专利名称：一种制作弧形的凹陷小孔的pdms聚合物芯片的方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及聚合物芯片的加工，制作，修饰及其应用领域，特别提供了一种气动方式制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的方法与应用。
背景技术：
组织工程学是近年来兴起的一门新兴学科。它是应用生命科学和工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态生物替代物。组织工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。三维培养是利用各种方法及材料，使细胞呈空间立体方式生长，更接近于体内生长模式，形成类似体内组织的结构，发挥其功倉泛。·近年来利用制作弧形凹陷微结构形成三维细胞结构来研究细胞行为和功能越来越被人所关注。现在报道的微结构形成三维细胞结构一方面可为体外培养细胞提供与其组织来源相似甚至相同的细胞生长微环境和细胞联系，从而既有利于各类细胞的分化定向诱导，又有利于细胞分化表型的维持和增殖；另一方面可望在体外构建与各类组织、器官相应的细胞三维生长类似物或等同物。而其应用领域也涉及干细胞分化，胰岛细胞功能再生、体外器官重建等诸多方面。随着生物医学领域的需求，制作弧形凹陷微结构方法也在飞速发展，主要的方法有冰刻蚀，软刻蚀、电子束刻蚀，原位合成法，气动技术等(I、Park, J.Y. ;Hwang, C. M. ;Lee, S. -H. , Ice-lithographic fabrication of concave microwellsand a microfluidic network. Biomedical Microdevices 2008，11(I)，129-133 ;2、Xuj Y. ;Xie, F. ；Qiu, T. ;Xie，L ;Xing, W. ; Cheng, J. , Rapid fabrcation of a microdevicewith concave microwells and its application in embryoid body formation.Biomicrofluidics 2012，6 (I)，016504)。尽管上述方法现在已经发展的较为成熟，但仍有很多因素限制了其更加广泛的应用软刻蚀、电子束刻蚀等技术修饰的精度高，但其需要专业化的昂贵仪器并且操作复杂；原位合成法虽然操作简单，但其用于原位合成的分子价格昂贵并且合成的体系有时会用到大量有机试剂；气动方式技术简单、快速、成本低廉，但所需要的通道模板是要求带有小孔结构的通透模板，制作方法繁琐、操作复杂。综上所述，发明一种简单、快速、易于操作、环境友好、易于集成，可控性强、并且价格低廉的制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的方法具有十分重要意义的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的方法与应用，以解决以往制作工艺中存在的操作复杂、价格昂贵等问题。
本发明提供了一种制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的方法，该方法的具体步骤如下——利用软蚀刻技术制作含有多个小孔的通道联通的PDMS聚合物芯片模板；——制作PDMS (单体与引发剂配比为10 :1)薄膜，将上述的PDMS聚合物芯片模板面与薄膜封接，PDMS模板打孔下方连接金属管，连接处用AB胶封合，对整个装置进行硅烷化修饰；——将未固化PDMS聚合物溶液(单体与引发剂配比为10 :1)倾倒入装置中，通入空气，通过控制气压，调整气体的通入量，上述装置中的PDMS聚合物薄膜发生凸形形变，同时80°C加热固化PDMS聚合物溶液20分钟，剥离固化PDMS聚合物芯片，得到弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片。其中，所述的PDMS (单体与引发剂配比为10 :1)薄膜是通过配制未固化的PDMS溶·液，倒在硅片上以5000转速匀胶I分钟后，80°C加热2小时后得到。PDMS薄膜与PDMS薄板封接方法为等离子封接。本发明提供的制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的方法，所述的制作方法的驱动方式为通入空气的气动形式。本发明提供的制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的方法，所述的聚合物为PDMS聚合物或可以用于软刻蚀的聚合物。本发明提供的制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的方法，该方法中所形成的微米级别的凹孔，该微孔的宽度和结构为设计固定，然而，通过调节小孔的尺寸和气压来控制小孔的深度，并在同一气压下，产生不同深度的凹陷小孔。通入的气压越大，形成的小孔的深度越高。本发明还提供了凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的应用，使用本发明提供的方法制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片，对此芯片进行灭菌，表面修饰后的可以用于形成细胞小球并对其进行细胞的三维培养，例如以具有微米凹陷小孔结构的PDMS芯片表面形成三维细胞小球研究的方法将进行修饰后微米凹陷小孔结构的PDMS芯片为底层2，接种细胞悬液，在重力的条件下，细胞会自发的形成三维微球，长期培养后能保持三维结构的特殊功能。本发明提供的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的应用，所述芯片用于制作形成三维细胞小球并对进行三维细胞培养的表面修饰方法为PF-127溶液浸泡8小时。将使用本发明提供的修饰方法对有微米凹陷小孔结构的PDMS芯片，立刻用水和PBS清洗后即可接种细胞。本发明提供的以制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片方法，利用气动的方式的形成弧形的凹陷小孔的PDMS的表面，用于形成三维的细胞结构并长期培养，三维细胞能保持特定的功能。同时，本方法还为不具备专业刻蚀设备及技术的实验室提供了一种具有应用潜力的表面修饰平台。本发明提供的以弧形的凹陷小孔的PDMS的方法，其优点在于I、无需昂贵的刻蚀设备；2、操作简单、快速；；3、实验成本低廉
4、不涉及有机试剂，环境友好；5、可与其它技术集成化。
图I为以气动方式制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的方法的流程图；图2为以气动方式制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的三维细胞团形成的原理与流程图；图3为在不同的气压条件下产生的不同深度的凹陷小孔的PDMS表面；图4为以气动方式制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的接种小鼠软骨细胞的生长增殖情况；图5为小鼠软骨细胞分别在孔板和凹陷小孔的PDMS聚合物芯片培养三天后免疫表达II型胶原的荧光照片；图6为小鼠软骨细胞在凹陷小孔的PDMS聚合物芯片培养三天后免疫表达II型胶原的共聚焦照片。图7为小鼠软骨细胞在二维已经凹陷小孔的PDMS聚合物芯片培养三天后RNA水平的表达，目的基因为I型胶原，II型胶原，蛋白多糖。
