专利名称：一种含有oatp1b1启动子和报告基因的重组质粒及筛选oatp1b1诱导剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过激活孕烷受体(PXR)来调节其下游靶基因有机阴离子转运体IBl表达的诱导剂筛选方法。本发明还涉及含荧光报告基因的质粒。
背景技术：
肝脏是生物转化解毒的主要器官，在肝脏中存在多种类型的药物转运体，对于药物的吸收、分布和排泄起重要作用，如多药耐药相关蛋白，乳腺癌耐药蛋白，有机阴离子转运多肽家族等。0ATP1B1是有机阴离子转运多肽家族中最为重要的成员，0ATP1B1的编码基因SLC01B1不仅具有高度多态性，且已发现多个具有功能意义的突变型。目前已研究证实，0ATP1B1除靶向转运非结合型胆红素、胆汁酸、甲状腺激素等多种内源性物质外，还介导多种具有重要临床意义药物的肝脏跨膜转运，如抗恶性肿瘤药(伊立替康、甲氨喋呤)、调血脂药(普伐他汀、阿托伐他汀、匹伐他汀、罗苏伐他汀、西伐他汀)、抗高血压药(缬沙坦、 奥美沙坦、波生坦)、抗高血糖药(瑞格列奈、那格列奈)。0ATP1B1功能增强(如被诱导) 时，转运底物的能力提高，进入肝细胞的底物数量增加；反之，0ATP1B1功能降低(如某些位点的基因突变)时，进入肝细胞内的底物减少。因此0ATP1B1功能改变不仅与胆红素血症有密切联系，而且与药物的疗效和毒副作用紧密相关。全基因组关联研究(Genome-wide Association Study, GffAS)表明0ATP1B1功能缺陷的*5/*5基因突变者，转运辛伐他汀进入肝细胞的功能降低，致使辛伐他汀转运进肝细胞的数量减少、血浆药物浓度过高，致使其降脂疗效减弱而导致肌病等不良反应增加。因此，研究药物对0ATP1B1的诱导作用对于胆红素血症治疗以及药物安全合理应用有着重要的意义，见下表。0ATP1B1转运药物的毒副反应及解决方案等相关信息
药物相关疾病靶器官毒副反应解决途径采取策略普伐他汀、阿托伐他汀、高脂血症肝内横纹肌溶解、肌炎，提髙肝内药物浓度，减少诱导匹伐他汀、罗苏伐他汀“胆固醇逃逸”循环血药浓度，调整剂量0ΛΤΡ1Β1高胆红肝内加快肝细胞对胆红素的诱导素血症摄取、排泄0ATP1B1 原代培养的人肝细胞模型是经典的体外酶、转运体诱导研究模型。然而，人肝细胞模型受到伦理道德、组织来源、培养条件、无法做到高通量等众多限制，在实际研究中很少采用。因此，发明一种原材料易获得、操作简便、成本低廉、可实现高通量筛选的新方法应用在0ATP1B1诱导剂的开发研究中显得尤为重要
发明内容
本发明的目的是提供一种高通量筛选0ATP1B1诱导剂的方法.本发明的另一目的是提供一种含有0ATP1B1基因启动子(-U8to_lll 和-9957to-9940)和报告基因的重组质粒。本发明首先提供一种含有0ATP1B1启动子和报告基因的重组质粒，所说的 OATPIBl 的启动子区域是-U8to-lll 和-9957to_9940。其中本发明所述的含有0ATP1B1基因启动子和报告基因的重组质粒中所述报告基因可以为萤火虫荧光素酶基因，氯霉素乙酰转移酶、碱性磷酸化酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白、内酰胺酶等。每种荧光素酶都可以通过商业途径获得，也都各自有其特点。 但总的来说，由于萤火虫荧光素酶检测灵敏度高，检测容易等特点是目前最常用的作为启动子研究的报告基因。制备重组质粒的方法是已知的，例如由美国冷泉港实验室出版社的《分子克隆实验指南》详细论述了重组质粒的制备方法。本发明利用上面获得的重组质粒，通过以下方法来实现的筛选化合物的，包括如下步骤第一步将前述获得的含有0ΑΤΡ1Β1启动子和报告基因的重组质粒、P)(R表达质粒、以及内参质粒海肾荧光素酶共转染至人肝癌细胞株HepG2细胞中；第二步加入待筛选的可能具有激活P)(R调节0ATP1B1基因表达的化合物；第三步采用化学发光检测报告基因的表达以及海肾荧光素酶荧光，以二者的比值来反映不同的待筛选化合物对0ATP1B1基因表达的影响。研究发现，核受体对0ATP1B1的表达具有重要的调控作用，其中孕烷X受体(PXR) 是0ATP1B1最主要的转录调控因子。研究表明，P)(R被激活时，作用于0ATP1B1启动子区域 (-128to-lll和-9957to-9940)，使OATPIBl表达水平明显上调。如16 α -氰基孕烯醇酮 (PCN)、石胆酸、利福平等均可以通过激活P)(R而诱导0ΑΤΡ1Β1的表达增强、功能上调。P)(R的发现为研究0ATP1B1的诱导效应提供了新的思路。