5(TC反应30分钟洗脱，采用乙醇—氯仿法抽提DNA，然后用 醋酸钠沉淀DNA，离心20分钟后沉淀物用70%乙醇洗后，空气中风干， 溶解于不含RNA酶的去离子水中。得到第一轮筛选后回收的分子文库 DNA。经PCR扩增后，电泳鉴定，得到正确的DNA片段。经DNA序 列分析证实回收得到DNA分子文库。
5、 进一步以T7启动子上游引物5'—AGA TCT CGA TCC CGC GAAATTAATACGACTCACTATAGGG—3'，和T7中止子区互补的引物5' 一CAAAAAACC CCTCAAGAC CCG—3'，为引物进行PCR，扩增DNA 分子库，放入PCR仪中设置反应程序94°C 4'， 94°C 30"， 55°C 30", 72°C 2'， n=25，进行PCR反应扩增DNA分子库。进行第二轮筛选
6、 beta-2糖蛋白I (50ng/ml, PBS稀释)100ul/管包被筛选用96孔板， 4卩过夜。用PH7.2 PBS缓冲液润洗两次后用含0.2m g / m 1鱼精蛋白 DNA及2.5%干奶粉的封闭液封闭1小时，再用PH7.2 PBS缓冲液润洗 两次。
7、 50ul反应体系中含T7RNA聚合酶的S30提取物15ul，文库DNA 10ng及2.5倍反应缓冲液共计34.5ul， 200mM甲硫氨酸0.5ul, 37'C反应 60分钟后置于冰上中止反应，待用。S30提取物混合物用含0.2m g /m
1鱼精蛋白DNA、 2.5%干奶粉、0.05%吐温20的PBS稀释10倍，lOOul/
管加入到封闭后的反应管中，室温反应l小时。
8、 反应后，充分润洗用含吐温20的PBS缓冲液洗涤3次，用含 0.2m g / m 1鱼精蛋白DNA、 2.5%干奶粉、0.05%吐温20的PBS润洗 3次，再用PBS缓冲液润洗5次。
9、 含50ug/ml蛋白酶K及0.5%SDS的TE缓冲液200ul/孔加入到96 孔板中，50'C反应30分钟洗脱，采用乙醇一氯仿法抽提DNA，然后用 醋酸钠沉淀DNA，离心20分钟后沉淀物用70%乙醇洗后，空气中风干， 溶解于不含RNA酶的去离子水中。得到第二轮筛选后的回收的分子文库 DNA。经PCR扩增后，电泳鉴定，得到正确的DNA片段。经DNA序 列分析证实回收得到DNA分子文库。富集实验表明经二轮筛选后可富集 4000倍。
权利要求
1、一种新型分子文库，其特征在于它是由下列步骤构建的一、设计DNA分子库包括编码顺式结合蛋白的基因序列，需要表达的分子文库的基因序列，以及进一步体外表达所需的启动子、核糖体结合位点、中止子相应的DNA序列；二、构建DNA分子文库根据步骤一中DNA分子库的设计，可采用体外连接、重组及PCR方法构建DNA分子库，具体包括以下步骤(1).选择含有编码顺式结合蛋白的基因序列的商品化质粒，或在体外通过基因重组将编码顺式结合蛋白的基因序列克隆入载体或质粒；相应的载体或质粒除包含编码顺式结合蛋白的基因序列外，还需包含启动子、核糖体结合位点、中止子；(2).分子文库的基因序列可根据步骤(1)中所设计的分子文库位置插入位置位于顺式结合蛋白的上游还是下游，设计为相应的库引物；(3).以上述含编码顺式结合蛋白的基因序列、相应启动子、核糖体结合位点、中止子组件的载体、质粒、或PCR片断为模板，加入库引物及相对应的引物进行PCR反应，即可得到DNA分子库；三、DNA分子库扩增将步骤二得到的DNA分子库用启动子区的PCR引物和中止子区的PCR引物进一步进行PCR反应，获得进一步扩增的DNA分子库；四、体外表达上述扩增产物即DNA分子库加到适于线性DNA体外表达的S30提取物中进行DNA体外表达系统，反应后中止反应。得到的反应后的混合物即为共价展示分子文库。
