本发明涉及纳米材料与纳米技术领域，具体是一种利用桂花叶片制备纳米银的方法。
背景技术：
纳米颗粒，又称纳米粉体，指的是尺寸至少在一个维度上处于纳米量级（1-100nm）的超细微粒。特殊的小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应以及宏观量子隧道效应等，使其表现出不同于宏观物质的特殊性能。纳米银是一种重要的金属纳米颗粒，在离子检测、化学物质检测、荧光信号增强、表面增强拉曼散射、抗菌性能研究以及医疗等方面均具有极高的应用价值。随着科技的迅猛发展，纳米银正逐步渗透到我们生活的每个角落，如抗菌牙刷、抗菌毛巾、医用抗菌纱布以及家用电器等。纳米银作为一种新的抗菌剂，具有广谱性、高效性与持久性等特点，目前已广泛应用于细菌、真菌以及病毒等病原微生物的抑制研究。
传统的纳米银制备方法主要包括物理方法与化学方法。物理法制备的纳米银纯度较高、活性较强，但是产量低、设备成本昂贵、能量消耗高以及稳定性差。化学法制备的纳米银产量高、设备投入少、速度快，但是易混入杂质、高毒试剂对生物与环境造成潜在的危害。随着环境保护观念日益深入人心，低耗能、低成本以及环境友好型的生物合成方法更符合“绿色化学”理念。该方法避免了复杂的机械操作以及高毒化学试剂的使用、原材料丰富、能够规模化生产并且成本低廉，目前已成为纳米材料领域研究的热点之一。
生物合成纳米银的原材料主要有微生物（细菌、放线菌、真菌）与高等植物。2000 年，Joerger 等利用斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）合成粒径介于20-200nm 的三角形或球形纳米银，随后芽孢杆菌、大肠杆菌、酵母菌以及镰刀菌等纷纷用于制备纳米银。自2002年Torresde等首次报道利用苜蓿合成粒径小于10nm的银纳米颗粒以来，越来越多的植物被用于此类研究，如洋葱、柿树、甜叶菊、孟加拉榕以及阿富汗松等。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供利用桂花叶片制备纳米银的方法，该方法具有易操作、低成本、低能耗、低毒性，同时还具有高产量和高稳定性。
利用桂花叶片制备纳米银的方法，包括以下步骤：
（1）将采集的桂花叶片用无菌水洗净并在无菌操作台将其吹干，除去叶柄和主叶脉并剪成约1cm2的碎片；
（2）取1-20g碎片于烧杯中加入100ml去离子水混合均匀，然后置于90℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随搅拌，得到混合物；
（3）混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）按体积比1:9的比例将滤液与去离子水混合得到混合液，然后在混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，调节混合液的pH在3-11之间；
（5）在步骤（4）所述混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为1-8mmol/L；
（6）将上述混合液置于4-80℃的水浴锅中反应15min即可得到纳米银。
作为优选的，所述的步骤（2）中采用5g碎片，步骤（4）中溶液pH值为9，步骤（5）混合液中AgNO3浓度为1 mmol/L，步骤（6）中水浴锅温度为60℃。
本发明中原料取材于木犀科下的桂花的叶片，其滤液在纳米银合成过程中充当还原剂，将溶液中的Ag+还原为Ag单质。溶液中的Ag+充当反应的中的被还原物质。
以优选方案为例，经过上述步骤，溶液由无色变为淡黄色，标志纳米银的形成。
采用紫外可见分光光度计测其吸光度，得到的吸收光谱在460nm处出现强吸收峰，其对应于纳米银表面的等离子体共振，进一步确定了纳米银的形成。
用透射电子显微镜（TEM）对产品进行进一步分析，TEM结果显示合成的纳米银为球形或近球形，分散性良好，粒径为10-35nm，根据TEM图像，随机选取200个纳米银颗粒，利用Image J软件测定并分析，105个纳米银颗粒分布在10-20nm范围内，85 个分布在 20-30nm；10 个分布在 30-40nm。
根据上述优选方案制备的纳米银溶液，现通过实验对其抑菌活性进行测定，本实验对纳米银和现有农药戊唑醇对玉米小斑病菌的抑菌效果进行对比。
一、实验步骤：
A、纳米银溶液制备
（1）将采集的桂花叶片用无菌水洗净并在无菌操作台将其吹干，除去叶柄和主叶脉并剪成约1cm2的碎片；
（2）取5g碎片于烧杯中加入100ml去离子水混合均匀，然后置于90℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随搅拌，得到混合物；
（3）混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）按体积比1:9的比例将滤液与去离子水混合得到混合液，然后在混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，调节混合液的pH至9；