基于这一思路，将构建的0ATP1B1启动子荧光报告基因质粒、P)(R表达质粒(现有技术中已经公开，例如胡东莉等，CYP3A4和CYP2B6 药物诱导剂体外筛选体系的建立，中国医学工程，文章编号1672-20190007)08-0646-04) 和海肾荧光素酶一起瞬时共转染至人肝癌细胞株HepG2细胞中，构建成双荧光报告基因检测平台，即可在化学发光检测仪上检测荧光素酶活性，以萤火虫荧光与海肾荧光的比值反应不同的可能活性化合物对0ATP1B1转运体影响。该方法的建立为高通量筛选0ATP1B1诱导剂提供了可能。从而为疾病治疗、药物相互作用、药物安全合理运用及新药临床前研究提供更多的科学依据。原理作为内对照的海肾荧光素酶质粒和待测的荧光报告基因系列质粒分别编码海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶两种不同的蛋白质。在形成氧化荧光素过程中，通过介导电子转移将化学能转化为光能，因而发光。两个报告基因在实验宿主细胞内均无内源活性， 即1、宿主细胞内没有这两个报告基因；2、两个报告基因本身不参与细胞的生理活动。可在单个样品中连续测量。在测量过程中，首先加入荧光素酶检测试剂II产生萤火虫荧光信号，信号持续至少lmin，这样先测量萤火虫荧光素酶报告基因。定量萤火虫荧光强度后，再在同一样品中加 A^op&Glo 试剂，将上述反应猝灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，同时进行第二次测量。
本发明的重组质粒其中的双荧光素酶报告基因检测基因表达具有如下优点1)灵敏度高、特异性强、检测速度快、费用低、材料易获得；2)同时具有靶向性的特点，能够特异性检测激活P)(R从而影响0ATP1B1表达的活性化合物；3)克服了转染效率的影响。
图1是本发明提供的0ATP1B1启动子荧光报告基因重组质粒及双酶切后的电泳图；图2是本发明重组质粒pGL-4. 17-0ATP1B1测序图；图3是本实验的操作流程图；图4是利福平激活P)(R对0ATP1B1表达的影响结果；图5是中药单体黄芩苷激活P)(R对0ATP1B1表达的影响结果。具体的实施方式实施例1构建0ATP1B1启动子荧光报告基因质粒，瞬时转染至H印G2细胞，构建双荧光报告基因技术平台。一、材料1.质粒、细胞株pGL-4. 17荧光报告基因载体，pPEM-T载体，pcDNA3. 1-myc/hisB(-)真核表达载体美国promega公司。HepG2细胞株中国医学科学院肿瘤细胞库。2.主要试剂胎牛血清(杭州四季青)；MEM培养基(美国Gibco公司)；50ml细胞培养瓶， 24孔细胞培养板(美国Corning公司)；RevertAid First Strand cDNA逆转录试剂盒 (Fermentas 公司)；Lipofectamine 2OOO 脂质体(美国 hvitrogen 公司)；DNA 提取试剂盒(promega) ；Trizol (美国 Invitrogen 公司)。3.主要仪器PCR仪(美国Hiermo)；电泳设备(北京六一)；CO2细胞培养箱(美国Iliermc^orm， SeriesII)；超净工作台(美国thermal) ；Sirius C单管式化学发光检测仪(Berthold公司)；GIS-2009凝胶成像分析系统(Tanon公司)；低温微量离心机(Eppendorf公司)。二、实验方法1. OATPIBl启动子荧光报告基因质粒的构建1. 1血样采集和DNA抽提采集健康志愿者外周静脉血5mL，至于EDTA抗凝的玻璃试管，贮存于_40°C冰箱备用。按照标准苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，置于4°C冰箱备用。1. 20ATP1B1PCR1.2.1引物设计根据人的0ATP1B1启动子序列及P)(R与其启动结合的区域设计引物
结合区l(-128to_lll)引物F为上游5'端引物，其中包含19个0ATP1B1基因启动子互补碱基，一个KpnI识别位点，2保护碱基；引物R为上游3'端引物，其中包含19个0ATP1B1基因启动子互补碱基，一个Nhel 识别位点，2保护碱基；引物 F TCGGTACCCCAGTGATGATTAACCACC引物 R :CCCGATCG CCAGGTGGTATCTCCAGTC结合区2(-9957to-9940)引物F为上游5'端引物，其中包含19个0ATP1B1基因启动子互补碱基，一个Hind III识别位点，2保护碱基；引物R为上游3'端引物，其中包含19个0ATP1B1基因启动子互补碱基，一个B10I 识别位点，2保护碱基；引物FTCAAGCTTCAAGCAGGGGCAATCTGTC
引物RCCCTCGAGGAGGGAGTAGGCAATGCTC
1. 2. 2扩增片段(--128to-lll) ；(-9957to-!