2、 根据权利要求1所述的新型分子文库，其特征在于歩骤一、 设计DNA分子库包括编码顺式结合蛋白的基因序列，如噬菌体A基因，需要表达的分子文库的基因序列，随机肽分子文库插入编码随机肽相应的核酸序列序列可以是(XXT/ G)n或(C/A/GNN)n;随机肽分 子文库编码基因与顺势结合蛋白组成的融合基因上游为核糖体结合 位点、启动子DNA序列，下游为中止子DNA序列；启动子是T7启 动子、SP6启动子或TAC启动子；或根据筛选需要在A基因的上游 或下游插入特定的标记物基因。
3、根据权利要求1所述的新型分子文库，其特征在于步骤二、 构建DNA分子库具体包括以下步骤(l)选择含有编码顺式结合蛋白的基因序列A基因的商品化质粒， 或在体外通过基因重组将编码顺式结合蛋白的基因序列A基因克隆 入载体或质粒，构建含启动子、核糖体结合位点、A基因和中止子的 质粒；将A基因可通过实验室常规的分子克隆及基因重组操作克隆 至高表达质粒启动子下游区域；启动子是T7启动子、SP6启动子或 TAC启动子；根据需要还可以在A基因的上游或下游引入特定的标 记物基因HA， His, Myc， GPF;(2) 根据步骤(1)中所设计的分子库插入位置位于顺式结合蛋 白的上游还是下游，设计相应的库引物。含有随机肽核苷酸序列的库 引物，根据步骤(1)中质粒或DNA片段中A基因前后的碱基序列 及随机序列的插入位置前后的DNA序列设计并合成；插入的随机肽 相应的核酸序列序列是(XXT/G) 或(C/A/GNN) n;(3) 以上述含编码顺式结合蛋白的基因序列、相应启动子、核 糖体结合位点、中止子组件的载体、质粒、或PCR片断为模板，加入库引物及相对应引物(A基因上游及启动子上游区域的PCR引物或 A基因下游中止子区的PCR引物)进行PCR反应，即可得到DNA分 子库。
4、 根据权利要求1所述的新型分子文库，其特征在于步骤三、 DNA分子库扩增将步骤一、步骤二设计并构建得到的分子库用启 动子区的PCR引物和中止子区的PCR引物进一步进行PCR反应， 获得扩增后的DNA分子库；以步骤二的(1)的质粒或PCR片断为 模板，加入步骤二的(2)中的库引物及A基因上游及启动子上游区 域的PCR引物或A基因下游中止子区的PCR引物，进行线性PCR; 通过调整模板及引物的量即分子数获得；库容量在1012到1013个分子 的分子库。
5、 根据权利要求3或4所述的新型分子文库，其特征在于当 插入的随机肽为超过20肽的较大片段时，为增加库容量，可设计引 物先分别扩增扩增步骤二的(3)中的PCR反应的模板及库引物，再 进行PCR建库及步骤三的DNA分子库的扩增。
6、 根据权利要求1所述的新型分子文库，其特征在于步骤四对 上述DNA分子库的体外表达将歩骤三中的DNA文库稀释到表达 体系所需的分子数，加入到适于线性DNA体外表达的系统一大肠杆 菌S30提取物中进行体外表达，按照表达体系的最佳反应条件反应 30分钟 60分钟，表达后中止反应，得到共价展示肽文库。
7、 一种如权利要求l、 2、 3、 4、 5或6所述的新型分子文库的 构建方法。
全文摘要
本发明涉及一种新型分子文库及其构建方法，属分子文库技术，涉及分子生物学技术领域。它是由下列步骤构建的一、设计DNA分子库，二、构建DNA分子文库；三、DNA分子库扩增，四、体外表达。本发明所构建的分子文库的组成是DNA与蛋白质的融合物，可以利用蛋白质部分即表型设计不同的体外筛选策略寻找与目标分子特异结合的分子。筛选时根据分子文库的特点可以选用小分子化合物做靶分子，也可用抗原、抗体、受体、配体等。筛选时可以将靶分子固定在固相载体上，如96孔板，酶联免疫反应用试管等；也可以不固定而处于自由状态。
文档编号C40B40/04GK101565859SQ20091006709
公开日2009年10月28日 申请日期2009年6月10日 优先权日2009年6月10日
发明者曹文华 申请人:吉林大学