一种以海藻为碳源的荧光碳量子点的制备方法和用途与流程

本发明属于功能性纳米材料技术领域，具体涉及一种具有荧光特性的碳量子点的制备方法，特别涉及一种以海藻为碳源制备具有荧光特性的碳量子点细胞标记探针的方法。

背景技术：

功能性纳米材料是近年来发展非常迅速的一个技术领域，科学家们已经成功地制备出包括有机高分子小球、微脂粒、半导体量子点、硅量子点、上转化纳米探针、贵金属纳米颗粒、磁性纳米小球等等在内的多种纳米材料，并利用它们的各种优异性能开发出了多种技术手段，在医学检测，疾病诊断，能源电池，环境评估、污染治理等各领域广为应用。

碳量子点是纳米材料领域一个新的研究热点。它是指直径在2-40纳米范围内的碳原子微球。碳量子点在保留碳材料各种优良的物理化学性能的同时，表现出显著的荧光特性和良好的水相分散性。实验表明碳量子点可以直接作为一种安全有效的荧光探针，被各种细胞内化从而对这些细胞进行荧光标记，而表面修饰的碳量子点能够特异性地标记肿瘤细胞。总之，碳量子点在生物检测以及生物分析等领域具有重要的应用价值。

碳量子点的制备方法主要有两大类，一类是利用高纯石墨、炭黑和碳纳米管为原料，利用电子束光刻蚀、电化学氧化、化学剥离、微波及超声辅助、氧等离子处理等方法，破坏石墨片层之间的相互作用力，同时在片层内形成大量的氧化基团，将石墨烯片层切割开得到小尺寸的碳量子点；另外一类是利用柠檬酸和乙二胺等小分子化合物，在一定温度下进行缩合反应，生成具有较高分子量的碳量子点。这两种制备方法的原料都是高纯度的化合物，成本较高。并且合成的过程中常常会用到浓硝酸和浓硫酸，反应副产物的无害化处理较为复杂。近年来，科学家发现了多种天然有机物制备碳量子点的方法，如中国专利CN2014108419973公开了一种以鸡蛋清为碳源的碳量子点荧光标记材料的方法，中国专利CN2012102644112一种光致放光碳量子点的制备方法公开了采用豆浆残渣为原料制备碳量子点的方法，中国专利2013102199000公开了以植物叶子为原料制备碳量子点的方法，然而这些天然有机物制备过程中普遍存在产品收率低，如采用豆浆残渣产品收率为5-7.3％，且过程中涉及到硫酸、氢氧化钠等化学药品的使用，不属于绿色生产工艺，此外这些原材料仍然具有价格较高，来源有限的缺点。

我们国家耕地资源有限，但是拥有广阔的海洋面积，海藻的产量巨大，能够作为一种价低量高的生物质资源。浒苔是大型天然野生海藻的一种，具有繁殖能力强，环境适应范围广的特点。近年来随着全球气温变暖、水体富营养化等一系列环境因素的改变，海洋浒苔绿潮连续暴发。中国黄海最早于2007年便出现浒苔，迄今为止连续九年爆发浒苔绿潮灾害。例如2015年6月在山东沿海海域有较大面积浒苔漂浮，绿潮覆盖面积约430平方公里，分布面积约35200平方公里(新华网新闻)。大量浒苔漂浮聚集在海面，阻塞了船舶航行的通道。以此同时，浒苔的大量生长增殖以及腐烂分解的过程都需要消耗大量氧气，对其生长海域其他水生生物的生存构成严重威胁。得不到及时清除的浒苔腐烂时发出恶臭，影响沿海旅游业发展。如何对浒苔进行无害化处理，将其‘变废为宝’是我们面临的一个严峻挑战。目前对浒苔的无害化处理主要途径是将其制成饲料，或者加工食用。

基于以上论述，设计实现有效的途径，将浒苔转化为具有功能性的荧光碳量子点材料，对于浒苔的高附加值无害转化具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有碳量子点合成技术中的不足，提供一种以海藻为原料制备生产荧光碳量子点并作为细胞标记探针加以应用的方法，解决了海藻，特别是浒苔高附加值无害化处理的问题。

为了实现上述技术方案，本发明涉及的以海藻为碳源的荧光碳量子点的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)清洗海藻原料以去除杂质，然后将海藻和水一起粉碎，得到海藻浆料；

