专利名称：聚乙二醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯及其制备方法
技术领域：
本发明涉及无机化学及生物医学领域，具体涉及ー种可用作細胞转染试剂的聚乙 ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯及其制备方法。
背景技术：
转染是指将外源DNA导入細胞，从而获得新的遗传性状的过程。基因转染技术是研究基因功能和基因治疗的重要技术之一。转染试剂是基因转染技术的核心，理想的基因转染试剂应具备如下特点高转染效率，低細胞毒性，生物安全性好，操作简便等。目前的转染试剂可以分为两类病毒载体和非病毒载体。病毒载体的转染效率高，但存在潜在的生物安全性问题。非病毒载体包括脂质体，高分子聚合物以及纳米颗粒。具有转染效率低，細胞毒性高等问题。因此我们需要建立一个有效快捷而安全的转染试剂将目的基因运送到細胞中。目前，昆虫細胞广泛应用于医学、农业及生物学的各个方面。有研究表明，基因的表达调控与蛋白质的翻译后加工(例如糖基化以及乙酰化过程)在昆虫細胞中和哺乳細胞中相似，因此利用昆虫細胞如果蝇细胞将外源基因导入，从而研究基因的瞬时表达及功能得到了广泛的关注。与贴壁的哺乳动物細胞相比，昆虫细胞是一种半贴壁細胞，利用传统的转染技木，如磷酸钙共沉淀法，其转染效率较低。现在，有不同的商业化的转染试剂，如Lipofectamine 2000是ー种应用较为广泛的转染试剂，对于贴壁的哺乳动物的转染效率较高，但对于昆虫細胞的转染效率低。 Effectene是QIAGEN公司研发的针对原代细胞以及敏感性細胞系的转染试剂，其转染效率优于Lipofectamine 2000，但其对昆虫細胞的转染效率仍较低。聚乙烯亚胺是ー种高分子聚合物，带正电荷的阳离子聚合物能与带负电荷的DNA相互作用，从而能将DNA导入細胞， 其转染效率较高，但细胞毒性高。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，本发明提供了一种聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯，作为ー种高效且安全的基因转染试剂进行应用。为达到上述发明目的，本发明的技术方案是
一种聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯，包括氧化石墨烯、聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺，所述聚乙ニ醇为支链结构，6条支链的一端分别连接在葡萄糖分子的羟基上，另一端都为氨基，数均分子量为10000 ；所述聚乙烯亚胺为支链结构，分子质量为25000 ；以所述氧化石墨烯、聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺为原料，制备得聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯，所述聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯的高度为Inm 2nm，尺寸为5nm 50nmo上述聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯的制备方法，其中聚乙ニ醇修饰氧化石墨烯的方法可參照刘庄课题组的，通过Hummers方法制备氧化石墨烯，超声处理5分钟后，向其中加入聚乙ニ醇并继续超声处理5分钟。上述两种材料的区别在于1，本专利中采用的氧化石墨烯和聚乙ニ醇的投料比为1:1，而刘庄课题组发表的文章中的材料的采用的投料比为1:5，；2，本专利中所使用的材料中引入了高分子聚乙烯亚胺。(參见YANG K, et al. Nano Lett. , 2010，10 (9)，3318 - 3323)
由于上述技术方案的运用，本发明与现有转染试剂相比具有下列优点 本发明的聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯制备简单，并且其对昆虫細胞的转染效率较高，在氮磷比30时即可达到70%左右；同时，聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯对細胞活性影响较低，在氮磷比30的浓度条件下，細胞能保持93%左右的活性。对于贴壁的哺乳动物細胞，聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯的转染效率与 Lipofectamine 2000相近。因此，本发明的聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯，可用作基因转染试剂，有效且安全将基因输送到細胞中。通过实验，以绿色荧光蛋白基因作为报告基因，利用制备的聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯转染DNA进入果蝇細胞，发现其具有以下优点
