双功能癌症治疗剂的制作方法

专利名称：双功能癌症治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明大体上涉及制备融合分子和使用该融合分子进行癌症治疗的方法学。
背景技术：
如Miller et al.，(eds)BIOLOGY OF FEMALE CANCERS，31-42(CRC Press，1997)所报道，人类乳腺癌是一种主要的恶性肿瘤，并且是西方女性癌症死亡的主要原因。根据美国癌症学会(AmericanCancer Society)最近的估计，每8名美国妇女中就有一名患有乳腺癌并且该病症在1998将夺去43,500位妇女的生命。
多种类型的证据已经将促乳素(PRL)同乳腺癌发生紧密联系起来。已经报道促乳素受体(PRLR)在人类乳腺癌细胞中的表达与正常乳腺上皮细胞相比较高(Reynolds et al.，1997)，在手术中除去的乳腺癌组织亦是如此(Touraine，Martini P.et al.，IncreasedExpression of Prolactin Receptor Gene In Human Breast TumorsVersus Continguous Normal Breast Tissues，(Abstract)79thAnnual Meeting of Endocrine Society，p.113，(1997))。恶性乳腺组织中的PRLR水平可以比其周边正常组织高出5倍(见上文提及的Touraine等人(1997)的文献)，这导致这些细胞对hPRL的刺激高度敏感。另外，据认为雌激素在乳腺中的一种促有丝分裂活性的机制可能影响了人类促乳素(hPRL)的产生和分泌，这是因为在PRLR、雌激素受体(ER)或者孕酮受体水平之间具有某种正相关(Sirbasku，1978；Dixon and Lippman 1986；Lippman and Dickson，1989)。综合这些发现而产生了一种假说认为，hPRL作为一种自分泌/旁分泌的生长因子而在哺乳动物的癌症发生中起着重要的作用(Clevenger，et al.，Am.J.Pathology，146695-705(1995)；Ginsburg，E.etal.，Cancer Res.，552591-2595(1995))。
PRL表达和前列腺疾病的联系已经在Wennbo et al.，Endocrinol.1394410-4415(1997)中被提出。根据Aragona et al.，Endocrinol.97677-684(1975)以及Leake et al.，J.Endocrinol.，99321-328(1983)的报道，在前列腺组织中发现了PRL受体。另外，随着年龄的增加可观察到PRL水平的提高(Hammond et al.，Clin.Endocrinol.，7129-135(1977)，Vekemans et al.，Br.Med.J.4738-739(1975))，这与前列腺增生的发生相一致。过表达PRL基因的转基因小鼠发生了前列腺的明显增大(见上文提及的Wennbo等人(1997)的文献)。
从PRL信号传递同乳腺和前列腺癌之间的联系来看，PRL信号传递对于治疗性发明是一个有吸引力的目标。然而，迄今没有适当的药物用于该目的。
免疫方法在癌症治疗中有良好的前景。有充足的证据表明癌细胞表达肿瘤特异性抗原并且患者具有可对这些抗原作出应答的T细胞(Boon，Toward T.，A genetic Analysis of Human Tumor RejectionAntigen，Advances in Cancer Research，58177-210(1992)；Urban，JL et al.，Tumor Antigens，Annu.Rev.Immuno.10617-644(1992))。然而，这些T细胞在许多情况下在同癌症的对抗中是无反应性或者无效能的。迄今为止，对于肿瘤治疗的免疫方法的主要努力在于增强针对肿瘤抗原的微弱的宿主免疫反应，例如通过细胞因子对患者的外源给药。
在众多被使用的细胞因子中，白细胞介素2(IL-2)已被证明具备有希望的效果。IL-Z为负责T淋巴细胞从细胞周期的G1期向S期进展的主要细胞因子(见，Morgan et al.，Science 1931007-1008(1979))。IL-2对淋巴细胞的主要作用如下(1)IL-2作为T淋巴细胞的主要自分泌生长因子决定了T细胞依赖性免疫反应的强度。(2)IL-2刺激了自然杀伤细胞(NK)细胞的生长并且增强其溶细胞效能，如在Hendrzak et al.，EXPERIMENAL AND CLINICAL AGENTS，263-282 Humana Press Inc.(1997)中的报道。
