专利名称：一种十一肽及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及肽化学，特别是涉及一种新的11肽，其制备方法和用途。
APP11肽是我们首次发现的一种新的多肽，迄今尚未发现有关它肽的任何报道。
90年代中期曾经发现APP17肽，β-淀粉样肽前体蛋白(β-Amyloid precursor protein,APP)肽链中第319-335位的肽段具有神经营养作用，包括促进轴突生长、增加突触密度、能保护缺血引起的脑神经元损伤。
本发明的目的是要寻找一种肽链较APP17肽短，合成较APP17肽容易的，具有神经营养作用的多肽。经过几年的研究我们最终发现了一种新的11肽，APP11肽，它不但具有神经营养作用，而且可能治疗神经元退行性变。
本发明的APP11肽是β-淀粉样肽前体蛋白N端第63-73位肽段，由11个氨基酸残基组成，序列为异亮氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-谷氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-半胱氨酸(IDTKEGILQYC)。我们经反复研究APP N端各种不同长度的多肽片段的生物活性，最终发现并确定APP11肽具有神经营养作用。
迄今为止我们的研究发现APP11肽具有如下功能1．在体外，能增加人神经母细胞瘤株SY5Y细胞胞体面积和轴突长度，促进细胞增殖和存活能力。
2．改善糖尿病小鼠的学习记忆功能和海马神经元中一些重要蛋白质的表达。
3．改善糖尿病小鼠坐骨神经传导速度和一些蛋白质的表达。
以上结果表明APP11肽具有神经营养作用，并存在改善实验性神经元退行性变的能力。
本发明APP11肽采用固相法合成，固相肽合成的主要思想是先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键的结构同一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应，接长肽链。这样的步骤可以反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肽链的长度。下式表示了这个合成过程。 原料HMP resin(P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂)Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸)NMP氮甲基吡咯烷酮DCM二氯甲烷甲醇哌啶DMAP二甲基氨基吡啶HOBT羟基苯并三唑DCC二环己基碳二亚胺TFA三氟乙酸EDT 1,2-乙二硫醇硫代苯甲醚结晶苯酚乙腈仪器多肽自动合成仪(美国ABI431A型)旋转蒸发仪(日本Yamato RE50)高效液相色谱仪(美国PE151A型)冷冻干燥机合成方法称取HMP树脂100mg，取代当量是1.0meq，即0.1mmol于美国ABI431A型多肽自动合成仪的反应腔内，由合成仪自动将特定的AA按不同的顺序连接起来，偶联率达99％。反应如下1．氨基酸的活化(HOBt/DCC法) Fmoc保护的氨基酸 2．联接氨基酸到树脂上 3．脱去氨基酸的Fmoc保护基 4．氨基酸的活化(HOBt/DCC法)HOBt/DCC
5．偶联 新的偶联的肽-树脂重复3-5直至合成结束，得到APP11肽的肽树脂。
IDTKEGILQYC-树脂350mg将肽链从树脂上切落用TFA(三氟乙酸)切割肽链，用EDT，硫代苯甲醚，H2O作清除剂，在室温下反应3.0小时，除去切割试剂，再用乙醚萃取，得到APP11肽的粗品为100mg，收率为85％。APP11肽的纯化高效液相色谱分离纯化条件色谱柱C810×100mm色谱仪ABI 151A型 美国流动相A-0.1％TFA(三氟乙酸)H2OB-0.1％TFA(三氟乙酸)于60％乙腈检测波长 214nm流速 4ml/分钟洗脱梯度 20-60％B于30分钟HPLC(高效液相色谱)分析色谱柱 C184.6×150mm流动相 A-0.1％TFA(三氟乙酸) H2OB-0.1％TFA(三氟乙酸)于乙腈检测波长214nm流速1ML/min洗脱梯度0-60％B于30分钟分析结果见附表A．APP11肽的鉴定APP11肽AA组份分析结果见附表B．