（5）在步骤（4）所述混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为1mmol/L；
（6）将上述混合液置于60℃的水浴锅中反应15min即可得到纳米银。
B、对比试验
（1）将玉米小斑病菌在恒温培养箱中培养5-7天，然后用无菌水冲洗菌丝体制备菌悬液，并在显微镜下调节孢子浓度为106个/ml（血球板计数），并使各部分孢子浓度保持一致；
（2）用移液枪分别吸取100μl菌悬液滴至6个相同的PDA平板培养基上，利用灭菌涂布棒将其涂布均匀；
（3）用灭菌镊子分别夹取直径为5mm的无菌滤纸片置于上述6个PDA平板培养基上，每个PDA平板培养基上设有3片无菌滤纸片，在每个PDA平板培养基上的3个无菌滤纸片上分别滴加10μl纳米银溶液、10μl戊唑醇（20μg/ml）和10μl叶片滤液，静置5-10min；
（4）将6组PDA平板培养基置于恒温培养箱中，在30℃下黑暗条件培养2-3天，观察各滤纸片上的滴加物对玉米小斑病菌的抑制效果并测量抑菌圈直径。
二、实验结果与分析
为了使实验结果更具有一般性，对比试验中，采用了6组平行试验，每组中纳米银溶液是实验组，戊唑醇溶液是对比，叶片滤液是空白对照。实验数据经处理后结果如下：
纳米银溶液抑菌圈平均直径为11.3±0.24mm，戊唑醇溶液抑菌圈平均直径为7.3±0.85mm，叶片滤液不具有抑菌性能。
由此可以看出，经本发明所提供的一种利用桂花叶片制备纳米银的方法所制备的纳米银，其抑菌效果强于现有的戊唑醇，且稳定性也更好。
本发明的优点：桂花叶片四季常青，能够确保原材料充足，有利于工业化大批量生产。该方法操作简便、耗时短，原料中没有使用有毒的化学药品，纳米银的制备过程中也没有产生对环境有污染的成分。制备出的纳米银纯度高、稳定性好、杀菌能力强粒径均匀，适用于于病原菌抑制、病原菌抗药性逆转、环境重金属离子检测、有毒化合物检测等诸多领域。
具体实施方式
实施例一：
（1）将采集的桂花叶片用无菌水洗净并在无菌操作台将其吹干，除去叶柄和主叶脉并剪成约1cm2的碎片；
（2）取1g碎片于烧杯中加入100ml去离子水混合均匀，然后置于90℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随搅拌，得到混合物；
（3）混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）按体积比1:9的比例将滤液与去离子水混合得到混合液，然后在混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，调节混合液的pH至11；
（5）在步骤（4）所述混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为4mmol/L；
（6）将上述混合液置于80℃的水浴锅中反应15min即可得到纳米银。
取孢子浓度为106个/ml（血球板计数）的玉米小斑病菌菌悬液，均匀涂布于PDA平板培养基上，取直径为5mm的无菌滤纸片置于上述PDA平板培养基上，滴加上述实施例中制得的纳米银溶液10μl，静置10min后再在30℃下黑暗条件培养2-3天，测量其抑菌圈直径为10.2±0.62mm。
实施例二：
（1）将采集的桂花叶片用无菌水洗净并在无菌操作台将其吹干，除去叶柄和主叶脉并剪成约1cm2的碎片；
（2）取2g碎片于烧杯中加入100ml去离子水混合均匀，然后置于90℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随搅拌，得到混合物；
（3）混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）按体积比1:9的比例将滤液与去离子水混合得到混合液，然后在混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，调节混合液的pH至11；
（5）在步骤（4）所述混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为1mmol/L；
（6）将上述混合液置于80℃的水浴锅中反应15min即可得到纳米银。
取孢子浓度为106个/ml（血球板计数）的玉米小斑病菌菌悬液，均匀涂布于PDA平板培养基上，取直径为5mm的无菌滤纸片置于上述PDA平板培养基上，滴加上述实施例中制得的纳米银溶液10μl，静置10min后再在30℃下黑暗条件培养2-3天，测量其抑菌圈直径为7.5±0.41mm。
实施例三：
（1）将采集的桂花叶片用无菌水洗净并在无菌操作台将其吹干，除去叶柄和主叶脉并剪成约1cm2的碎片；
（2）取5g碎片于烧杯中加入100ml去离子水混合均匀，然后置于90℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随搅拌，得到混合物；