然而，已经有报道接受全身IL-2的癌症患者通常可能会经受威胁生命的副作用，这限制了可用于给药的总量从而直接影响了疗效(见Rosenberg et al.，N.Engl.J.Med.3191676-1680(1988)；Maas，Immunobiolgy 188281-292(1993))。因此，针对IL-2在肿瘤治疗中的主要努力已经集中于对副作用和有效剂量进行平衡之上，即，增强被用于给药的IL-2的特异性(将IL-2精确地靶向于肿瘤位点)从而明显地降低由高全身剂量而引起的副作用。
Forni G.，et al.，Immunol.1384033-4041(1987)证实了生理剂量的IL-2向肿瘤的直接注射导致了该肿瘤生长的抑制。这一原位应用的主要优点在于其降低了细胞因子的全身使用所带来的毒性，但是该应用具有需要了解所有肿瘤的确切位置的缺点，该缺点在患有广泛转移的患者身上特别成问题。
降低毒性的进一步努力已经证明，以被转染的可分泌IL-2的肿瘤细胞进行的注射可诱导针对未修饰的肿瘤细胞的特异的T细胞依赖性免疫，如Gansbacher et al.，J.Exp.Med.1721217-1224(1990)；Fearon et al.，Cell 60397-403(1990)；以及Pardoll，D.M.，Immun Today 14310-316(1993)。然而，Reisfeld etal.，Curr，Top.Microbiol Immunol.21327-53(1996)中指出，该方法的临床应用既耗时又昂贵，这是因为该方法涉及到对患者的肿瘤细胞的分离、转染和重新给药。
最近引入了一种利用抗肿瘤单克隆抗体(mAb)的结合特异性以将细胞因子靶向于肿瘤位点的替代方法。见上文提及的Reisfeld etal(1996)的文献。该方法综合了mAb的独特的靶向能力以及细胞因子的多功能活性并因此而在肿瘤微环境中获得了IL-2的一种有效浓度。靶向的IL-2疗法可在具免疫力的同基因小鼠中完全消除播散性肺部和肝脏鼠黑色素瘤转移，如Gillies et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891428-1432(1992)；以及Sabzevari et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919626-9630(1994)。
这一靶向IL-2疗法具有一些优点。例如，由于该疗法并非直接细胞毒反应，因此该疗法并不像其它mAb靶向方法那样需要mAb-IL-2融合蛋白接触所有的靶细胞从而获得最大效果。见上文提及的Reisfeldet al(1996)的文献。最重要的是，靶向IL-2疗法的疗效相关于一种长期的并且可转移的保护性肿瘤免疫的诱导。由于该疗法在肿瘤环境中对IL-2进行浓缩，这一mAb靶向的IL-2疗法还有别于细胞因子基因来自体内的转移，并且比其具有优势，这使得该方法更具有临床可行性。
尽管该靶向免疫疗法在癌症治疗中显示出前景，对抗PRL的效果和靶向IL-2进行组合的治疗优点在癌症治疗中尚属未知。因此，对开发药剂和疗法来用于对PRL在癌症维持或者增殖中的作用进行对抗的同时增强该患者对癌症的免疫反应的需要是存在的并且尚未满足。
发明概要因此，本发明的一个目的在于提供一种药物，该药物能够干扰癌细胞中的促乳素信号传递机制。
本发明的另一个目的在于提供一种药物以在癌细胞中诱导细胞凋亡。
本发明的一个进一步的目的在于提供一种药物，该药物含有一种受体拮抗结构域以及一种正免疫调节结构域。
本发明的另一个目的在于提供一种方法以治疗患有癌症的患者，该治疗通过在拮抗存在于一种靶癌细胞的上的受体的同时增强该患者对癌症的免疫反应而进行。
本发明的另一目的是提供一种通过使用此处描述的药物来治疗癌症的方法。
这些和其他通过阅读以下的披露而更加明晰的目的已经可以通过本发明而达到。
在组合物方面，本发明基本涉及到一种蛋白质，该蛋白质含有一种受体拮抗结构域以及一种正免疫调节剂结构域。本发明进一步提供，该受体拮抗结构域可以为一种促进细胞凋亡的结构域，而该正免疫调节剂结构域可为一种白细胞介素。该受体拮抗区域还可以为SEQID NO1的氨基酸序列或者其保守变体。
在方法学方面，本发明涉及到一种用于治疗癌症的方法，该方法包括以一种有效量的蛋白质进行给药，该蛋白质具有一种受体拮抗结构域以及一种正免疫调节剂结构域。本发明进一步提供了一种方法学，该方法学用于以本文所描述的任何蛋白质来对患者给药附图简述

图1为本发明的双功能分子的一个图示。(A)上文提及的Reisfeld等人(1996)的文献中提出的mAb-IL-2融合蛋白模型，以及(B)本发明的hPRLA-IL-2融合蛋白。
图2为本发明的双功能融合蛋白的一个被提出的作用机制的图示。由乳腺癌细胞所产生的PRL由于融合蛋白(PRLA)的占据而受阻不能接触PRLR。同时，该融合蛋白的IL-2部分刺激了抗肿瘤T细胞反应。
图3所示为在T-47D人类乳腺癌细胞中的hPR1-G129R的反应于剂量的抑制效果以及hPRL的刺激效果，该实验使用共培养方法。x轴为共培养的L细胞(对照、L-PRL或者L-hPRL-G129R细胞)数。各数据点为至少3份孔中的3组独立实验的平均。
