一种超氧化物歧化酶仿生材料及其制备方法和应用与流程

本发明属于材料技术领域，具体涉及一种超氧化物歧化酶仿生材料及其制备方法和应用。

背景技术：

超氧阴离子自由基(superoxideradical，o2^·-)是细胞内不同活性氧自由基(ros)链中的初始自由基，经过一系列反应生成其它的氧自由基。o2^·-的浓度波动与诸多生物学过程和疾病的发生发展密切相关。当其浓度正常时，会参与细胞的信号传导、控制细胞增殖、分化和凋亡、并促进多种有细胞生物学效应有关因子启动；而当细胞内的动态平衡被打破，o2^·-浓度变高时，则会引起氧化应激反应、导致细胞膜的脂质过氧化、引起dna氧化损伤、介导细胞内的蛋白质变性等，进一步造成细胞的癌变、肿瘤的发生和发展、以及心血管疾病等。因此，对活细胞释放的o2^·-进行原位实时的定量检测，不仅能更全面了解其在细胞生理活动中的作用，更有助于我们揭示与其相关疾病的发生机制，从而提供在病理学认知下的可靠疾病诊断。然而，o2^·-的细胞释放浓度很低且活性极高，对其原位实时检测十分困难。在诸多检测方法中，电化学方法表现出响应快、灵敏度高、操作简易、成本低等优点，非常适合在避免对活细胞新陈代谢和相关生理活动造成破坏的前提下，用于对活细胞实时释放o2^·-的浓度检测。因此，设计合成具有高灵敏度、高选择性、低检测限、成本低廉的o2^·-电化学生物传感器成为目前研究的重点和难点之一。

迄今为止，针对o2^·-的电化学传感器主要可分为o2^·-生物酶电化学传感器和o2^·-非酶电化学传感器两类。o2^·-生物酶电化学传感器是指基于细胞色素c(cytc)或sod的o2^·-电化学传感器。o2^·-非酶电化学传感器是指利用非酶材料来模拟天然酶的结合位点或活性位点而制备的o2^·-电化学传感器。而天然生物酶存在极易受到温度、湿度和ph等影响而导致其丧失催化活性的问题，且其成本相对较高。这些劣势都制约了o2^·-生物酶电化学传感器被应用于实际样品检测。因此，不存在此类问题的o2^·-非酶电化学传感器具有更大的市场应用前景。

目前，关于o2^·-模拟酶电化学传感器的研究报道，主要集中在模拟天然酶的替代材料上。超氧化物歧化酶是一种广泛分布于生物体内的氧化还原酶，其活性部位均含有金属，故也称金属蛋白酶。作为氧化还原酶，尤其是参与电子传递的氧化还原酶，其结构与作用机制一般较为复杂。常见的三类不同金属中心sod都能将o2^·-歧化为o2和h2o2，它们是o2^·-的专一性酶，歧化反应速度极快，是最有效的检测o2^·-的生物酶。因此，关于超氧化物歧化酶仿生材料的发明最具有应用潜力。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种超氧化物歧化酶仿生材料的制备方法；目的之二在于提供一种超氧化物歧化酶仿生材料；目的之三在于提供一种电化学传感器；目的之四在于提供该电化学传感器在检测活细胞释放超氧阴离子自由基中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种超氧化物歧化酶仿生材料的制备方法，所述方法如下：

将纳米碳材料分散于水中，然后加入磷酸根供体，超声分散后，再加入过渡金属盐，20-30℃下搅拌反应1-5h后离心取沉淀，将所述沉淀洗涤后真空干燥，即可；所述纳米碳材料、磷酸根供体与过渡金属盐的质量比为1-20:2-10:1-10。

优选的，所述超声分散具体为在超声功率为60-100w，超声频率为20-40hz的条件下超声10-60min。

优选的，所述离心具体为以5000-12000r/min的速度离心5-10min。

优选的，所述真空干燥具体为在50-80℃下干燥12-48h。

优选的，所述纳米碳材料为石墨烯、碳纳米管、碳纳米纤维或生物质碳材料中的一种；所述磷酸根供体为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、植酸或dna中的一种；所述过渡金属盐为钴盐、镍盐、锰盐、铜盐或铁盐中的一种。

