本发明涉及一种含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂及其制备方法与应用，属于微生物菌剂技术领域。
技术背景
中国是传统的农业大国，农业是我国的基础产业，在国民经济中占有举足轻重的地位。改革开放以来，我国粮食产量取得了显著的增长，现代农业技术推动了农业产业的快速发展，其中化学肥料的大量使用是支撑我国粮食增产的重要因素。长期过量的使用化学肥料带来了环境污染、土壤板结、地力衰退、生态恶化和农产品品质下降等日益严重的问题。中国以占世界8％的耕地消耗了世界32％的化肥，目前我国的化肥利用率仅为30％，而欧美发达国家可达到60％以上。化肥利用率低下，使农业成本增加，生产效益降低。积极寻找解决方案，实现农业的可持续发展是我们在农业生产中急需解决的问题。
近年来，随着国家对环境安全和食品安全的不断重视，微生物菌剂因其具有环境友好、改良土壤、增加产量、提高品质且绿色安全等特点在生态环境保护和安全优质农产品生产中备受关注。微生物菌剂中的特定功能微生物能够通过自身的生命活动促进土壤中物质的转化，提高作物营养水平，促进和/或协助营养吸收、刺激调控作物生长，防治有害微生物等，从而达到高产、优质、高效、生态、安全的目的。
聚谷氨酸具有良好的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，降解产物为谷氨酸，亦可作为营养物质供给植物吸收，是一种优良的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂以及药物载体等，在环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等领域均有应用。
中国专利文献CN101851123A(申请号201010183268.5)公布了一种高浓度复合微生物菌肥及其生产方法，所制备的高浓度复合微生物菌肥有效活菌数保持在50亿个/mL以上。
中国专利文献CN101863685A(申请号201010192330.7)公布了一种制作微生物肥料高浓度菌粉的方法，最终达到生产的侧孢、钾芽孢菌粉活菌含量达200亿个/克。
目前，针对微生物肥料含菌浓度低，品种单一，土壤定植率低，使用不方便，运输不便捷等缺点，上述专利所述方法获得的有效活菌数相比目前实际生产有一定程度的提高，但还有上升空间，如何获得稳定的更高浓度微生物菌剂是本发明主要解决的问题。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供一种含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂及其制备方法与应用。
发明概述
本发明所述含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂的制备方法及应用，其中微生物菌剂由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、胶质芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)经液、固联合发酵制得。有效活菌数可达到≥1000亿个/克，每种菌不低于50亿个/克，且添加保水剂聚谷氨酸，能够提高有效活菌的稳定性和定植率，具有更好的松土、保水、防板结、防病虫害、解钾、解磷、增加肥效等改良土壤的作用。
发明详述
本发明技术方案如下:
一种含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂，组分如下，均为重量份：
混合微生物发酵粉15～25份、轻质碳酸钙55～70份、聚谷氨酸5～10份、硫酸镁3～5份、硼酸3份、硫酸锌2份；
所述聚谷氨酸为聚-γ-谷氨酸，由D型谷氨酸和L型谷氨酸通过酰胺键连接，每个谷氨酸都留有一个游离的羧基。
根据本发明优选的，所述混合微生物发酵粉中含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、胶质芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的活菌数量之比为1：(2.5～3.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(1.5～2.5)，有效活菌总数达到≥1000亿个/克，其中每种菌有效活菌数不低于50亿个/克。