图4所示为hPRL-G129R在T-47D人类乳腺癌细胞增殖分析中的反应于剂量的抑制效果及其对4-羟基-他莫昔芬的添加效果。x轴为在不存在(空白条)和存在4-羟基-他莫昔芬下的hPRL-G129R浓度。各数据点为至少3个孔中的3组独立实验的平均。
图5为pUCIG-MT-hPRL-IL-2融合蛋白cDNA的表达质粒的克隆和构建的图示。
优选实施方案的详述本发明的发明者已经发现，基于内分泌的疗法和靶向性细胞因子的疗法的组合效果极大地加强了对癌症的治疗。例如，本文所披露的治疗产品和方法作用于通过阻断PRLR来抑制内源PRL的自分泌/旁分泌效应，这在典型的情况下导致细胞凋亡。另外，该方法正调节了一种免疫反应，由此而在恶性组织中特异地诱导了肿瘤特异的T淋巴细胞的细胞毒作用。
本文所使用的“细胞凋亡”指的是一种过程，通过该过程，发育或者环境的刺激激活了一种遗传程序从而实现一系列特异性的事件，这些事件最后结束于细胞的死亡以及有效地清除。该细胞中的形态学变化包括细胞体积的显著皱缩，伴随有内质网的膨胀以及质膜的卷叠。随后，这导致该细胞破碎成为一系列的膜包围的小体，该小体含有结构上正常然而却是紧密的细胞器。该细胞核经过了不连续的染色质浓缩并且进行了核酸酶介导的DNA片段化，这样将染色体DNA降解成为小的寡核小体片段。细胞核和细胞质进行浓缩并且濒死的细胞最终碎片化成为膜结合的细胞凋亡小体，该小体被巨噬细胞或者邻近的细胞迅速地吞噬并且消化。
本发明通过利用一种多结构域的分子对阻断PRLR的优点和免疫反应正调节的优点进行了综合，该分子的各结构域都具有实施这些功能的其中一种的能力。典型的分子具有一种“受体拮抗结构域”或者一种“细胞凋亡促进结构域”，该结构域同一种“正免疫调节剂结构域”相结合。
本文所使用的“受体拮抗结构域”为一种配体，该配体同一种受体特异地结合，该受体相关于一种疾病，如癌症，通过结合于该受体，该受体拮抗的结构域作用于抑制一种或者多种细胞进程，由此干扰了该疾病的发生或者维持。这样的一个诱导细胞凋亡的结构域在本文称为“细胞凋亡促进结构域”，而“正免疫调节剂结构域”为一种增强免疫反应的结构域，在优选的情况下增强针对诸如癌细胞这样的异常细胞的免疫反应。这样的一种免疫反应在典型的情况下涉及到募集T细胞并且加强其功能，例如细胞毒功能。
具有这些特征的一种融合蛋白的优点众多。例如，致癌组织通常的特征在于一种或者多种蛋白受体水平的提高。含有对这些受体之一具有特异性的结构域的融合蛋白将能够被特异地定向于该癌组织。当该受体拮抗结构域如同一种细胞凋亡促进结构域一样破坏该癌症的发生或者破坏癌症的维持情况下，该分子的受体拮抗部分具有直接治疗效果。另外，由于该正免疫调节剂结构域的存在，该分子通过诱导该患者特异针对该疾病组织进行应答的自体免疫系统而具有了第二种疗效。
因此，接受本发明的疗法的候选对象包括患有恶性肿瘤的个体，这些恶性肿瘤的特征在于至少存在一种与肿瘤的维持或者增殖相关的受体。在一个优选的实施方案中，该融合蛋白的受体拮抗结构域为一种细胞凋亡促进结构域，该结构域同一种被靶定的膜结合受体相结合。这样的结合诱导了细胞凋亡；同时，该正免疫调节剂结构域诱导了对T淋巴细胞细胞毒作用的肿瘤特异的募集作用以及加强。本发明的双功能蛋白质本发明考虑了一些双功能蛋白质，这些双功能蛋白对于恶性组织具有独特的双重治疗效果，即(a)受体拮抗的和/或细胞凋亡促进(这些可以是同一种功能)以及(b)正免疫调节。本发明还考虑一些编码本发明的双功能蛋白质的核酸(例如DNA或者RNA)。受体拮抗结构域本发明设计了第一种结构域，该结构域在一方面可以将该正免疫调节剂结构域的作用定位于病变组织。例如，致癌组织的特征通常在于一种或者多种蛋白质受体水平的提高。含有对于这些受体之一具有特异性的结构域的融合蛋白将能够特异地靶向于该癌组织，结果导致一种针对被靶定的组织的定位肿瘤细胞毒反应。
在一个实施方案中，靶向于一种特定的受体位点的结构域为一种受体拮抗结构域，该结构域顾名思义结合并且拮抗其相关受体。在一个优选的实施方案中，该受体拮抗结构域为一种细胞凋亡促进结构域。这一利用了一种受体拮抗结构域的靶向治疗方法经设计用于提供正免疫调节剂结构域(如LL-2)的显著降低的全身浓度，由此而降低了其在体内的毒性。
这一双功能分子的额外的治疗优点在于该受体拮抗结构域在典型的情况下具有内分泌阻断能力。由此，当该受体拮抗结构域为一种促乳素拮抗剂时，促乳素的正常内分泌功能将被破坏。对于促乳素及其类似分子，该内分泌阻断的结果为，例如，导致其所靶定细胞的细胞凋亡。在该情况下，该受体拮抗结构域也是一种细胞凋亡促进结构域。