1.超螺旋质粒DNA转染效率较高。在氮磷比为30吋，其转染效率能高达70%左右，明显高于商业化转染试剂以及PEI。2.线性DNA转染效率高。质粒DNA放置一段时间后，其会断裂行成线性DNA，研究了聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯对线性DNA的转染效率后，发现其效率比PEI 和Lipofectamine 2000能高出10倍以上。3.操作简便。一般的转染试剂，如Lipofectamine 2000需在无血清的条件下进行转染，而本发明的转染试剂聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯则可以在有血清的条件下进行。4.細胞活性高，生物安全性好。通过MTT实验，发现聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯在氮磷比30的浓度条件下处理細胞M小时后，細胞的活性能保持93%左右，生物安全性高。
图1为实施例1中所得的聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯的原子力显微镜图。图2为实施例1中所得的聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯的红外图。图3为实施例1中所得的聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯的热重分析图。图4为实施例1中所得的聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯与其他转染试剂的转染效率对比表。图5为实施例1中所得的聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯对果蝇细胞的細胞活性分析图。
具体实施例方式实施例1 制备昆虫細胞转染试剂聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯(G0-6NH2-PEG-25k-PEI)
以1克膨胀石墨为起始原料，与约30克氯化钠固体混勻研磨至无明显肉眼可见颗粒， 然后加蒸馏水溶解抽滤，洗涤除去氯化钠，将得到的固体烘干备用。将烘干的已研细的石墨加入三角烧瓶中，井向其中加入约30毫升的浓硫酸，室温搅拌8小吋。然后将三角烧瓶置于冰浴中，缓慢加入约3克高锰酸钾固体，并加热至115°C，接着向三角烧瓶内加入约150毫升蒸馏水，之后加入约10毫升30%过氧化氢溶液并搅拌，离心除去上层水溶液，最后反复水洗离心至不再有沉淀出现为止。然后取5毫升3毫克/毫升的氧化石墨烯悬浊液超声处理 30分钟，接着向溶液中加入约1. 8克氢氧化钠固体，50°C水浴搅拌4小时，然后用浓盐酸调整溶液PH值为1左右。最后用蒸馏水离心洗涤至溶液呈中性，得到水溶性良好的碱化石墨烯溶液。取1毫克碱化石墨烯溶液并稀释至5毫升，将稀释的碱化石墨烯溶液超声处理5 分钟后向其中加入1毫克聚乙ニ醇，然后继续超声5分钟，接着向溶液中加入约1毫克EDC 并继续超声20分钟，再接着向溶液中加入约5毫克聚乙烯亚胺并超声5分钟，再次向溶液中加入约2. 5毫克EDC，继续超声20分钟后室温搅拌过夜。用100纳米的滤膜抽滤纯化即可得到聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯(G0-6NH2-PEG-25k-PEI)。对上述聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯(G0-6NH2-PEG-25k_PEI)进行原子力显微镜(AFM)分析，得图1，从图可知聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯尺寸是 5nm_50nm,高度为 lnm-2nm。对上述聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯(G0-6NH2-PEG-25k_PEI)进行红外分析(IR)，得图2，热重分析(TGA)，得图3，从图可知聚乙ニ醇(PEG)和聚乙烯亚胺 (PEI)都有效地连接到氧化石墨烯(GO)上。对上述聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯(G0-6NH2-PEG-25k_PEI)进行元素分析，可得聚乙ニ醇(PEG)的质量百分比为洲左右，聚乙烯亚胺(PEI)的质量百分比为 37 士 3%。实施例2:研究实施例1中所得的聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯 (G0-6NH2-PEG-25k-PEI)作为昆虫細胞转染试剂的应用