(2)将适量海藻浆料放入密封体系中进行高温水热反应并使海藻浆体碳化；

(3)对步骤(2)中碳化产物进行后处理以去除不溶物以及大尺寸的组分，得到荧光碳量子点溶液；

(4)将步骤(3)中的荧光碳量子点溶液进行冷冻干燥处理，得到荧光碳量子点粉末。

本发明涉及的海藻为浒苔、海带、裙带菜和紫菜中的一种或多种，但不限于这几种,水优选为为纯水。

本发明涉及的浒苔为条浒苔、缘管浒苔、铲浒苔和扁浒苔中的一种或多种。

本发明涉及的步骤(1)中将质量比(1.5-2.5)：1的海藻和水一起放入组织捣碎机中粉碎3-10分钟，得到海藻浆料优选海藻和水质量比为2：1，粉碎时间为5分钟。

本发明涉及的步骤(2)中密封体系为密闭反应釜，步骤(2)中的海藻浆料占密闭反应釜体积的三分之一，高温水热反应和碳化过程具体为：在加热装置中将密闭反应釜升温至180-200℃，并维持60-90分钟，为保证荧光碳量子点的产率和质量，加热装置的温度波动控制在±5℃。

本发明涉及的加热装置为微波反应器、烘箱或马弗炉中的一种。

本发明涉及的步骤(3)中的后处理过程为离心、过滤、透析中的一种，但并不限于这几种。

本发明所述的离心具体为：将步骤(2)中碳化产物放入离心机中，在转速5000-12000转/分钟的条件下离心处理10-20分钟，离心上清液为荧光碳量子点溶液，优选转速为10000转/分钟,离心时间为15分钟。

本发明所述的过滤具体过程为：将步骤(2)中碳化产物通过0.10-0.45μm滤膜处理，滤出液为荧光碳量子点溶液，优选为滤膜孔径为0.22μm。

本发明所述的过滤具体过程为：将步骤(2)中碳化产物通过截留分子量500Da的透析膜处理除去小分子杂质，透析袋内部截留溶液为碳量子点溶液。

本发明涉及的以海藻为碳源的荧光碳量子点用于生物标记、重金属分析、电极复合材料制备、抗体偶联以及复合光催化剂制备等各个方向。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)有效地将廉价的海藻，特别是浒苔转化为具有荧光特性的纳米尺寸的碳量子点，实现浒苔的高附加值和无害转化；(2)制备方法工艺简单、操作性强、成本低、可以实现大规模的碳量子点的制备,无需使用其他化学药品，环境友好；(3)制备的荧光碳量子点用于生物标记、重金属分析、抗体标记和细胞染色；(4)制备过程中产品收率高；(5)粉碎处理过程有利于海藻中的成分分散在水溶液中提高后续水热反应和碳化过程的效率。

附图说明：

图1为本发明涉及的实施例1荧光碳量子点的透射电镜表征图；

图2为本发明涉及的实施例1荧光碳量子点的紫外-可见光吸收谱图；

图3为本发明涉及的实施例1荧光碳量子点的荧光发射谱图；

图4为本发明涉及的实施例1荧光碳量子点对细胞生长繁殖的影响；

图5为本发明涉及的实施例1浓度500mg/L荧光碳量子点与细胞共同培养5小时之后的共聚焦显微镜成像结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明：

实施例1：

(1)用自来水对浒苔进行洗涤，除去表面泥沙等杂质，然后用纯水进行冲洗；

(2)称取200克步骤(1)处理后的浒苔原料(干重约10克)，按照浒苔和纯水的质量比为2:1的比例将浒苔和纯水混合，放入组织捣碎机的原料容器，粉碎5分钟，得到浒苔浆料；