1. 2. 3扩增体系
前引物(10 μ M)0. 5μ 1
后引物(10 μ Μ)0. 5μ 1
dNTP (2. 5mM)1. 5μ 1
rTaq 酶(5u/ μ 1)0. 20 μ 1
10XPCR buffer2. 5μ 1
MgCl 20. 5μ 1
ddH2017. 30 μ 1
cDNA2μ 1
最终反应体系25 μ 1
1.2. 4扩增条件
结合区1扩增条件
95 0C5分
95 0C30秒
56 0C30秒40循环
72 0C1分
72 0C5分
结合区2扩增条件
95 0C5分
95 0C30秒
60 0C30秒40循环
72 0C1分
72 0C5分1.3扩增产物回收扩增产物于1. 0%的琼脂糖凝胶电泳60min，溴乙锭染色，于紫外灯下切下目的条带胶块。用QIAGEN公司的凝胶回收试剂盒回收目的片断，步骤如下①切好的胶块称重后置于1.5EP管内，加3倍于凝胶重量的QXlbuffer，加入 lOulQIAEX II (玻璃粉末)；颠倒混勻，充分重悬QIAEX II。②50°C水浴lOmin，每^iin颠倒混勻EP管，重悬玻璃粉末。③ 13000r/min 离心 lmin，弃上清。④加500ul QXlbuffer，重悬玻璃粉末。⑤ 13000r/min 离心 lmin，弃上清。⑥加入500ul buffer PE，重悬玻璃粉末。⑦ 13000r/min 离心 lmin，弃上清。⑧在50烤箱干燥3-5min，直到沉淀变白。⑨加入20ul ddH20，室温孵育5min充分溶解。1. 4把OATPIBl的PCR产物连接在pPEM_T载体上，提取质粒，酶切和测序。扩增产物均用rTaq酶于70°C，10min加“A”。与pGEM-Τ载体进行连接反应，反应体系2Xligation buffer 5. Oul，力口 “Α” 的 per 产物 3. 5ul，T vector 0. 5ul, T41igase LOul ； 16°C水浴过夜。连接产物转化JM109大肠杆菌，步骤如下①连接产物20ul加入200ul自制的JM109感受态细菌中，轻轻旋转数次混勻，冰上放置30min。②42°C水浴热休克80s。③快速置冰上冷却2_;3min。④加入不含Amp的LB液体培基800ul。⑤37°C，150r/min,振摇 Ih。⑥ 13000r/min 离心 10s，去上清 800ul。⑦重悬沉淀，均勻涂布于Amp阳性的LB固体培养基上。⑧倒置培养板于37°C培养16h。挑菌落培养，从大肠杆菌中提取与目的片断相连的T质粒，碱裂解法小量抽提质粒DNA，进行酶切鉴定。重组克隆使用SPIN柱抽提纯化质粒，用于测序。OMEGA D6942-01试剂盒提取质粒步骤如下I离心收集1.5_5ul菌液沉淀。II加入250ul包含RNA酶的solution I (细菌重悬液)，充分重悬沉淀
III加入250ul solution II (细菌裂解液)，轻轻颠倒混勻4-6次，室温孵育^iin 充分裂解细菌。IV加入350ul solution 111(蛋白沉淀液)，轻微颠倒混勻6-8次，使蛋白质充分沉淀。V 13000g 室温离心 lOmin。VI转移上清于 HiBind 柱，13000r/min 离心 lmin。ΥΠ加入 500ul Buffer HB，13000r/min 离心 lmin。VDI加入 700ul Wash Buffer，13000r/min 离心 lmin。IX重复步骤VIL
7