对于细胞凋亡促进结构域，这样的一种结构域通常通过产生一种细胞组分的正常功能的拮抗剂来进行设计，该细胞组分参与细胞凋亡的阻止。例如，在乳腺和前列腺组织中，癌发生和恶性细胞的增殖至少在部分上受到PRLP水平的提高的刺激。经过PRLR的信号传递已知由促乳素受体的二聚化所介导，该受体的二聚化本身受到结合受体的促乳素分子的二聚化所介导。内源PRL同两个PRLR的结合诱导了PRLR的二聚化，由此而引发了信号向癌细胞内的转导。因此，本发明的一个实施方案需要使用一种促乳素拮抗剂(PRLA)(即，一种促乳素拮抗剂结构域)来拮抗促乳素的正常的细胞凋亡抑制功能。
PRLR信号传递途径中的信号转导涉及到转录的信号转导物及激活剂(STAT)的磷酸化，这是PRLR激动的正常结果。因此，G129R拮抗剂通过抑制STAT5磷酸化而在人类乳腺癌细胞中促进凋亡。因此，对PRLR的阻断抑制了内源PRL的涉及到STAT5的自分泌/旁分泌效应并且导致了细胞凋亡。由此，本发明所设计的一种类型的细胞凋亡促进化合物为一种可抑制STAT5磷酸化的化合物。
本发明所设计的一种适当的PRLR通常应保持对PRLR的特异结合特性，还应具备一些结构上的缺陷，该缺陷破坏了正常的PRL细胞凋亡阻断机制。这样的一种结构缺陷包括了破坏PRL二聚化(从而破坏PRLR二聚化)的缺陷。
在一个优选的实施方案中，如SEQ ID NO1所示，这一结构缺陷为对应于hPRL的129位上的Arg对Gly的取代(称之为hPRL-G129R)。图3和4以及实施例4、5和6中的基于细胞的分析显示，这一突变hPRL作为一种真正的hPRLR拮抗剂发挥作用。因此，诸如hPRL-G129R这样的一种受体拮抗结构域可作为一种治疗特定类型的癌症的治疗药物来发挥作用。
本实施方案为Chen et al.，Clin.Can.Res.53583-93(1999)所支持，他们披露了在PRL的第三个α-螺旋区域中的氨基酸序列的种间比较，见表1。
表1物种 结构域 肽序列 129肽序列人类 PRL IEEQTKRLLR G MELIVS-QVHP大鼠 PRL IEEQNKRLLE G IEKIIG-QAYP小鼠 PRL IEEQNKQLLE G VEKIIS-QAYP仓鼠 PRL IGEQNKRLLE G IEKILG-QAYP长须鲸 PRL EEEENKRLLE G MEKIVG-QVHP貂 PRL IEEENRRLLE G MEKIVG-QVHP牛 PRL IEEQNKRLIE G MEMIFG-QVIP羊 PRL EEEENKRLLE G MENIFG-QVIP猪 PRL IEEQNKRLLE G MEKIVG-QVHP骆驼 PRL IEEQNKRLLE G MEKIVG-QVHP马 PRL EIEQNRRLLE G MEKIVG-QVQP象 PRL VKEENQRLLE G IEKIVD-QVHP原始哺乳类 PRL IEEENKRLLE G MEKIVG-QVHP鸡 PRL IEEQNKRLLE G MEKIVG-RVHS火鸡 PRL IEEQDKRLLE G MEKIVG-RIHS海龟 PRL IEEQNKRLLE G MEKIVG-QVHP鳄鱼 PRL IEEQNKRLLE G MEKIIG-RVQP短吻鳄 PRL IEEQNKRLLE G MEKVIG-RVQP原始羊膜动物 PRL IEEQNKRLLE G MEKIVG-QVHP爪蟾 PRL VEEQNKRLLE G MEKIVG-RIHP牛蛙 PRL VEEQTKRLLE G MERIIG-RIQP肺鱼 PRL VEDQTKQLIE G MEKILS-RMHP罗非鱼 PRL MQQYSKSLKD G LD-VLSSKMGS罗非鱼 PRL MQEHSKDLKD G LD-ILSSKMGP鲤鱼 PRL LQENINSLGA G LEHVF-NKMDSbighead carp PRL LQDNINSLGA G LERVV-HKMGS银鲤 PRL LQDNINSLVP G LEHVV-HKMGS马苏大麻哈鱼 PRL LQDYSKSLGD G LD-IMVNKMGP大鳞大麻哈鱼 PRL LQDYSKSLGD G LD-IMVNKMGP鳟鱼 PRL LQDYSKSLGD G LD-IMVNKMGP物种 结构域 肽序列 120肽序列人类 GH VYDLLKDLEE G IQTLMRELEDG牛 GH VYEKLKDLEE G ILALMRELEDG根据表1，很清楚hPRL的Gly129在PRL中是不可变的，这暗示了该氨基酸在其功能中的一种重要作用。因此，将Gly129取代为任何氨基酸将在这些物种中产生PRLA(Chen et al.，Molec.Endocrinol.(1995))。在一个实施方案中，通过以相对较大侧链的氨基酸进行取代而产生了一种拮抗剂，例如以Arg取代Gly129。因此，本发明的一个方面设计了PRL的保守变体，该PRL的特征为在特定位置上存在一种相对较小的侧链氨基酸(例如Gly)，这样使以一种较大侧链的氨基酸对该小侧链氨基酸进行的取代将导致该蛋白质的一种拮抗形式。
本发明的受体拮抗结构域还包括本文所讨论的受体拮抗结构域的保守变体。在这一方面，本发明结构域的总体结构和组成仅仅在于其产生了适当的功能特征才是重要的，即，受体拮抗性、细胞凋亡的诱导、正免疫调节。
