抗番茄青枯病复合微生物菌剂的生产工艺的制作方法

本发明属于肥料加工技术领域，具体涉及一种抗番茄青枯病复合微生物菌剂的生产工艺。

背景技术：

番茄，即西红柿(学名：lycopersiconesculentummill.)，是茄科番茄属一年生或多年生草本植物，体高0.6-2米，全体生粘质腺毛，有强烈气味，茎易倒伏，叶羽状复叶或羽状深裂，花序总梗长2-5厘米，常3-7朵花，花萼辐状，花冠辐状，浆果扁球状或近球状，肉质而多汁液，种子黄色，花果期夏秋季，番茄是我国家常蔬菜的一种，日常种植量很大。番茄青枯病是由细菌引起的，是细菌性维管束组织病害。叶片表现为，初始顶部新叶萎蔫下垂，后下部叶片发展产生凋萎，接下来才是中部叶片产生凋萎，发病后叶片色泽较淡，呈青枯状。发病初始期植株叶片白天出现萎蔫，傍晚后恢复正常，后很快扩展至整株萎蔫，并不再恢复而死亡；茎表现为，初期为水渍状斑点扩大后呈褐色，病茎下部表皮粗糙，常产生不定根，剖开病茎，维管束变褐色，横切后用于挤压可见乳白色粘液渗出。茄科雷尔氏菌(ralstoniasolanacearum)是引起番茄青枯病的主要病菌，现在，植物青枯病已经成为世界范围内的传播广泛、危害严重的重大病害之一。目前，针对番茄青枯病的防治手段主要是提高番茄的抗性，实现耕作控制、药剂防治和生物防治等，但由于青枯菌长期存活性和寄主范围多样性，导致至今尚无有效的化学农药和其他防治办法，因此青枯病被称为植物的“癌症”。

化学药剂防治青枯病虽然能起到一定的作用，但是长期大量施用化学药剂容易造成环境污染和番茄的药剂残留，严重影响人体健康。生物防治由于其对环境、生态和人畜的安全性而受到了国内外研究者的广泛关注，其主要是通过施用拮抗菌、有机肥或生物有机肥等措施调节土壤微生态、改善土壤微生物多样性、抑制病原菌的生长或提高植物自身抗性，从而抑制土传病害的发生。

壳寡糖是由甲壳素脱乙酰基后经过酶解而得到的低聚糖，可作为植物生长调节剂，增强植物对虫害的防御能力，已有研究表明壳寡糖对番茄花叶病毒病有诱抗效果。

防治番茄青枯病具有一定的历史，如专利申请号201610767916.9一种预防西红柿青枯病的生物有机肥及其制备方法，采用芽孢杆菌类和霉菌及荧光假单胞菌类添加至有机肥料中，制成生物有机肥来预防番茄青枯病；再如申请号201210004589.3一种番茄青枯病拮抗菌及其应用公开的16srrna具有seqidno.1基因序列的蜡状芽孢杆菌，菌株较为单一；又如申请号200910183360.9防除连作番茄青枯病的拮抗菌及其微生物有机肥料，公开了一株解淀粉芽孢杆菌生产的抗番茄青枯病的生物有机肥料，亦存在菌株单一的问题。以上专利除将拮抗菌添加至肥料当中复配外，并无添加壳寡糖这一能提高番茄抵抗力的有益成分，并且未经粘涂等生产处理，不能达到长效抗病的效果，本发明则能很好地解决这一问题。本发明利用微生物对青枯病菌的拮抗、杀灭作用及壳寡糖对番茄诱导抗性达到对此病的防治，具有无污染、环境友好、成本低廉、效果持久的优点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供抗番茄青枯病复合微生物菌剂的生产工艺。