具体实施例方式下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。实施例I利用软刻蚀技术制作PDMS通道模板，模板为12X 12的圆形小孔，模板的结构为圆柱形。配置未固化的PDMS (10:1)溶液，以每秒5000转的转速在干净的硅片倒入一定量PDMS溶液在匀胶机上匀胶一分钟后，在80°C下加热固化2小时。利用等离子体技术封接PDMS模板与薄膜，玻璃片，形成如图I的装置。整个装置硅烷化5分钟后，连接空气气瓶，通过调节气压的大小控制气体的进入量，倾倒未固化的PDMS (10 :1)，通入气体，并同时在80°C下加热20分钟。装置冷却后，玻璃上层PDMS芯片，可形成弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片。实施例2弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片进行细胞三维培养的原理与流程图如图2所示。弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片首先进行灭菌处理，紫外照射过夜，然后使用1%的PF-127溶液进行表面修饰8小时，接种细胞悬浮液，细胞在重力的作用下，会沉淀到芯片表面的小孔底部，自发的形成三维细胞团。实施例3基于以气动方式制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片高度的表征。图3显示了在不同气压条件下PDMS聚合物芯片表面的弧形的凹陷小孔的高度情况。并且图3中的a显示了 PDMS聚合物芯片表面的小孔在相同的气压条件下不同位置的高度差异，这说明了通过本方法可以相同的控制条件下同时产生不同高度的弧形的凹陷小孔。图3中的c显示了不同的气压条件下可形成不同的小孔的高度，这说明了通过本方法可以显著的控制产生不同高度的弧形的凹陷小孔。
实施例4基于以气动方式制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片用于小鼠软骨细胞的三维培养，亚型与功能的保持。图4显示了小鼠软骨细胞在弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片培养三天的生长情况，细胞间的连接越来越紧密，成团趋势明显。这证明了本方法弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片可形成三维的细胞结构。图5显示了小鼠软骨细胞在弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片培养三天后进行II型胶原的免疫荧光染色，对照组为在孔板中培养的二维小鼠软骨细胞，在三维培养条件下，II型胶原在小鼠的软骨细胞的表达明显。图6显示了小鼠软骨细胞在弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片培养三天后进行II型胶原的免疫荧光染色的共聚焦照片。图7显示了小鼠软骨细胞在弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片培养三天后进行荧光实时定量PCR，考察了三种目的基因I型胶原，II型胶原，蛋白多糖在mRNA水平上的表达，对照组为二维培养的小鼠软骨细胞，结果表明三维培养的小鼠软骨细胞I型胶原，II型胶原，蛋白多糖的表达与二维培养条件下的小鼠软骨细胞有着明显的差异。这证明了本方法弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片培养小鼠软骨细胞后可以
保持软骨细胞的去分化的功能。
权利要求
1.一种制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下 ——利用软蚀刻技术制作含有多个小孔的通道联通的PDMS聚合物芯片模板； ——制作PDMS聚合物薄膜，将上述的PDMS聚合物芯片模板，与PDMS薄膜封接后，再与玻璃片封接，底部用金属管连接空气，对整个装置进行表面修饰； ——将未固化后的PDMS聚合物溶液倒入上述的装置，通入空气，上述装置中的PDMS聚合物薄膜发生凸形形变，同时加热固化PDMS聚合物溶液，剥离固化PDMS聚合物芯片，得到弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片。
2.按照权利要求I所述的制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的方法，其特征在于制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片方法的驱动方式为通入空气的气动形式。
3.按照权利要求I所述的制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的方法，其特征在于该方法可通过调节小孔的尺寸和气压来控制小孔的深度，并在同一气压下，产生不同深度的凹陷小孔。
4.按照权利要求I所述的制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的方法，其特征在于所述加热固化PDMS聚合物溶液的温度为80摄氏度。
5.按照权利要求I所述的制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的方法，其特征在于所述加热固化PDMS聚合物溶液的时间为20分钟。
6.权利要求I所述方法制作的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的应用，其特征在于该芯片用于制作形成三维细胞小球并对进行三维细胞培养。
7.按照权利要求6所述PDMS聚合物芯片的应用，其特征在于所述芯片用于制作形成三维细胞小球并对进行三维细胞培养的表面修饰方法为PF-127溶液浸泡8小时。
全文摘要
一种制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的方法与应用，该方法的步骤为利用软蚀刻技术制作PDMS通道芯片模板；制作PDMS薄膜，将上述的PDMS通道芯片模板，与PDMS薄膜封接后，与玻璃片封接，底部用金属管连接气体，对整个装置进行表面修饰；将未固化后的PDMS聚合物溶液倒入上述的装置，通入气体，加热固化PDMS聚合物溶液，剥离PDMS芯片即可；表面修饰后的PDMS芯片可以用于细胞的三维培养，该方法无需昂贵的刻蚀设备，具有操作简单、快速，实验成本低廉，不涉及有机试剂，环境友好，可与其它技术集成化的优点。
文档编号C40B50/14GK102787364SQ20121027778
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月7日 优先权日2012年8月7日
发明者石杨, 秦建华 申请人:中国科学院大连化学物理研究所