本发明的保守变体一般在该蛋白质结构域的整体分子结构上是保守的。如果已知包括被披露的蛋白质产品的个体氨基酸的特征，一些合理的取代将是很明显的。例如，氨基酸取代，即“保守取代”可根据所涉及的残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或双亲性质上的相似性而产生。
例如(a)非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸；(b)极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸(d)负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在典型的情况下取代在(a)-(d)的组内进行。另外，甘氨酸和脯氨酸由于其破坏α-螺旋的能力而可以互相取代。类似地，特定的氨基酸，例如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸常见于α-螺旋内，而缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及苏氨酸通常见于β-折叠内。甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺以及脯氨酸常见于转角内。一些优选的取代可在以下组间进行(i)S和T；(ii)P和G；(iii)A、V、L和I。如果已知遗传密码以及重组和合成DNA技术，技术人员可容易地构建编码该保守氨基酸变体的DNA。
这些保守变体在具体情况下设计有对在此描述的受体拮抗结构域进行的截短。截短可在N-或者C-末端进行，但通常不要删除该天然分子的约30％以上。更优选的情况下该天然分子的低于约20％被删除，最优选的情况下低于约10％的部分被删除。
通常情况下，本发明的DNA和蛋白质均可以参照“序列同一性”进行限定。一些分子具有至少约50％、55％或者60％的同一性。优选的分子为那些具有至少约65％的序列同一性的分子，更优选的情况下具有至少约65％或者70％的序列同一性。其它的优选分子具有至少约80％的序列同一性，更优选的情况下具有至少80％或者85％的序列同一性。特别优选的分子具有至少约90％的序列同一性，更优选的情况下具有至少90％的序列同一性。最优选的分子具有至少约95％的序列同一性，更优选的情况下具有至少95％的序列同一性。如本文所使用，两种核酸分子或者蛋白质在两者含有具备高于85％的序列(氨基酸或者核酸)同一性的区域的情况下被称为“具有明显的序列同一性”。
“序列同一性”在本文参照Blast2算法使用缺省参数(Blast2algorithm)进行定义，该算法可见于NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。与该算法相关的参考文献有可见于http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_references.html的文献；Altshchul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.&Lipman，D.J.(1990)“Basic local alignment search tool.”J.Mol.Biol.215403-410；Gish，W.& States，D.J.(1993)“Identication of protein coding regions by databasesimilarity search.”Nature Genet.3266-272；Madden，T.L.，Tatusov，R.L.& Zhang，J.(1996)“Application of network BLASTserver”Meth.Enzymol.266131-141；Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schffer A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)“Gapped BLAST and PSI-BLASTa new generation ofprotein database search programs.”Nuleic Acids Res.253389-3402；以及Zhang，J.& Madden，T.L.(1997)“PowerBLASTa new network application for interactive or automatedsequence analysis and annotation.”Genome Res.7649-656。因此，包括表1所列出的来自不同物种的促乳素肽序列可使用诸如BLAST这样的标准计算机程序进行比对以获知在促乳素衍生的受体拮抗结构域中的进一步的变异，这些变异保存了该结构域的基本功能。