(3)称取10克步骤(2)得到的浒苔浆料，放入30mL聚四氟水热反应釜并加盖放入外包套管进行密闭；

(4)将装有浒苔浆料的反应釜放入微波反应器，设置温度为200℃，压力为20atm,反应60分钟，然后停止加热；

(5)待反应釜的温度降低到40℃以下，将反应釜的盖子打开，反应产物为红褐色溶液，含有少许黑色的不溶物；

(6)将步骤(5)得到的反应产品混合物收集到离心管中，设定转速10000rpm,离心20分钟,将离心管上层清液转移到干净的试管中，不溶物沉淀直接丢弃；

(7)将步骤(6)得到的荧光碳量子点溶液进行冷冻干燥处理，得到荧光碳量子点粉末,计算得出荧光量子产率为4.7％，产品收率为9.6％。

对实施例1制备的碳量子点粉末进行测试，结果如图1-5所示，从透射电镜表征图可以看出制备得到的荧光碳量子点颗粒分散均匀，而且粒径分布范围相对较窄，基本在2-6nm范围内，平均颗粒直径为3.5nm。从紫外-可见光吸收谱图可以看出荧光碳量子点无明显的吸收峰。从荧光发射谱图可以得出当用360nm的激发光对碳量子点进行照射的条件下，荧光碳量子点在400-600nm区间有很强的荧光发射，发射峰在440nm附近。从与细胞共同培养5小时之后的共聚焦显微镜成像结果可以得出：浓度500ug/mL的浒苔碳量子点对细胞的生长增殖无明显影响，可以富集在细胞质的部位对其进行荧光标记。

实施例2：

(1)用自来水对浒苔进行洗涤，除去表面泥沙等杂质，然后用纯水进行冲洗；

(2)称取200克步骤(1)处理后的浒苔原料(干重约10克)，按照浒苔和纯水的质量比为2:1的比例将浒苔和纯水混合，放入捣碎杯，利用组织捣碎机粉碎5分钟，得到浒苔浆料；

(3)称取30克步骤(2)得到的浒苔浆料，放入100mL聚四氟水热反应釜并加盖放入外包金属套管进行密闭；

(4)将装有浒苔浆料的反应釜放入烘箱，设置温度为180℃，反应90分钟，反应过程中温度波动控制在±5℃,然后停止加热；

(5)待反应釜的温度降低到40℃以下，将反应釜的盖子打开，反应产物为红褐色溶液，含有少许黑色的不溶物；

(6)将步骤(5)得到的反应产品混合物用装有0.22μm滤膜的抽滤装置进行过滤处理，收集澄清的滤出液，转移到干净的试管中，滤膜收集的不溶物直接丢弃；

(7)将步骤(6)得到的荧光碳量子点溶液进行冷冻干燥处理，得到荧光碳量子点粉末。计算得出荧光量子产率为4.9％，产品收率为7.8％。

实施例3：

(1)用自来水对浒苔进行洗涤，除去表面泥沙等杂质，然后用纯水进行冲洗；

(2)称取200克步骤(1)处理后的浒苔原料(干重约10克)，按照浒苔和纯水的质量比为2:1的比例将浒苔和纯水混合，放入捣碎杯，利用组织捣碎机粉碎5分钟，得到浒苔浆料；

(3)称取30克步骤(2)得到的浒苔浆料，放入100mL聚四氟水热反应釜并加盖放入外包金属套管进行密闭；

(4)将装有浒苔浆料的反应釜放入马弗炉，设置温度为200℃，反应60分钟，反应过程中温度波动控制在±5℃,然后停止加热；

(5)待反应釜的温度降低到40℃以下，将反应釜的盖子打开，反应产物为红褐色溶液，含有少许黑色的不溶物；

(6)将步骤(5)得到的反应产品混合物收集分装到离心管中，设定转速10000rpm,离心20分钟,将离心管上层清液转移到干净的试管中，不溶物沉淀直接丢弃；

(7)将步骤(6)得到的荧光碳量子点溶液进行冷冻干燥处理，得到荧光碳量子点粉末。计算得出荧光量子产率为3.8％，产品收率为8.9％。

实施例4：

本实施例4与实施例1除步骤(1)中选择的原料为裙带菜，步骤(2)中裙带菜和纯水的质量比为2.5:1，步骤(6)中转速5000rpm，离心10分钟,其他步骤均相同，制备出荧光碳量子点粉末。

实施例5：

本实施例5与实施例2除其他步骤均相同，除步骤(1)中选择的原料为紫菜，步骤(2)中紫菜和纯水的质量比为1.5:1，步骤(6)抽滤装置中采用0.45μm滤膜，其他步骤均相同，制备出荧光碳量子点粉末。

测试表明，实施例2-5制备的荧光碳量子点粉末性能与实施例1制备的的荧光碳量子点粉末性能接近。

对比例1：

本对比例1与实施例1除步骤(4)反应温度为150℃，反应时间为30min时，其他步骤均相同，制备荧光碳量子点粉末,计算得出荧光量子产率为1.2％，产品收率为2.1％。