将实施例1中所得的聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯 (G0-6NH2-PEG-25k-PEI)和质粒pTub_GFP或线性pTub_GFP在室温下相互结合，然后进行转染，通过观察绿色荧光蛋白GFP的表达量，从而測定转染效率。具体方法为果蝇細胞 (3*105个/毫升)培养在35mm的培养皿中，加入1毫升的含5%FBS的果蝇培养基，在25. 5°C 条件下，昆虫培养箱中培养M小吋。将5. 5微克的聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯加入到200微升的含5%FBS的果蝇培养基中，混勻。将1微克质粒DNA加入另ー 200微升的含5%FBS的果蝇培养基中，混勻；然后将两者混合，室温静置lh。处理果蝇細胞，吸去旧培养基，加入500微升新的含5%FBS的果蝇培养基。然后将石墨烯与DNA的混合物加入到培养基中，培养24h后，在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达量，以及通过流式细胞仪，检测绿色荧光蛋白的荧光强度，从而检测转染效率。对于检测聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯对线性DNA的转染效率，方法与转染质粒DNA相同。结果显示根据绿色荧光蛋白的荧光强度，可以看出G0-6NH2-PEG-2^-PEI转染效率较高，在氮磷比为30吋，其质粒DNA转染效率能达到70%左右，明显高于PEI (11. 32%)，Lipofectamine 2000 (27. 32%)以及以及 Ef f ectene (34.68%)。对于线性 DNA 的转染效率，G0-6NH2-PEG-25k-PEI (22. 24%)明显优于其他两个转染试剂PEI (0. 56%)以及 Lipofectamine 2000 (2. 82%) 实施例3 研究实施例1中所得的聚乙二醇和聚乙烯亚胺修饰的石墨烯对果蝇细胞的活性的影响
观察实施例1中所得的聚乙二醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯对果蝇细胞的细胞活性影响。具体方法是在96孔板上，每孔加入100微升的细胞培养液(3*104个/毫升)， 培养12小时。加入25微升的聚乙二醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯(20. 5微克/毫升，12. 25微克/毫升，6. 125微克/毫升)，培养M小时。然后根据MTT法检测细胞活性。结果如图5所示可以观察到，在6. 125微克/毫升的浓度条件下，相当于转染时氮磷比30的浓度，聚乙二醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯能使细胞保持93%左右的细胞活性，说明聚乙二醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯的生物安全性高。上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯及其制备方法，包括氧化石墨烯、聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺，其特征在干，所述聚乙ニ醇为支链结构，6条支链的一端分别连接在葡萄糖分子的羟基上，另一端都为氨基；所述聚乙烯亚胺为支链结构；以所述氧化石墨烯、 聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺为原料，首先通过改进的Hummers方法制备氧化石墨烯，超声处理5 分钟后，向其中加入聚乙ニ醇并继续超声处理5分钟，然后向其中加入EDC并继续超声处理 15分钟，接着，向其中加入聚乙烯亚胺，超声处理5分钟后再向其中加入EDC，超声处理20 分钟，最后将反应在室温下搅拌过夜或反应6小时，然后将反应完全的材料用100纳米的滤膜抽滤洗3次，即可制备得聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯，所述聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯的高度为Inm 2nm，尺寸为5nm 50nm。
2.根据权利要求1所述的聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯，其特征在干，所述聚乙ニ醇的分子量为10000，所述聚乙烯亚胺的分子量25000。
3.根据权利要求1所述的聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯，其特征在干，所述聚乙ニ醇的质量百分比为洲士0. 5%,所述聚乙烯亚胺的质量百分比为37士3%。
4.权利要求1所述的聚乙ニ醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯在基因转染方面的应用。
全文摘要
本发明提供一种聚乙二醇和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯及其制备方法，包括氧化石墨烯、聚乙二醇和聚乙烯亚胺，所述聚乙二醇为支链结构，6条支链的一端分别连接在葡萄糖分子的羟基上，另一端都为氨基，所述聚乙二醇的数均分子量为10000；所述聚乙烯亚胺为支链结构，分子质量为25000；以所述氧化石墨烯、聚乙二醇和聚乙烯亚胺为原料，制备得高度为1nm～2nm，尺寸为5nm～50nm的聚乙烯亚胺和聚乙二醇修饰的氧化石墨烯。本发明聚乙烯亚胺和聚乙二醇修饰的氧化石墨烯能够有效且安全将核酸输送到细胞中，作为基因转染试剂。
文档编号C01B31/04GK102530935SQ201210004010
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者冯良珠, 刘庄, 张静, 彭睿, 李述汤 申请人:苏州大学