本发明的目的是通过如下措施来达到的：

a)胶状芽孢杆菌菌体制备：购买菌种，制备菌种培养基，配方为蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，ph7.5,121℃灭菌30min,接入购买菌种，摇床100～150r/min培养24h，此为菌种液；制备扩增培养基，配方为牛肉膏0.4％、酵母浸出粉0.9％、氯化钠0.3％,ph7.5，转入发酵罐进行高温灭菌，灭菌后待温度降低至36℃时，接入5％菌种液，转速100～150r/min培养24～26h，转出发酵液4000r/min离心30min，获得胶状芽孢杆菌菌体；

b)哈茨木霉菌制备：购买菌种，制备菌种培养基，配方为无琼脂pda培养基，25℃接入购买菌种，摇床100～150r/min培养144h，此为菌种液；制备扩增培养基，配方为蔗糖2％、硝酸铵0.5％、磷酸钠0.2％、硫酸镁0.1％，ph9.0，转入发酵罐进行高温灭菌，灭菌后待温度降低至25℃时，接入5％菌种，转速100～150r/min培养144～192h，转出发酵液4000r/min离心30min，获得哈茨木霉菌菌体；

c)细黄链霉菌制备：购买菌种，制备菌种培养基，配方为无琼脂pda培养基，30℃接入购买菌种，摇床100～150r/min培养144h，此为菌种液；制备扩增培养基，配方为葡萄糖1％、淀粉2％、黄豆饼粉1.5％、碳酸钙0.3％、磷酸氢二钾0.05％、硫酸铵0.5％、豆油0.5％，ph自然，转入发酵罐进行高温灭菌，灭菌后待温度降低至30℃时，接入5％菌种，转速100～150r/min培养144～192h，转出发酵液4000r/min离心30min，获得细黄链霉菌菌体；

d)配料：称取胶质芽孢杆菌15～20份，哈茨木霉菌15～20份，细黄链霉菌15～20份，混匀备用；

e)复合菌制粒：使用高速旋转制粒机对混匀的配料进行治粒，加入湿润剂，转速35hz搅拌制粒，过6目尼龙网后进行沸腾干燥，45℃干燥至水分为5～8％，获得复合菌颗粒；

f)第一层粘涂：将复合菌颗粒加入回转式颗粒包膜机，转速10～15r/min，通入50℃热风预热10～15min，用高压喷枪喷入20～30％酒精溶液至颗粒微微粘结，通入50℃热风2～3min，将植物油泥10～15份均匀地加入包膜机中，转动5～10min后再加入20～30％酒精溶液，反复操作3～5次，获得包泥颗粒；

g)第二次粘涂：将包泥颗粒中未粘结的植物油泥移除，通入热风预热10～15min，用高压喷枪喷入20～30％酒精溶液至颗粒微微粘结，通入50℃热风2～3min，将草木灰10～15份均匀地加入包膜机中，转动5～10min后再加入20～30％酒精溶液，反复操作3～5次，获得包灰颗粒；

h)第三次粘涂：将包灰颗粒中未粘结的草木灰移除，通入热风预热10～15min，用高压喷枪喷入20～30％酒精溶液至颗粒微微粘结，通入50℃热风2～3min，将壳寡糖10～35份均匀地加入包膜机中，转动5～10min后再加入20～30％酒精溶液，反复操作3～5次，获得包壳寡糖颗粒，50℃烘干至终水分为5～10％，将产品卸出。

优选的，植物油泥包括但不限于豆油泥、油菜籽油泥、花生油泥、棕榈油泥，油泥干燥后粉碎至100～200目。

优选的，草木灰目数100～200目，钾含量≥7％。

本发明的有益效果为：首先，选用对番茄青枯病有拮抗作用的三种菌为原料；第二，制粒后，采用低温45℃烘干，能最大程度保留菌的活力；第三，经过第一次粘涂，将活菌与碱性草木灰形成隔离，同时植物油泥将菌与空气和水进行了隔绝，能够长时间保证菌的较高存活率，且植物油腻在水环境中，溶解缓慢，可以达到缓释的效果，从而使复合菌作用时间更长；第四，草木灰外粘涂壳寡糖，能够达到先溶解壳寡糖诱导作物产生抵抗力，后溶出草木灰将土壤改变成碱性环境，碱性环境不利于茄科雷尔氏菌的生长，但利于本发明三种有益微生物的生长。