除本文所披露的保守变体蛋白之外，本发明还规划了一些蛋白质的用途，这些蛋白质在诱导肿瘤增殖中起着重要的作用，在其中一个氨基酸的取代将抑制该蛋白质诱导这种增殖的能力。例如，牛生长激素(bGH)和hGH的Gly119和Gly120分别在GH的刺激生长增强的作用中扮演重要的角色。生长激素受体(GHR)的二聚化被认为是HG信号转导的关键一步。因此，在这些位点上的任何氨基酸的取代(除丙氨酸之外)，特别是诸如Arg这样的具有较大侧链的氨基酸的取代将阻止受体的二聚化，结果产生了一种生长激素的拮抗物(GHA)。因此，诸如GHA这样的拮抗物也被本发明所考虑到。
除了拮抗一种参与防止细胞凋亡的细胞组分的正常功能之外，本发明进一步在细胞凋亡促进结构域范围内设想了一些通过正性方法诱导细胞凋亡的试剂。这些试剂并不是通过对一种抗细胞凋亡的途径进行拮抗而发挥作用；而是诱导某种细胞凋亡途径。这样的作用物的例子包括蛋白激酶C(PKC)抑制剂，包括白屈菜红碱。
苯菲啶生物碱白屈菜红碱(1，2-二甲氧基-12-甲基[1，3]benzodioxolo[5，6-c]phenanthridinium；C21H18NO4)，亦称白屈菜赤碱，可以从白屈菜，野花椒，Sanguinaria candensis(或bloodroot)，博落回，Carydali sevctocozii，Carydali ledebouni，Chelidonium ma jusm以及罂粟科的其它成员中以纯净物的形式或者以同其它苯菲啶生物碱的混合物形式提取。
PKC的抑制剂可同底物结合位点(ATP或者蛋白质)或者发生激活的调节结构域(二酰基甘油或者佛波酯结合位点)进行结合。白屈菜红碱直接同PKC的催化结构域相作用。它是PKC的已鉴定的最强力的抑制剂之一并且对任何其它蛋白抑制剂均不表现出抑制作用。例如，白屈菜红碱对L-1210肿瘤细胞通过抑制细胞生长和分化而表现出强的细胞毒效应，其IC50值为0.053μm，如Herbert et al.，Bioechem.Biophys.Res.Commun.172993(1990)中的讨论。白屈菜红碱通过以依赖于浓度的方式特异地抑制PKC并且强烈地抑制由诸如花生四烯酸和胶原蛋白所诱导的血小板聚集。
由此，通过引入于肿瘤细胞，白屈菜红碱氯化物可降低细胞凋亡的阈值并且在该处引发细胞凋亡。在当白屈菜红碱疗法同其它治疗方法联合使用时这一效果特别属实。因此，本发明设计了一种融合分子，该融合分子包含有白屈菜红碱，该白屈菜红碱融合于另一种用于抗癌的分子，例如一种正免疫调节剂结构域。一种含有白屈菜红碱的分子可以通过化学方法，例如使用多功能交联剂同另一种分子(即，本文所描述的结构域)进行融合。基于蛋白质的PKC抑制剂可被制成为融合蛋白质。正免疫调节剂结构域本发明还设计了一种另外的而且是分离的结构域，该结构域作为一种正免疫调节剂而发挥作用。优选的免疫调节剂结构域支持针对肿瘤的阳性免疫反应。一种合适的正免疫调节剂包括一种细胞因子，该因子向该肿瘤进行T淋巴细胞的募集，由此而在该恶性组织中诱导了肿瘤特异的T淋巴细胞的细胞毒作用。在一个优选的实施方案中，该正免疫调节剂为IL-2，该免疫调节剂的特征在于其控制T细胞依赖性的免疫反应的强度的能力。IL-2对于巨噬细胞和单核细胞同样具有活性。另外，IL-2刺激自然杀伤(NK)细胞的生长并且增强其溶细胞效能。
除IL-2外。本发明还考虑了其它的具有这些或者类似特征的分子，包括其它的细胞因子。例如，IL-12可作为该正免疫调节剂结构域。IL-12对于介导T细胞对Th1类型的反应是一种关键性的细胞因子。IL-2由B细胞和单核/巨噬细胞所产生并且同IL-2协同作用以诱导T细胞和NK细胞产生IFNγ。它还增强了T细胞和NK细胞的细胞毒作用。本发明还包括上述正免疫调节剂结构域的保守变体(如上文所详述)。
用于该正免疫调节剂结构域的其它合适的备选物包括干扰素(IFN)。例如，已知IFN-β可单独抑制肿瘤细胞增殖。IFN-β对于巨噬细胞抗肿瘤活性是一种通用激活物。因此，一种含有同细胞凋亡促进结构域相结合的IFN-β将对靶定组织提供局部化的正免疫调节治疗。示例性的双功能分子的制备本发明所设想的双功能蛋白质为一种含有上述的各个结构域的蛋白质，即含有受体拮抗(还可以促进细胞凋亡)结构域和正免疫调节结构域，通过这样的融合，两结构域均基本维持了其相关的特征而独立于对方。根据这些特征，图2披露了本发明的一种实施方案。尽管在典型的情况下以融合蛋白的形式产生，这些结构域也可通过传统的化学方法进行融合，例如使用多功能交联剂。在制备这些融合蛋白时，两个结构域均可被置于对方的C-末端或者N-末端。