2、由所述的方法制备的超氧化物歧化酶仿生材料。

3、一种电化学传感器，包括电化学工作站、工作电极、对电极、参比电极、电解池和电解液，所述工作电极表面涂覆有所述的超氧化物歧化酶仿生材料。

优选的，所述工作电极按如下方法制备：

将超氧化物歧化酶仿生材料以0.5-5mg/ml的配比浓度分散于水中，获得电极修饰溶液，将所述电极修饰溶液涂覆到电极上，干燥后再涂覆粘接剂，再次干燥即可。

优选的，两次干燥具体为在20-30℃下干燥3-10h。

优选的，所述粘接剂为nafion溶液，所述nafion溶液中nafion的质量分数为0.1％。

4、所述的一种电化学传感器在检测活细胞释放超氧阴离子自由基中应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种超氧化物歧化酶仿生材料及其制备方法和应用，本发明在制备超氧化物歧化酶仿生材料时，通过合理设定纳米碳材料、磷酸根供体与过渡金属盐三者的质量比，同时合理选择过渡金属盐的种类，使以最终制备的超氧化物歧化酶仿生材料为原料制备的电化学传感器不仅具有优异的选择性、很短的响应时间、较低的检测限，还具有极高的反应灵敏度。其中，纳米碳材料的加入可以提高仿生材料的导电性，提升其整体的电子传递性能，选择合适的过渡金属离子及控制其负载量，可以很好的提升仿生材料的选择性，加入磷酸根供体能够负载更大量的过渡金属离子，从而使仿生材料具有更多的检测活性位点。以该仿生材料制备的传感器相比于传统材料制备的传感器，在实时定量检测超氧阴离子自由基时，显示出了更高的性能，能够在原位实时检测活细胞释放的超氧阴离子自由基方面有重要的应用前景。该材料制备过程简单便捷、原材料成本低廉，便于商业化应用。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为实施例1中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的fesem图；

图2为实施例1中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的tem图；

图3为实施例1中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的接触角测试图；

图4为实施例2中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的fesem图；

图5为实施例2中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的tem图；

图6为实施例3中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的fesem图；

图7为实施例3中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的tem图；

图8为在电压范围为-0.2-0.8v下，实施例1中构建的传感器对o2^·-的循环伏安响应测试结果图；

图9为实施例1中构建的传感器在不同扫速下的cv曲线图；(其中图9中a为该传感器在不同扫速下的cv曲线图，图9中b为氧化峰值电流和扫描速度的变化呈现出线性关系图)

图10为在循环伏安曲线的峰值电压(0.60v)下，实施例1中构建的传感器对o2^·-的计时电流响应测试结果图；(图10中a为在0.60v的固定电位下，向电解液中连续添加5nmol·l^-1o2^·-时，实施例1中构建的工作电极相对于hg/hg2cl2参比电极的i-t响应图，图10中b为实施例1中构建的传感器对o2^·-的响应时间图，图10中c为在0.60v的固定电位下，向电解液中连续添加25nmol·l^-1o2^·-时，实施例1中构建的工作电极相对于hg/hg2cl2参比电极的i-t响应图，图10中d为实施例1中构建的传感器检测到的稳态电流与o2^·-浓度之间的线性关系图)

图11为实施例1中构建的传感器对不同干扰成分选择性测试结果图；

图12为实施例1中构建的传感器实时检测a549细胞在zym刺激下释放的o2^·-时的it曲线图(图12中a为a549细胞的光学显微镜图像；图12中b为在0.60v的固定电位下，该传感器对a549细胞释放o2^·-的i-t响应图)。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

实施例1

制备超氧化物歧化酶仿生材料及涂覆该材料的工作电极，并构建超氧阴离子自由基电化学传感器

(1)将多壁碳纳米管(mwcnts)分散于去离子水中，然后在持续搅拌下加入植酸(pa)，在超声功率为80w，超声频率为40hz的条件超声30min后，再加入硫酸锰，25℃下搅拌反应1h后以10000r/min的速度离心10min后取沉淀，将沉淀以去离子水洗涤后在60℃下真空干燥24h，制得超氧化物歧化酶仿生材料；其中，多壁碳纳米管、植酸与硫酸锰的质量比为1:3:1.5；

(2)将步骤(1)中制备的超氧化物歧化酶仿生材料以2mg/ml的配比浓度分散于水中，获得电极修饰溶液，将该电极修饰溶液涂覆到玻碳电极上，在26℃下干燥5h后再涂覆nafion质量分数为0.1％的nafion溶液，再次在26℃下干燥5h，制得表面涂覆有超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极；