序列IDTKEGILQYC(异亮氨酸-天门冬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-谷氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-半胱氨酸)以Gly(甘氨酸)做标准理论值 测定值Gly(甘氨酸)11Ile(异亮氨酸) 21.86Leu(亮氨酸)10.98Tyr(酪氨酸)11.00Lys(赖氨酸)11.00Glu(谷氨酸)12.27Thr(苏氨酸)10.95Asp(天门冬氨酸)10.98Cys(半胱氨酸) 11.2Gln(谷氨酰胺) 1注Gln(谷氨酰胺)在酸解过程中被破坏变为Glu(谷氨酸)，所以Glu(谷氨酸)为2，而Gln(谷氨酰胺)为0。
AA组份分析结果显示与目的肽的组份相符，证明合成是成功的。表A APP11肽的高效液相色谱分析结果A4700色谱数据工作站日期1999.8.20时间7:52通道B样品名称APP11分析方法号分析次数10分析方法归一法峰面积 最小峰宽4 噪声 363色谱仪 检测器操作人色谱柱C184.6*1 载体名称 分 秒峰面积 峰高标记 含量 单位1 15 416851441672290BB 100.0000％合计 6851441672290 100.0000表B APP11肽的氨基酸组份分析结果0-285009/21/9917:27SAMPLE: 7AG: 101OH: 1VIAL: 1PROB-NO.:1FILE: 1 CALC-METHOD: EBT-STDTABLE:1CONC: AREANO.NAME RT HEIGHT AREAn moln9 RATIO1 Cy503H 2.20 8493913180010.000 0.0 0.03 Asp6.82 6585112838384.144551.6102.74 Thr7.52 6432712891624.009477.4101.85 Ser8.25 1315 244600.076 8.0105.06 Glu9.1614558126850469.542 1403.6100.07 Gly12.247255012837994.199315.4100.68 Ala12.98 1004 154720.054 4.8104.211 Ile17.918328821762027.790 1022.1100.412 Leu19.044440511806984.130541.9102.013 Tyr19.986025411312604.200761.1102.614 9-ABA 21.82 347 148080.055 5.7365.416 Lys23.409356513236254.203614.4101.317 NH324.724669111125206.688113.7100.121 Ars30.46 373 146810.051 8.8143.3TOTAL764490 14853572 49.147 5829.2PEAK REJ: 10000SF : 1.000SAMP-AMT: 1.000INJ-VOL : 10.001．实验方法采用国际公认的实验方法进行水迷宫实验、免疫组化染色和神经细胞培养。
1)水迷宫实验动物成模后3周行水迷宫试验，每天训练2次，连续5天，第1天2个盲端，第2天3个盲端，第3、4、5天4个盲端，以头部碰到盲端为1次错误，记录每只小鼠游完全程的时间及错误反应次数。
2)海马神经原免疫组织化学研究经固定后的鼠脑行冰冻切片，进行各种抗体的免疫组化染色。Sp免疫组化试剂盒购自Zymed Laboratories公司。按说明书进行实验。
免疫组化定量分析(1)每组动物各3只，每只于相应海马部位连续切片，每隔2张取1张，即共取15张切片计数。(2)用奔腾Visilog 5图像分析软件对进行免疫组化标记的每张切片随机选5-6个阳性细胞，测其胞浆平均灰度。
数据资料处理计数资料用均数±标准差表示，显著性检验用方差分析法。
3)体外实验应用人神经母细胞瘤株SY5Y，细胞培养条件为MEM培养基中加入10％胎牛血清。将SY5Y细胞分为对照组、损伤组和APP11肽保护组。①MTT溴化(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]二苯基四唑，Sigma产品)代谢率测定将SY5Y细胞以密度为1×103.ml-1接种于96孔板(Costar产品)，3天后分为对照组、损伤组和APP11肽组保护，每组8孔。接种后第4天每孔加MTT(5mg.ml-1)20μl,37℃孵育4小时，吸出培养液，每孔加入DMSO200μl，振摇10分钟，用酶标仪(Diagnostic Pasteur LP400)测定550nm处光密度值(OD)。