在一个实施方案中，该融合蛋白质为一种hPRLA-IL-2蛋白，如图1所示。该融合蛋白质可被整合入一种表达载体，如实施例1和图5所示。所产生的表达载体可随后被转染入一种稳定的细胞系以随后产生一种纯化蛋白。实施例2和3为实施该载体的转化和纯化过程的一种非限定的程序。该融合蛋白将PRLA的C-末端融合入IL-2的N-末端，该蛋白质在图5中显示。然而，本发明还设想了任何具有本文所描述的结构域的融合蛋白质。
用于产生该融合蛋白质的适当的方法应该是一种基本上不改变这些结构域的生物学活性的方法。例如，已经表明IL-2的N-末端同一种抗体的C-末端的融合并不改变IL-2的生物学活性，见上文提及的Reisfeld等人(1996)的文献。因此，一种类似的策略可经调整以适合于产生本发明的融合蛋白质。该过程包括设计一种编码融合蛋白质的cDNA，该蛋白质将该正免疫调节剂结构域的N-末端同该受体拮抗结构域的C-末端相连接。
有证据进一步表明hGH的C-末端(我们删除了最多达10个氨基酸)对于其在转基因小鼠中的生长促进活性并不重要(Chen等人，1993)，并且根据结构相似性，一种正调节剂同诸如hPRLA这样的其它受体拮抗结构域的C-末端的融合不应改变这些结构域的结合亲和性。
本发明并不限于在此所考虑的任何用于产生所需融合蛋白质的特定方法。但是，根据所考虑的生产的重组方法，本发明提供了重组DNA构建体，该构建体含有一种或者多种本发明所描述的结构域的核苷酸序列。本发明的重组构建体包括一种载体，例如一种质粒或者病毒载体，在其中以任意方向插入有一种DNA或者DNA片段，在典型的情况下该DNA或DNA片段带有一种开放读码框架。本发明进一步考虑了含有这些载体的细胞。
重组蛋白质的生产在该领域是众所周知的并且在下文简述。细菌表达用于细菌的有用的表达载体通过将一种编码所需蛋白质的结构DNA序列同功能性的启动子插入而构建，该结构DNA同适当的翻译起始和终止信号一起处于可操作的读码状态中。该载体应含有一种或者多种表型选择标记以及一个复制起点以确保该载体的在宿主中的维持并且在需要时提供在其中的扩增。用于转化的适当的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、伤寒沙门氏菌以及假单胞菌属、链球菌属以及葡萄球菌属中的多个菌种，尽管出于选择的问题其它菌种可能也被使用。在优选的实施方案中，该原核宿主为大肠杆菌。
细菌载体可以是，例如，基于细菌噬菌体、质粒或者粘粒的载体。这些载体可含有一种选择标记以及细菌复制起点，它们来自于商业化的质粒，这些商业化的质粒在典型情况下包括著名的载体pBR322(ATCC37017)。这样的商业载体包括，例如，GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)、pBs、phagescfipt、PsiX174、pBluescriptSK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Statagene)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pKK232-8、pDR540以及pRIT5(Parmacia)。本发明的一种优选的载体为THE Pt71表达载体(Paris et al.，Biotechol.Appl.Biochem.12436-449(1990))。
这些“骨架”部分同一种适当的启动子以及待表达的结构序列进行结合。细菌启动子包括lac、T3、T7、lambda PR或者PL、trp以及ara。T7为优选的细菌启动子。
在对某种适当的宿主菌株进行转化并且该宿主菌株生长至适宜的细胞密度后之后通过适当的手段对该被选中的启动子进行去抑制/诱导(例如，温度改变或者化学诱导)，并且将这些细胞进行额外的培养。一般通过离心来收集这些细胞，以物理或者化学方法进行破碎并且保留所产生的粗抽提物以用于进一步的纯化。真核表达多种哺乳动物细胞培养系统也可被用于表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的例子包括经选择的小鼠L细胞，例如胸腺嘧啶核苷激酶缺陷(TK)以及腺苷磷酸核糖转移酶缺陷(APRT)细胞。其它的例子包括猴肾成纤维细胞COS-7细胞系，该细胞系由Gluzman，Cell 23175(1981)所描述，还包括其它能够表达可相容载体的细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa以及BHK细胞系。哺乳动物表达载体应包括一个复制起点、一个适当的启动子以及增强子，并且还应包括任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列以及5’侧翼非转录序列。来源于SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子，增强子，剪接体以及聚腺苷酸化位点可被用于提供所需的非转录遗传元件。