根据本发明优选的，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号ACCC 10242；侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号ACCC 11079；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号ACCC 02002；胶质芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心ACCC10012；巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 21694。
根据本发明优选的，所述聚谷氨酸的分子量≥100万。
上述含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂的制备方法，步骤为：将混合微生物发酵粉、轻质碳酸钙、聚谷氨酸、硫酸镁、硼酸、硫酸锌按比例混合，即得。
根据本发明优选的，混合微生物发酵粉按如下方法制备：
(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)经斜面培养后，制得斜面种A；将斜面种A转接于液体种子培养基中，经摇瓶培养，制得液体种子A；
将制得的液体种子A接种于液体发酵培养基中，控制pH值7～8、通气比为1∶(0.5～1)、转速100～200转/分，在30～37℃培养36～48h，制得发酵液A；然后将发酵液A按6％～10％的质量比转接至固体发酵培养基中，在温度35～38℃，罐压0.02～0.06Mpa条件下发酵培养至镜检芽孢率为90％时，经压滤、闪蒸、烘干粉碎，制得菌粉A；
(2)将侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)经斜面培养后，制得斜面种B；将斜面种B转接于液体种子培养基中，经摇瓶培养，制得液体种子B；
将制得的液体种子B接种于液体发酵培养基中，控制pH值6～7、通气比为1∶(0.5～1)、转速100～200转/分，在30～37℃培养36～48h，制得发酵液B；然后将发酵液B按6％～10％的质量比转接至固体发酵培养基中，在温度30～35℃，罐压0.02～0.06Mpa条件下发酵培养至芽孢率为90％时，经压滤、闪蒸、烘干粉碎，制得菌粉B；
(3)将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)经斜面培养后，制得斜面种C；将斜面种C转接于液体种子培养基中，经摇瓶培养，制得液体种子C；
将制得的液体种子C接种于液体发酵培养基中，控制pH值7～8、通气比为1∶(0.3～0.8)、转速80～150转/分，在30～37℃培养36～48h，制得发酵液C然后将发酵液C按6％～10％的质量比转接至固体发酵培养基中，在温度32～40℃，罐压0.02～0.06Mpa条件下发酵培养至芽孢率为90％时，经压滤、闪蒸、烘干粉碎，制得菌粉C；
(4)将胶质芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)经斜面培养后，制得斜面种D；将斜面种D转接于液体种子培养基中，经摇瓶培养，制得液体种子D；
将制得的液体种子D接种于液体发酵培养基中，控制pH值7～7.5、通气比为1∶(0.3～0.8)、转速190～250转/分，在30～37℃培养36～48h，制得发酵液D；然后将发酵液D按6％～10％的质量比转接至固体发酵培养基中，在温度28～36℃，罐压0.02～0.06Mpa条件下发酵培养至芽孢率为90％时，经压滤、闪蒸、烘干粉碎，制得菌粉D；
(5)将巨大芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)经斜面培养后，制得斜面种E；将斜面种E转接于液体种子培养基中，经摇瓶培养，制得液体种子E；
将制得的液体种子E接种于液体发酵培养基中，控制pH值8～9、通气比为1∶(0.5～1)、转速100～280转/分，在30～37℃培养36～48h，制得发酵液E；然后将发酵液E按6％～10％的质量比转接至固体发酵培养基中，在温度25～35℃，罐压0.02～0.06Mpa条件下发酵培养至芽孢率为90％时，经压滤、闪蒸、烘干粉碎，制得菌粉E；
(6)将步骤(1)至(5)制备的菌粉A、菌粉B、菌粉C、菌粉D、菌粉E按照质量比1：(2.5～3.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(1.5～2.5)混合，制得混合微生物发酵粉。
根据本发明优选的，所述步骤(1)至(5)中，斜面培养条件为：在30～37℃的温度下，在斜面培养基中培养24～48h；所述斜面培养基每升组分如下：