X 13000r/min 空转 2min。XI换新的无菌1.5EP管，加入HiBind柱中60ul ddH20，室温孵育anin。13000r/min 离心 lmin，收集质粒。1. 5将测序证实插入片段无PCR错配的质粒DNA和PGL4. 10载体用内切酶双酶切， 用琼脂糖电泳分别回收插入片段及载体，使用凝胶块快速链接。转化JM109大肠杆菌，挑取单克隆抽提质粒，酶切鉴定，步骤同上。1.6重组克隆进一步培养扩增。使用PR0MEGA中量质粒提取试剂盒制备质粒DNA。质粒DNA保存在70%乙醇中保持无菌状态，_20°C冻存待用。步骤如下I 50ul 菌液加入 50ml LB 液体培基中，220rpm/min 振摇 12_16h。II 5000g离心5min收集细菌，弃上清，在滤纸上留尽余液。III加入3ml细胞重悬液(cell resuspension solution)用枪充分打勻。IV加入3ml细胞裂解液(cell lysis solution)，轻轻颠倒3-5次，静置3min。V加入 5ml 平衡液(neutralization solution)，轻轻颠倒 5-6 次，直立 2_3min， 至白色沉淀出现。VI将蓝色干净的离心柱放在新的50ml离心管上。ΥΠ将上清导入干净的离心柱，静置anin。VDI 3000g 离心 5min。IX将滤液导入结合柱(binding column)，用废的50ml离心管收集下清，3000g离心3min，弃下清。X结合柱中加入20ml洗脱液，1500g离心5min，弃下清，3000g重复离心5-10min。XI空转后滤纸吸尽乙醇。ΧΠ加入800ul ddH20，3000g离心5min，干净的50ml离心管收集下清，最后移入 1. 5EP管中分装-40°C保存待用。2. PXR cDNA表达质粒的构建2. IRNA抽提和逆转录用iTrzol从原代培养的肝细胞中提取总RNA，用RevertAid First Strand cDNA 逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。2. 2PXRPCR2. 2.1 引物2. 2. 2扩增编码区长度2. 2. 3扩增体系2. 2. 4扩增条件2. 3把PXR的PCR产物连在pPEM_T载体上和测序2. 4将测序证实插入片段无PCR错配的质粒DNA和pcDNA3. 1-myc/hisB (-)载体双酶切，用琼脂糖电泳分别回收插入片段及载体，使用凝胶块快速链接。转化JM109大肠杆菌，挑取单克隆抽提质粒，酶切鉴定。重组克隆进一步培养扩增，抽提质粒DNA。质粒DNA保存在70%乙醇中保持无菌状态，-20°C冻存待用。3.双荧光报告基因检测
步骤如下3. 1.培养H印G2细胞;待H印G2细胞生长至对数期时，消化以每孔2 X IO5个细胞的密度接种至M孔板， 待细胞生长至80%。3. 2.共转染3. 2. 1每孔分别需转入600ng P)(R质粒，300ng 0ATP1B1启动子荧光报告基因质粒和50ng海参荧光素酶。用适量不含抗生素和胎牛血清的培养液分别稀释DNA和 Lipofectamine2000脂质体后，将二者混合，室温放置20min。3. 2. 2用PBS清洗细胞三次，然后每孔加入不含胎牛血清MEM培养基1ml。3. 2. 3将上述混合物(DNA/脂质体)按每孔200ul加入到M孔板中，轻轻晃动培养板使其混勻。3.3.加阳性药物利福平处理6h后，换新鲜含10%胎牛血清的MEM，同时加入药物。设对照组、阳性药物利福平组(IOumol)，每组4个复孔。3.4.利福平对报告基因的活性影响3. 4. 1孵育24h后，将培养基从待检细胞吸出。3. 4. 2用1 X PBS轻轻漂洗细胞洗3次。3. 4. 3向细胞培养孔中加入适量1 X被动裂解缓冲液(PLB)。3. 4. 4检测荧光素酶活性。a)在1. 5ml离心管中加入20ul细胞裂解液，然后加入 IOOul的LARII溶液，混合后放入发光检测仪检测第一次发光值(萤火虫荧光值)；b)然后加入Mop&Glo检测液，终止第一次发光，同时开始第二次发光，混合后放入发光检测仪检测第二次发光值(海肾荧光值)。4.结果判定以萤火虫荧光与海肾荧光的比值分别反映不同待检测化合物激活PHUiOATPlBl 启动子活性的影响。启动活性就是看两个荧光素酶的比值，比值大活性强，比值小活性弱。 那么评价标准就是看加药组的比值与不加药组的比值的差异。有差异就认为药物有活性。 如加有利福平的细胞组荧光比值为5. 013士0. 894，未加利福平处理的细胞组，荧光值为 2. 305士0. 630，(ρ < 0. 05)(见图 4)。实施例2采用上述建立的实验方法研究中药单体化合物黄芩苷是否可以通过激活P)(R来诱导0ATP1B1表达。操作步骤1.培养H印G2细胞；待H印G2细胞生长至对数期时，消化以每孔2X IO5个细胞的密度接种至M孔板， 待细胞生长至80%。2.共转染2. 1每孔分别需转入600ng P)(R质粒，300ng 0ATP1B1启动子荧光报告基因质粒和50ng海参荧光素酶。用适量不含抗生素和胎牛血清的培养液分别稀释DNA和 Lipofectamine2000脂质体后，将二者混合，室温放置20min。