与现有技术相比，本发明原料使用更合理，环保高效，生产工艺简单易行，利于放大生产，添加的微生物及壳寡糖具有抗病作用，能增强植物抗逆能力，提高产品质量和产量，同时还具有使用方便的优点。

附图说明

图1是本发明的主要技术路线；

图2是本发明实验例1第一季发病情况；

图3是本发明实验例1第二季发病情况；

图4是本发明实验例1第三季发病情况。

具体实施方式

实施例1：

a)制备胶状芽孢杆菌菌体：菌种购自北纳生物，菌种编号bncc173119，制备菌种培养基50kg，配方为蛋白胨0.5kg，牛肉膏0.15kg，氯化钠0.25kg，ph7.5,121℃灭菌30min,接入购买菌种，摇床150r/min培养24h，获得菌种液；制备扩增培养基1t，配方为牛肉膏40kg、酵母浸出粉9kg、氯化钠3kg,ph7.5，转入发酵罐进行高温灭菌，灭菌后待温度降低至36℃时，接入50kg菌种液，转速120r/min培养26h，转出发酵液4000r/min离心30min，获得胶状芽孢杆菌菌体128.7kg。

b)制备哈茨木霉菌菌体：购自菌种购自上海交通大学木霉菌菌种保藏管理中心，制备菌种培养基，配制无琼脂pda培养基50kg，25℃时接入购买菌种，摇床120r/min培养144h，获得菌种液；制备扩增培养基1t，配方为蔗糖20kg、硝酸铵5kg、磷酸钠2kg、硫酸镁1kg，ph9.0，转入发酵罐进行高温灭菌，灭菌后待温度降低至25℃时，接入50kg菌种液，转速120r/min培养190h，转出发酵液4000r/min离心30min，获得哈茨木霉菌菌体109.6kg。

c)细黄链霉菌制备：中国工业微生物菌种保藏管理中心，购买菌种，制备菌种培养基，配方为无琼脂pda培养基50kg，30℃接入购买菌种，摇床150r/min培养144h，获得菌种液；制备扩增培养基1t，配方为葡萄糖10kg、淀粉20kg、黄豆饼粉15kg、碳酸钙3kg、磷酸氢二钾0.5kg、硫酸铵5kg、豆油5kg，ph自然，转入发酵罐进行高温灭菌，灭菌后待温度降低至30℃时，接入50kg菌种液，转速150r/min培养192h，转出发酵液4000r/min离心30min，获得细黄链霉菌菌体87.3kg。

d)配料：称取胶质芽孢杆菌128.7kg，哈茨木霉菌109.6kg，细黄链霉菌87.3kg，混匀备用。

e)复合菌粉制粒：使用高速旋转制粒机对混匀的配料进行制粒，加入湿润剂，转速35hz搅拌制粒，过6目尼龙网后进行沸腾干燥，45℃干燥至水分为6％，获得复合菌颗粒121.5kg。

f)第一层粘涂：将复合菌颗粒加入回转式颗粒包膜机，转速10r/min，通入50℃热风预热15min，用高压喷枪喷入20％酒精溶液至颗粒微微粘结，通入50℃热风3min，将植物油泥60kg均匀地加入包膜机中，转动10min后再用高压喷枪喷入30％酒精溶液少量，反复操作5次，获得包泥颗粒177.3kg。

g)第二次粘涂：将包泥颗粒中未粘结的植物油泥移除，通入热风预热15min，用高压喷枪喷入30％酒精溶液至颗粒微微粘结，通入50℃热风3min，将草木灰60kg均匀地加入包膜机中，转动10min后再用高压喷枪喷入30％酒精溶液少量，反复操作5次，获得包灰颗粒214.1kg。

h)第三次粘涂：将包灰颗粒中未粘结的草木灰移除，通入热风预热15min，用高压喷枪喷入30％酒精溶液至颗粒微微粘结，通入50℃热风3min，将壳寡糖120kg均匀地加入包膜机中，转动10min后再用高压喷枪喷入30％酒精溶液少量，反复操作5次，获得包壳寡糖颗粒，50℃烘干至终水分为6％，将产品卸出，共315.9kg。