蛋白胨6～9g，酵母粉3～5g，牛肉膏2～4g，氯化钠3～5g，琼脂10～25g，磷酸二氢钾0.5～1g，磷酸氢二钾0.5～1g。
根据本发明优选的，所述步骤(1)至(5)中，摇瓶培养条件为：在30～37℃条件下，培养36～48h；所述液体种子培养基每升组分如下：
蛋白胨6～9g，葡萄糖5～8g，酵母粉3～5g，牛肉膏2～4g，氯化钠3～5g，磷酸二氢钾0.5～1g，磷酸氢二钾0.5～1g。
根据本发明优选的，所述步骤(1)至(5)中，液体发酵培养基每升组分如下：
玉米粉10～15g，豆饼粉10～15g，葡萄糖5～10g，硫酸铵5～10g，酵母粉3～5g，磷酸二氢钾0.5～0.8g，硫酸镁0.1～0.25g，硫酸锰0.1～0.25g，氯化亚铁0.1～0.2g，调整pH值7～8。
根据本发明优选的，所述步骤(1)至(5)中，固体发酵培养基组分如下，均为重量份：
麸皮20～30份，豆饼粉10～20份，玉米粉10～20份，牛肉膏10～15份，蛋白胨5～10份，氯化钠0.5～1份，硫酸铵0.5～1份，碳酸钙0.2～0.5份，磷酸二氢钾0.05～0.1份，硫酸镁0.01～0.025份，硫酸锰0.01～0.025份，氯化亚铁0.01～0.02份，硫酸锌0.01～0.02份，按水料质量比1∶(1∶1～1.2)比例加水，调pH值7～8。
上述含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂在改良土壤中的应用。
上述应用，步骤如下：
整地时将含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂均匀撒在土壤中，通过翻地与土壤搅拌均匀；或者，浇水冲施；每亩施用量为3～5kg。
有益效果
1、本发明在微生物菌剂中添加了聚谷氨酸，由于聚谷氨酸中含有大量的超强亲水基团-羧基，能够充分保持土壤水分，改进土壤的孔隙度和膨松度，改善土壤的保水保肥能力；同时聚谷氨酸的加入可以极大提高微生物的定植率；
2、本发明采用高浓度混合微生物菌剂与聚谷氨酸及其他微量元素混合后制得，高浓度混合微生物菌剂由枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌组合获得，聚谷氨酸和轻质碳酸钙能够很好的将菌体稳定负载；在土壤微生物区系组成中以上物种微生物不仅具有相互促进的，相互协同的作用，并且能够增强解磷、解钾能力，提高土壤肥力，对土壤作物无任何副作用，同时补充作物钙元素，提高植物抗病虫害的能力；
3、本发明所述微生物菌剂中添加的聚谷氨酸易于降解，且降解产物为谷氨酸，也是一种营养物质，同时增加作物对其他营养元素吸收能力，增加肥效；
4、本发明所述的高浓度微生物菌剂由液、固联合发酵方法制得，得到的终产物有效活菌数可达到≥1000亿个/克，极大优于目前实际生产中的活菌数；且添加保水剂聚谷氨酸，增强活菌在土壤中的生存能力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
微生物来源
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号ACCC 10242；
侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号ACCC 11079。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号ACCC 02002
胶质芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心ACCC 10012
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 21694
实施例1
一种含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂，组份如下，均为重量份：
混合微生物发酵粉20份、轻质碳酸钙63份、聚谷氨酸8份、硫酸镁4份、硼酸3份、硫酸锌2份；
所述含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂中含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、胶质芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的活菌数量之比为1∶2.5：0.8：1：2.5，有效活菌总数可达到1300亿个/克。
上述含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)经斜面培养后，制得斜面种A；将斜面种A转接于液体种子培养基中，经摇瓶培养，制得液体种子A；