2. 2用PBS清洗细胞三次，然后每孔加入不含胎牛血清MEM培养基1ml。2. 3将上述混合物(DNA/脂质体)按每孔200ul加入到M孔板中，轻轻晃动培养板使其混勻。3.加中药单体化合物处理6h后，换新鲜含10%胎牛血清的MEM，同时加入药物。设对照组、阳性药物利福平组(IOumol)、待检测中药单体化合物黄芩苷组(1、10、IOOumol三个浓度组)，每组4个复孔。4.中药单体化合物黄芩苷对报告基因的活性影响4. 1孵育24h后，将含有药物中药单体化合物黄芩苷的培养基从待检细胞吸出。4. 2用IXPBS轻轻漂洗细胞洗3次。4. 3向细胞培养孔中加入适量IX被动裂解缓冲液(PLB)。4. 4检测荧光素酶活性。a)在1. 5ml离心管中加入20ul细胞裂解液，然后加入 IOOul的LARII溶液，混合后放入发光检测仪检测第一次发光值(萤火虫荧光值)；b)然后加入Mop&Glo检测液，终止第一次发光，同时开始第二次发光，混合后放入发光检测仪检测第二次发光值(海肾荧光值)。以萤火虫荧光值与海肾荧光值的荧光比值分别反映中药单体化合物黄芩苷激活P)(R对0ATP1B1启动子活性的影响。5.结果判定以萤火虫荧光与海肾荧光的比值分别反映不同可能活性化合物激活P)(R对 0ATP1B1启动子活性的影响。研究发现黄芩苷能通过激活P)(R使0ATP1B1转录活性增强 (见图5)。黄芩苷在UlOUOOumol三个浓度时，其测得的荧光比值分别为4. 527士0. 291、 4. 810士0. 846,5. 102 士0. 586，与对照组 2. 348士0. 404 比较 P 值小于 0. 05。
权利要求
1.一种含有0ATP1B1启动子和报告基因的重组质粒，所说的0ATP1B1的启动子区域是-128 至-111 和-9957 至-9940。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所说的报告基因为萤火虫荧光素酶。
3.一种高通量筛选0ATP1B1诱导剂的方法，包括如下步骤第一步将权利要求1或2所获得的重组质粒、P)(R表达质粒、以及内参质粒海肾荧光素酶共转染至人肝癌细胞株HepG2细胞中；第二步加入待筛选的可能具有激活P)(R调节0ATP1B1基因表达的化合物； 第三步采用化学发光检测报告基因的表达以及海肾荧光素酶荧光，以二者的比值来反映不同的待筛选化合物对0ATP1B1基因表达的影响。
全文摘要
本发明属于分子药理学领域，涉及一种通过激活孕烷受体(PXR)来调节其下游靶基因有机阴离子转运体1B1表达的诱导剂筛选方法。该方法是通过克隆有机阴离子转运体1B1(OATP1B1)基因的启动子特异性序列(-128to-111和-9957to-9940)并重组到萤火虫荧光素酶报告基因载体，同时构建人PXR表达质粒。将构建的OATP1B1荧光报告基因重组质粒，人PXR表达质粒以及海肾荧光素酶共转染至人肝癌细胞株HepG2细胞。同时检测萤火虫和海参荧光素酶的活性反应OATP1B1基因启动子的转录活性。从而建立靶向筛选OATP1B1诱导剂的方法，进而为疾病治疗、药物相互作用、药物安全合理运用及新药临床前研究提供更多的科学依据。
文档编号C12Q1/66GK102373231SQ20101025249
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者吴兰香, 周宏灏, 张伟, 郭成贤 申请人:中南大学