(MTT为噻唑蓝，被培养的细胞摄取后，通过线粒体代谢生成甲赞(formazane)，故线粒体活力越旺盛，甲赞生成越多，光密度值也越高。通过测定MTT代谢率，可反应细胞生存情况)②细胞计数③乳酸脱氢酶(LDH)漏出率测定按照LDH测定试剂盒所示方法(比色法)，测定450nm处光密度值，同时做LDH标准曲线。④形态学观察应用医学影像计算机图像处理系统测定细胞轴突长度和胞体面积。⑤统计学处理应用SPSS软件做t检验统计。材料由发明人按前述方法全合成的APP11肽。实验动物为小鼠和大鼠，小鼠为昆明种，体重32-37克，8周龄。大鼠为Wistar,250克左右，16周龄。动物模型制备和防治分为对照组(C组)、糖尿病组(DM组)和APP11肽治疗组(APP11肽+DM组)表1．动物模型制备和给药
糖尿病小鼠模型雄性昆明小鼠，体重32-37克，随机分为三组正常对照组(C组)、糖尿病对照组(DM组)、APP11肽防治组(11P+DM组)。11P+DM组于糖尿病成模后2周起至4周皮下注射APP11肽，每次0.35ug/只，每天一次。小鼠禁食12小时后按200mg/kg体重剂量腹腔注射STZ，三天后测非禁食血糖，大于15mM/L者认为糖尿病模型复制成功。糖尿病大鼠模型复制方法同上。2．实验结果1)体内实验①糖尿病小鼠水迷宫实验结果表2．游完水迷宫全程所需时间
*与DM组相比p＜0.05**与DM组相比p＜0.01表3．水迷宫测试错误反应次数
*与DM组相比p＜0.05**与DM组相比p＜0.01水迷宫测试结果显示DM组游完全程时间延长，错误反应次数增多，与C组相比有非常显著性差异，与DM+APP11肽组相比有显著性差异。结果表明，DM组存在学习、记忆功能障碍，APP11肽对糖尿病小鼠的学习、记忆功能障碍有改善作用。②神经组织免疫组化染色表4．三组小鼠海马三种PS-1抗体阳性细胞数目比较
##与C组相比P＜0.01,**与DM组相比P＜0.01
表5．三组小鼠海马NF,NGF抗体阳性细胞数目比较
**与DM组相比P＜0.01表6．三组小鼠海马三种PS-1抗体阳性细胞灰度比例三色值比较
##与C组相比P＜0.01,**与DM组相比P＜0.01
表7．三组小鼠海马NF,NGF抗体阳性细胞灰度比例三色值比较
**与DM组相比P＜0.01以上结果表明，APP11肽对小鼠海马神经原NF、NT-3、PS-1的表达有明显影响。③外周神经组织和血中某些成分的改变A)APP11肽可使糖尿病大鼠坐骨神经传导速度恢复正常。
表8．APP11肽皮下注射3μg/日，2月后对大鼠传导速度的影响
*与DM+11P及C组比较P＜0.05B)APP11肽不影响血糖及血糖调节激素。
表9．正常大鼠静推APP11肽50μg/只，对血糖的影响
表10．正常大鼠静推APP11肽10μg/只，对血糖调节激素的影响
C1静推APP11肽前，C2静推APP11肽后。P＞0.05C)APP11肽对肾功能的影响表11．皮下注射APP11肽3μg/日，2月后对肾功能的影响
*与C组比较P＜0.05#与DM组比较P＜0.05以上结果说明，APP11肽具有改善糖尿病大鼠神经元退变的功能，而且不是通过降低血糖途径完成的。2)体外实验①MTT代谢率测定结果显示APP11肽组MTT代谢率高于对照组，有显著性差异。
表12．APP11肽对SYSY MTT代谢率影响
*与对照组相比P＜0.05②细胞计数结果显示APP11肽组细胞数在第1、2、3天均高于对照组，有显著性差异。
表13．细胞计数观察APP11肽对SY5Y生长的影响(x±s)
*与对照组相比P＜0.05,**与对照组相比P＜0.01③LDH漏出率测定结果显示经细胞数标化后，APP11肽组LDH与对照组相比均有高度显著性差异。
表14．APP11肽对SY5Y LDH漏出率的影响