(3)将步骤(2)中制得的表面涂覆有超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极与电化学工作站、对电极(铂丝电极)、参比电极(hg/hgcl2电极)、电解池和电解液(浓度为0.01mol/l，ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液)一起组装成超氧阴离子自由基电化学传感器。

图1为实施例1中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的fesem图，由图1可知，球形mn-pa均匀生长在mwcnts表面。

图2为实施例1中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的tem图，由图2可知，球形mn-pa的粒径为80nm左右。

图3为实施例1中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的接触角测试图，由图3可知，该仿生材料具有亲水性，其接触角为45.54°，具备捕获o2^·-的能力。

实施例2

制备超氧化物歧化酶仿生材料及涂覆该材料的工作电极，并构建超氧阴离子自由基电化学传感器

(1)将碳纳米纤维(cnf)分散于去离子水中，然后在持续搅拌下加入dna，在超声功率为100w，超声频率为20hz的条件超声10min后，再加入硝酸锰，20℃下搅拌反应5h后以12000r/min的速度离心5min后取沉淀，将沉淀以去离子水洗涤后在50℃下真空干燥48h，制得超氧化物歧化酶仿生材料；其中，碳纳米纤维、dna与硝酸锰的质量比为10:10:6；

(2)将步骤(1)中制备的超氧化物歧化酶仿生材料以5mg/ml的配比浓度分散于水中，获得电极修饰溶液，将该电极修饰溶液涂覆到玻碳电极上，在30℃下干燥3h后再涂覆nafion质量分数为0.1％的nafion溶液，再次在30℃下干燥3h，制得表面涂覆有超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极；

(3)将步骤(2)中制得的表面涂覆有超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极与电化学工作站、对电极(铂丝电极)、参比电极(hg/hgcl2电极)、电解池和电解液(浓度为0.01mol/l，ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液)一起组装成超氧阴离子自由基电化学传感器。

图4为实施例2中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的fesem图，由图4可知，球形mn-dna均匀生长在cnf上。

图5为实施例2中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的tem图，由图5可知，球状mn-dna的粒径为70nm左右。

实施例3

制备超氧化物歧化酶仿生材料及涂覆该材料的工作电极，并构建超氧阴离子自由基电化学传感器

(1)将石墨烯分散于去离子水中，然后在持续搅拌下加入磷酸二氢钾，在超声功率为60w，超声频率为30hz的条件超声60min后，再加入硫酸钴，30℃下搅拌反应3h后以5000r/min的速度离心10min后取沉淀，将沉淀以去离子水洗涤后在80℃下真空干燥12h，制得超氧化物歧化酶仿生材料；其中，石墨烯、磷酸二氢钾与硫酸钴的质量比为20:5:10；

(2)将步骤(1)中制备的超氧化物歧化酶仿生材料以0.5mg/ml的配比浓度分散于水中，获得电极修饰溶液，将该电极修饰溶液涂覆到玻碳电极上，在20℃下干燥10h后再涂覆nafion质量分数为0.1％的nafion溶液，再次在20℃下干燥10h，制得表面涂覆有超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极；

(3)将步骤(2)中制得的表面涂覆有超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极与电化学工作站、对电极(铂丝电极)、参比电极(hg/hgcl2电极)、电解池和电解液(浓度为0.01mol/l，ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液)一起组装成超氧阴离子自由基电化学传感器。

图6为实施例3中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的fesem图，由图6可知，片状磷酸钴均匀生长在二维石墨烯上。

图7为实施例3中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的tem图，由图7可知，该片状磷酸钴的尺度为微米级。

实施例4

将含有500nmol·l^-1o2^·-的pbs溶液加入到实施例1中构建的传感器的电解液中，在电压范围为-0.2-0.8v下测试该传感器对o2^·-的循环伏安响应，同时以该传感器对磷酸缓冲溶液的循环伏安响应作为空白对照。结果如图8所示，由图8可知，在含有500nmol·l^-1o2^·-的pbs溶液中，氧化峰电流比不含o2^·-的pbs中的氧化峰电流明显增加，说明该传感器对o2^·-有明显的电化学催化氧化能力。

实施例5

将含有1μmol·l^-1o2^·-的pbs溶液加入到实施例1中构建的传感器的电解液中，利用循环伏安法在不同扫速(1mv·s^-1、10mv·s^-1、20mv·s^-1、30mv·s^-1、40mv·s^-1、50mv·s^-1、60mv·s^-1)下进行扫描，结果如图9所示，其中图9中a为该传感器在不同扫速下的cv曲线图，图9中b为氧化峰值电流与扫描速度的线性关系图，由图9可知，氧化峰电流随扫描速度的增大而增大，且呈线性关系，其线性方程为y＝0.2476x+1.4599(r²＝0.9943)，表明传感器中工作电极上的仿生材料对o2^·-的催化是一种表面控制过程。