将制得的液体种子A接种于液体发酵培养基中，控制pH值7.5、通气比为1∶1、转速100转/分，在37℃培养42h，制得发酵液A；然后将发酵液A按10％的质量比转接至固体发酵培养基中，在温度37℃，罐压0.04Mpa条件下发酵培养至镜检芽孢率为90％时，经压滤、闪蒸、烘干粉碎，制得菌粉A；
(2)将侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)经斜面培养后，制得斜面种B；将斜面种B转接于液体种子培养基中，经摇瓶培养，制得液体种子B；
将制得的液体种子B接种于液体发酵培养基中，控制pH值6.5、通气比为1∶0.5、转速200转/分，在30℃培养48h，制得发酵液B；然后将发酵液B按6％的质量比转接至固体发酵培养基中，在温度35℃，罐压0.06Mpa条件下发酵培养至芽孢率为90％时，经压滤、闪蒸、烘干粉碎，制得菌粉B；
(3)将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)经斜面培养后，制得斜面种C；将斜面种C转接于液体种子培养基中，经摇瓶培养，制得液体种子C；
将制得的液体种子C接种于液体发酵培养基中，控制pH值7.5、通气比为1∶0.3、转速150转/分，在35℃培养36h，制得发酵液C然后将发酵液C按10％的质量比转接至固体发酵培养基中，在温度40℃，罐压0.02Mpa条件下发酵培养至芽孢率为90％时，经压滤、闪蒸、烘干粉碎，制得菌粉C；
(4)将胶质芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)经斜面培养后，制得斜面种D；将斜面种D转接于液体种子培养基中，经摇瓶培养，制得液体种子D；
将制得的液体种子D接种于液体发酵培养基中，控制pH值7、通气比为1∶0.8、转速190转/分，在37℃培养36h，制得发酵液D；然后将发酵液D按8％的质量比转接至固体发酵培养基中，在温度32℃，罐压0.05Mpa条件下发酵培养至芽孢率为90％时，经压滤、闪蒸、烘干粉碎，制得菌粉D；
(5)将巨大芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)经斜面培养后，制得斜面种E；将斜面种E转接于液体种子培养基中，经摇瓶培养，制得液体种子E；
将制得的液体种子E接种于液体发酵培养基中，控制pH值8.5、通气比为1∶0.8、转速180转/分，在35℃培养45h，制得发酵液E；然后将发酵液E按8％的质量比转接至固体发酵培养基中，在温度30℃，罐压0.04Mpa条件下发酵培养至芽孢率为90％时，经压滤、闪蒸、烘干粉碎，制得菌粉E；
(6)将步骤(1)至(5)制备的菌粉A、菌粉B、菌粉C、菌粉D、菌粉E按照质量比1：2.5：0.8：1：2.5混合，制得混合微生物发酵粉。
所述步骤(1)至(5)中，斜面培养条件为：在35℃的温度下，在斜面培养基中培养36h；所述斜面培养基每升组分如下：
蛋白胨8g,酵母粉4g,牛肉膏3g,氯化钠4g,琼脂17g,磷酸二氢钾0.8g，磷酸氢二钾0.8g。
根据本发明优选的，所述步骤(1)至(5)中，摇瓶培养条件为：在35℃条件下，培养42h；所述液体种子培养基每升组分如下：
蛋白胨9g,葡萄糖5g酵母粉5g,牛肉膏2g,氯化钠5g,磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1g。
所述步骤(1)至(5)中，液体发酵培养基每升组分如下：
玉米粉12g,豆饼粉13g,葡萄糖8g,硫酸铵6g,酵母粉4g,磷酸二氢钾0.7g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.15g,氯化亚铁0.15g，调整pH值7.4。
所述步骤(1)至(5)中，固体发酵培养基组分如下，均为重量份：
麸皮25份，豆饼粉15份，玉米粉15份，牛肉膏13份，蛋白胨8份，氯化钠0.8份，硫酸铵0.8份，碳酸钙0.4份，磷酸二氢钾0.08份，硫酸镁0.02份，硫酸锰0.02份，氯化亚铁0.015份，硫酸锌0.015份，按水料质量比1∶1.1比例加水，调pH值7.4。
实施例2
如实施例1所述的含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂的制备方法，不同之处在于：
菌粉A、菌粉B、菌粉C、菌粉D、菌粉E按重量比1：3：1：1：2的比例混合均匀，制得混合微生物发酵粉；然后按混合微生物发酵粉20kg，轻质碳酸钙63kg，聚谷氨酸8kg、硫酸镁4kg、硼酸3kg、硫酸锌2kg混合均匀，制得含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂。