**与对照组相比P＜0.01④形态学观察APP11肽能促进神经元轴突生长和胞体增大。轴突长度C组42.22±22.07 APP11肽组89.67±39.38胞体面积C组749.69±207.65 APP11肽组1101.66±355.31我们认为APP11肽治疗神经原退变的可能机理是糖尿病动物模型具有神经退行性变的表现，神经营养因子NT-3、BDNF、NGF等表达减少，提示可能由于支持神经元功能的神经存活因子减少，使多种存活因子的受体后传导信号强度低于阈值，神经元基因转录不能被激活而导致神经元退变。给予外源性APP11肽后，可通过信号传导过程中相互对话增强神经存活因子的信号传导而激活神经元功能，治疗神经元退变。因为APP11肽并不影响血糖及其调节激素，故其作用与胰岛素无关。APP11肽的神经营养作用可能通过G蛋白偶联受体，激活胰岛素受体底物-1，最终起到防治糖尿病神经元退变的作用。
APP11肽将是世界上第一个治疗神经退行性疾病的药物。体内外研究表明APP11肽有增强神经元的存活能力和减少有害因子的作用，所以APP11肽的治疗谱至少可包括1．早、中期AD2．糖尿病神经病变3．减轻脑卒中对神经元损害4．绝经期综合症5．脑和神经损伤6．帕金森氏病但是APP11肽还有很大潜力。最近我们发现它对糖尿病肾病有治疗作用，对实验性肺动脉高压有降压作用，因此对小血管病变的治疗效果如能重复则对理解和治疗小血管病变、提供药物作用新的靶位一改善外周神经退行性变，这将成为防治小血管病变如高血压、糖尿病等的新概念。
本发明的APP11肽可以单独使用，也可与各种接受的载体、赋形剂制成适用的剂形。
附件1研究方法的主要参考文献1．Fuller SJ,Storey E,et al.Intracellular production of βA4 Amyloid ofAlzheimer’s Disease:Modulation by phosphoralytion and lack ofcoupling to the secretion of the Amyloid precursor protein.1995,34,8091-8098,Biochemistry细胞内产生老年性痴呆的βA4淀粉样肽通过磷酸化调节和缺乏淀粉样肽前体蛋白分泌的偶合生物化学杂志2．Ostrerova N,Petrucelli L,et al.α-Synuclein shares physical andfunctional homology with 14-3-3 proteins.The Journal of Neurosci.1999,19(14):5782-5791α-共核蛋白与14-3-3蛋白在生理功能上有同源性神经科学杂志3．Faircloth GT,Stewart D,Clement JJ.A simple screening procedure forthe quantitative measurement of cytotoxicity to resting primarylymphocyte cultures.Journal of Tissue Culture Methods.1988,11(4):201-205原代淋巴细胞培养中细胞毒性定量，测定的单纯筛查步骤组织培养法杂志4．赵咏梅，赵志炜，姬志娟等。APP17肽对糖尿病小鼠微管结构和tau蛋白磷酸化有关酶类的影响中华老年医学杂志18(5):3061999钱玉英赵咏梅等。APP17肽对糖尿病小鼠学习、记忆功能及海马NT-3、胆碱乙酰化酶神经元表达的影响中华老年医学杂志18(6):1999
权利要求
1．序列为异亮氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-谷氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-半胱氨酸的11肽。
2．含有有效量权利要求1的11肽及可接受的辅剂具有神经营养作用和治疗神经元退行性变疾病的药物组合物。
3．权利要求1的肽在制备具有神经元营养作用和治疗神经元退行性变疾病的药物中的应用。
4．按照权利要求3的应用，其中神经元退行性变疾病是早中期AD、糖尿病神经病变、减轻脑卒中对神经元损害、绝经期综合症、脑和神经损伤、帕金森氏病。
全文摘要
本发明提供了一种新的11肽，它由11个氨基酸残基组成，其序列为异亮氨酸－天冬氨酸－苏氨酸－赖氨酸－谷氨酸－甘氨酸－异亮氨酸－亮氨酸－谷氨酰胺－酪氨酸－半胱氨酸(IDTKEGILQYC)，本发明还公开了它具有神经营养作用和治疗神经元退行性变疾病的用途。
文档编号C07K7/00GK1317493SQ00105799
公开日2001年10月17日 申请日期2000年4月11日 优先权日2000年4月11日
发明者盛树力, 姬志娟, 赵咏梅, 王蓉, 赵志炜, 张景艳, 艾厚喜 申请人:首都医科大学宣武医院