实施例6

在循环伏安曲线的峰值电压(0.6v)下测试实施例1中构建的传感器对o2^·-的计时电流响应，测试时连续向实施例1中构建的传感器的电解液中加入不同浓度的o2^·-溶液，时间间隔为50s，记录响应时间与电流值的关系曲线，即得该传感器对o2^·-的安倍响应图，结果如图10所示，其中图10中a为在0.60v的固定电位下，向电解液中连续添加5nmol·l^-1o2^·-时，实施例1中构建的工作电极相对于hg/hg2cl2参比电极的i-t响应图，图10中b为实施例1中构建的传感器对o2^·-的响应时间图，图10中c为在0.60v的固定电位下，向电解液中连续添加25nmol·l^-1o2^·-时，实施例1中构建的工作电极相对于hg/hg2cl2参比电极的i-t响应图，图10中d为实施例1中构建的传感器检测到的稳态电流与o2^·-浓度之间的线性关系图；由图10可知，响应电流随着o2^·-浓度的增加而增长(如图10中a和图10中c所示)，在注入o2^·-后，传感器的响应非常迅速，且在2.15秒内即形成了稳态电流(如图10中b所示)，在1.25nmol·l^-1到175nmol·l^-1的范围内，响应电流与o2^·-浓度的线性方程可以表示为：i(μa)＝0.053c(nmol·l^-1)+0.669(0<i(μa)<10)(r²＝0.998)，灵敏度为757.16μa·(μmol·l^-1·cm²)^-1，检测限为1.25nmol·l^-1(信噪比s/n＝3)(如图10中d所示)。

实施例7

将不同物质的溶液依次加入到实施例1中构建的传感器的电解液中，测试该传感器对不同干扰成份的计时电流响应，测试电压为0.6v，每隔50s分别依次连续地向传感器中的电解液中加入25nmol·l^-1的o2^·-、5μmol·l^-1的nano3、kcl、aa、ua、da和1μmol·l^-1h2o2，得到该传感器对不同干扰成分选择性测试的安培响应曲线，结果如图11所示，由图11可知，5μmol·l^-1的na⁺、k⁺、no3^-、cl^-、aa和ua均不会对该传感器检测25nmol·l^-1的o2^·-引起干扰，5μmol·l^-1da和1μmol·l^-1h2o2会引起可见却不显著的响应，皆不至于对o2^·-的检测产生干扰，说明该传感器对o2^·-具有良好的特异性。

实施例8

将实施例1中构建的传感器用于a549细胞检测，细胞密度为1×10⁴个/ml，具体为在0.60v的固定电位下，通过计时电流法在如下三种情况下实时检测a549细胞在zym刺激下释放的o2^·-：(1)向细胞注射0.2mg·ml^-1zym；(2)向细胞注射0.2mg·ml^-1zym和300u·ml^-1sod的混合液；(3)向未加入细胞的电解液中加入0.2mg·ml^-1zym。结果如图12所示，其中，其中图12中a为a549细胞的光学显微镜图像，图12中b为在0.60v的固定电位下，该传感器对a549细胞释放o2^·-的i-t响应图，由图12可知，当分析电位为0.6v时，加入0.2mg·ml^-1zym促使细胞释放o2^·-，检测到较大的电流响应(如图12中b中曲线i所示)，而加入0.2mg·ml^-1zym和300u·ml^-1sod的混合液并未引起显著的电流变化(如图12中b中曲线ⅱ所示)，表明细胞释放的o2^·-已被sod消耗掉，在相同试验条件下，向不存在a549细胞的电解液中加入0.2mg·ml^-1zym同样检测不到显著的电流变化(如图12中b中曲线ⅲ所示)。因此，可以证实曲线i展示的电流响应(0.66μa)是由a549细胞在zym刺激下释放的o2^·-被传感器中工作电极上的仿生材料捕获并在其表面发生氧化反应而产生的。根据标准线性方程计算出2.0mg·ml^-1zym刺激a549细胞释放的o2^·-浓度为1.32nmol·l^-1，进而可知每个细胞释放的o2^·-浓度为0.66fmol。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。