（3）混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）按体积比1:9的比例将滤液与去离子水混合得到混合液，然后在混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，调节混合液的pH至9；
（5）在步骤（4）所述混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为1mmol/L；
（6）将上述混合液置于60℃的水浴锅中反应15min即可得到纳米银。
取孢子浓度为106个/ml（血球板计数）的玉米小斑病菌菌悬液，均匀涂布于PDA平板培养基上，取直径为5mm的无菌滤纸片置于上述PDA平板培养基上，滴加上述实施例中制得的纳米银溶液10μl，静置10min后再在30℃下黑暗条件培养2-3天，测量其抑菌圈直径为11.3±0.24mm。
实施例四：
（1）将采集的桂花叶片用无菌水洗净并在无菌操作台将其吹干，除去叶柄和主叶脉并剪成约1cm2的碎片；
（2）取10g碎片于烧杯中加入100ml去离子水混合均匀，然后置于90℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随搅拌，得到混合物；
（3）混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）按体积比1:9的比例将滤液与去离子水混合得到混合液，然后在混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，调节混合液的pH至9；
（5）在步骤（4）所述混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为4mmol/L；
（6）将上述混合液置于60℃的水浴锅中反应15min即可得到纳米银。
取孢子浓度为106个/ml（血球板计数）的玉米小斑病菌菌悬液，均匀涂布于PDA平板培养基上，取直径为5mm的无菌滤纸片置于上述PDA平板培养基上，滴加上述实施例中制得的纳米银溶液10μl，静置10min后再在30℃下黑暗条件培养2-3天，测量其抑菌圈直径为9.2±0.62mm。
实施例五：
（1）将采集的桂花叶片用无菌水洗净并在无菌操作台将其吹干，除去叶柄和主叶脉并剪成约1cm2的碎片；
（2）取15g碎片于烧杯中加入100ml去离子水混合均匀，然后置于90℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随搅拌，得到混合物；
（3）混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）按体积比1:9的比例将滤液与去离子水混合得到混合液，然后在混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，调节混合液的pH在至9；
（5）在步骤（4）所述混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为2mmol/L；
（6）将上述混合液置于60℃的水浴锅中反应15min即可得到纳米银。
取孢子浓度为106个/ml（血球板计数）的玉米小斑病菌菌悬液，均匀涂布于PDA平板培养基上，取直径为5mm的无菌滤纸片置于上述PDA平板培养基上，滴加上述实施例中制得的纳米银溶液10μl，静置10min后再在30℃下黑暗条件培养2-3天，测量其抑菌圈直径为6.8±0.62mm。
实施例六：
（1）将采集的桂花叶片用无菌水洗净并在无菌操作台将其吹干，除去叶柄和主叶脉并剪成约1cm2的碎片；
（2）取20g碎片于烧杯中加入100ml去离子水混合均匀，然后置于90℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随搅拌，得到混合物；
（3）混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）按体积比1:9的比例将滤液与去离子水混合得到混合液，然后在混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，调节混合液的pH在至9；
（5）在步骤（4）所述混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为2mmol/L；
（6）将上述混合液置于80℃的水浴锅中反应15min即可得到纳米银。
取孢子浓度为106个/ml（血球板计数）的玉米小斑病菌菌悬液，均匀涂布于PDA平板培养基上，取直径为5mm的无菌滤纸片置于上述PDA平板培养基上，滴加上述实施例中制得的纳米银溶液10μl，静置10min后再在30℃下黑暗条件培养2-3天，测量其抑菌圈直径为9.3±0.47mm。