经检测数据如表1所示：
表1
实施例3聚谷氨酸在增加土壤中微生物的定植率的试验：
按实施例1所述的方法，将菌粉A、菌粉B、菌粉C、菌粉D、菌粉E按重量比1：3：1：1：2的比例混合均匀，制得混合微生物发酵粉；再将混合微生物发酵粉20份、轻质碳酸钙63份、硫酸镁4份、硼酸3份、和硫酸锌2份均匀混合制成复合高浓度微生物菌剂；
将上述制备的混合微生物发酵粉分别添加不同类型的保水剂按5克/平方米冲施，冲施入土壤，两周后检测土壤微生物、有效磷和速效钾含量：
处理组一：复合高浓度微生物菌剂；
处理组二：复合高浓度微生物菌剂+8份(8％)聚谷氨酸；
处理组三：复合高浓度微生物菌剂+8份(8％)聚丙烯酰胺。
检测结果如表2所示：
表2不同处理组对土壤微生物定植率的影响
表3不同处理组对土壤有效磷和速效钾含量的影响
由表2可以看出，添加保水剂可增加土壤中微生物菌剂的定植率，添加聚谷氨酸和聚丙烯酰胺相较对照组可分别增加细菌定植率25.05％、14.05％。同时添加聚谷氨酸对土壤中原有的放线菌和真菌也有一定的促生长作用。
由表3可以看出，添加保水剂可增加微生物的解磷、解钾能力，添加聚谷氨酸和聚丙烯酰胺相较对照组可分别增加土壤中有效磷含量18.34％、15.22％，增加速效钾含量15.16％、7.33％。
实施例4含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂的应用：
2014年10月至2015年6月，于莱芜市润百禾蔬菜基地，供试品种为番茄，毛粉802，大棚栽培。
试验设计：
处理1：施肥+实施例1制备的含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂；
处理2：常规施肥+按实施例1制备的缺少菌粉A的含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂；
处理3：常规施肥+灭火基质；
处理4：常规施肥；
四个处理组，8行区。重复3次，小区面积0.05亩。随机排列，小区设立保护行1米，各小区单灌单排，整地时按每亩施土杂肥3000公斤，番茄生长期，用1500倍跳甲净药剂防治昆虫，其他栽培管理措施同大田一致。
施肥方法：
处理1：在常规施肥的基础上，于移栽时亩施2kg,按1∶100配土穴施；番茄生长期间将菌剂按1∶1000倍兑水浇灌，每隔15天追施一次，共追施3次；
处理2：按实施例1制备的缺少菌粉A的含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂(施用方法同处理1)；
处理3：将菌剂处理为灭火基质(施用方法同处理1)；
处理4：常规施肥，栽植时亩用尿素20kg,过磷酸钙100kg,硫酸钾50kg，在开始收获时，每隔20天追肥尿素20kg/亩，硫酸钾30kg/亩。
统计各施肥处理对番茄产量的影响，在试验结束后测量各组植株全磷、全钾含量，同时采集各组土样测定土壤理化性状。方法采用土壤容重应用环刀法、有机质应用重铬酸钾容量法测定(详见NY/T 1121.4-2006标准)。
检测结果：
表4各施肥处理对番茄产量的影响
表5各施肥处理对植株全磷含量的影响
表6各施肥处理对植株全钾含量的影响
表7各施肥处理对土壤容重的影响
表8各施肥处理对土壤有机质的影响
由上表4可以看出，施用本发明所述的含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂能够显著提高番茄的产量，相较常规施肥组亩增产率17.99％，增产效果显著。
由上表5和表6看出，施用本发明所述的含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂能够显著提高植株全磷、全钾含量，相较常规施肥组分别增加44.64％、20.04％，由此可以看出本发明所述的含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂可以显著增加植株对磷、钾的吸收。
由上表7可以看出，施用本发明所述的含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂能够显著提高土壤容重，相较常规施肥组土壤容重增加2.4％。由上表8可以看出，施用本发明所述的含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂能够显著提高土壤有机质含量，相较常规施肥组土壤有机质增加3.0％。由此可以看出本发明所述的含有聚谷氨酸的高浓度微生物菌剂对土壤改良有明显效果。