实验例1：番茄青枯病盆栽防病试验

使用实施例1的方法所生产的复合微生物菌剂进行盆栽防病试验，试验步骤如下：

实验番茄品种于当地购买“农博粉霸15号”，青枯病病原菌茄科雷尔氏菌购自北纳生物编号bncc221120，实验土壤取自烟台市莱山镇友谊村大田，为易发生番茄青枯病的土壤，质地砂壤，ph＝5.3，有机质7.3g/kg，全氮(n)0.762g/kg，全磷(p2o5)0.577g/kg，全钾(k2o)15.3g/kg。试验共设置3个处理，分别为：t1：使用金正大多抗微生物菌剂进行灌根，施用量为3ml/m²；t2：使用本发明菌剂进行撒施，施用量为5g/m²；t3：不使用菌剂，作为对照。设计3季试验，每季试验进行3个处理，每个处理30株，每季前施用番茄双硫基硝态氮硫酸钾复合肥。

第一季高发病土壤试验：番茄苗生长3周后，通过向健康土壤中注入病菌法，使得土壤病原菌数达到10⁷以上，使番茄苗处于高浓度病原菌的环境中，其余为常规自然条件(温度25～35℃，湿度60～80％)。第二季高发病自然条件试验：第一季盆栽结束后，各处理盆栽土分开储存放置15天，保持湿度以维持病原菌数。第三季番茄正常条件生长试验：第二季盆栽结束后，各处理盆栽土同样分开存储放置15天，保持湿度。观察番茄苗生长情况，统计发病率，当对处理t3发病率达到80％时结束试验。发病等级如下：0级：叶面无萎蔫；1级：植株20％以下叶面出现萎蔫；2级：植株20～30％的叶面出现萎蔫；3级：植株30％～60％的叶面出现萎蔫；4级：植株60％以上的叶面萎蔫或死亡。

病情指数＝∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)×100％

本试验于2015～2016年在烟台丰成农业科技有限公司完成，当番茄生长2个月，株高约10cm时，进行盆栽移植，每3天记录一次，结果如下：

第一季盆栽，移栽第5周左右出现病例，发病前期，发病过程较缓慢，后发病率快速上升，由结果知t1和t2都较对照组发病率更低，都未到达45％，且发明菌剂较金正大菌剂发病率减少10％；第二季盆栽，移植第2天开始出现病例，对照组成指数增长，t1和t2组发病率增长平缓，且发明菌剂较正大菌剂发病率低；第三季盆栽第2周出现病例，对照组病情指数增长迅速，而t1和t2组病情指数增长平缓，且发明菌剂较金正大菌剂由较明显的低发病率。可见，本发明菌剂能有效防治番茄青枯病。

实验例2：番茄青枯病防治田间试验

使用实施例1的方法所生产的复合微生物菌剂进行田间试验，自2016年4月至2016年9月于烟台市福山区小河子村进行田间试验，供试试验田为近年来青枯病发病率较严重的地块，且经过有机肥施撒，实验番茄品种为农博粉霸1316。试验设置2个处理，分别为：t1：使用本发明菌剂进行撒施，施用量为5kg/667m²；t2：不使用菌剂，作为对照组。每个处理重复4次，小区面积100m²。

于种植30d、60d、90d、120d观察发病情况，病级：0级为叶面无症状；1级为植株上1/4以下叶面表现萎蔫状；二级为1/4～1/2叶面表现萎蔫状；3级为植株1/2以上叶面表现萎蔫症状；4级为全株萎蔫死亡。

发病率＝(发病株数/调查株数)×100％

病情指数＝∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)×100％

防控效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

表1不同处理番茄青枯病发病情况比较

栽培60天以后，发病率明显不同，未施菌剂的对照组，发病率为菌剂组发病率的5倍，且随时间推移，对照组发病率越来越高，最终达到一半植株发病，而施用发明菌剂组发病率最高为12.91％，且其各时期的病情指数也较对照组明显较低，说明病情不严重，防治效果皆在80％以上，可见本发明菌剂能显著防治番茄青枯病。