哺乳动物启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、来自于逆转录病毒的LTR以及小鼠金属硫蛋白-I启动子。示例性的哺乳动物载体包括pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG以及pSVL(Pharmacia)。在一个优选的实施方案中，该哺乳动物表达载体为pUCIG-MET。选择标记包括CAT(氯霉素转移酶)。
在哺乳动物宿主细胞中可以使用一些基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为一种表达载体的情况下，该目的编码序列可被连接于一种腺病毒转录/翻译控制复合体，例如晚期启动子和三联前导序列。这一嵌合基因可随后通过体外或者体内重组而被插入腺病毒基因组。在该病毒基因组的非关键区域(例如，区域E1或者E3)中的插入将产生一种重组病毒，该重组病毒可以存活并且在被感染的宿主中表达一种靶蛋白。(例见Logan et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA813655-3659)。治疗组合物本发明的蛋白质可根据已知的方法进行制剂化以制备成可用于医药的组合物，由此本发明的分子或其功能衍生物同一种药学可接受的载体介质组合成混合物。包括诸如人类血清白蛋白这样的其它人类蛋白在内的适当的介质及其制剂，在诸如Remington’s PharmaceuticalSciences(16thed.，Osol，A.，Ed.，Mack，Easton PA(1980))这样的书籍中有所描述。为形成一种适于有效给药的药学可接受的组合物，这样的组合物中应含有一种或者多种有效量的本发明的蛋白质，以及一种适量的载体介质。
用于本发明的药物组合物可以通过传统方式使用一种或者多种生理可接受的载体或者赋形剂进行制剂化。由此，该双功能分子及其生理可接受的盐和溶剂化物可经制剂化，以用于吸入或者吹入(通过口腔或者鼻腔)或者口服、经颊、肠外或者直肠给药。
对于口服给药，该药物组合物可通过传统方法同药学可接受的赋形剂制成诸如药片或者胶囊这样的形式，该赋形剂的例子如粘合剂(如，预胶凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或者羟丙基甲基纤维素)；填充物(如乳糖、微晶纤维素或者磷酸氢钙)；润滑剂(如，硬脂酸镁、滑石粉或者二氧化硅)；崩解剂(如，马铃薯淀粉或者淀粉羟乙酸钠(sodium starch glycolate))；或者湿润剂(如月桂基硫酸钠)。该药片可通过本领域所已知的方法进行包被。用于口服给药的液体制剂可以制成诸如溶液、糖浆或者悬浮物这样的形式，或者它们可以是以水或者其它适当的介质在使用前进行构造的干态产品。这样的液体制剂可通过传统方法药学可接受的添加剂进行制备，该添加剂的例子如悬浮剂(如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或者氢化食用脂肪)；乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯树胶)；无水载体(如杏仁油、油性酯、乙醇或者分馏植物油)；以及防腐剂(如甲基或者丙基-对-羟基苯甲酸盐或者山梨酸)。这些制剂在适当的情况下还可以含有缓冲盐、调味剂、着色剂以及甜味剂。
用于口服给药的制剂可经过适当地制剂化以提供活性化合物的控制释放。对于经颊给药，该组合物可以药片或者锭剂的形式通过传统方式制剂化。
对于吸入给药，用于本发明的应用的双功能分子可以以一种气溶胶喷雾的形式进行方便地递送，该气溶胶喷雾是通过使用适当的推进剂由气溶胶包或一种喷雾器而产生，该推进剂的例子如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或者其它适当的气体。对于压缩气溶胶，该剂量单位可通过提供一种阀门来测定，以此递送经测定的药量。用于吸入器或者吹入器的诸如凝胶这样的物质的胶囊或者药筒可经制剂化而含有该化合物同一种适当的粉基的粉状混合物，该粉基的例子如乳糖或者淀粉。
该双功能蛋白质可经制剂化以用于通过注射进行的肠外给药，例如通过丸剂注射或者连续输注。用于注射的制剂可以为含有添加的防腐剂的单位剂量形式，该制剂处于诸如安瓿瓶或者多剂量容器这样的容器中。该组合物可以为处于水相或者油相载体中的悬浮液、溶液或者乳剂形式，并且可含有制剂化物(formulatory agent)，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，该活性成分可以为一种用于在使用前以适当的介质进行构建的粉末，适当的介质的例子如无菌的无致热源水。
这些化合物还可被制剂化于诸如栓剂或者保留灌肠剂这样的直肠给药组合物中，例如，含有诸如可可油或者甘油酯这样的传统栓剂基的保留灌肠剂。
除上文所描述的制剂外，该双功能分子还包括还可被制剂化为一种贮存制剂。这样的长期作用制剂可通过植入(例如皮下植入或者肌内植入)或者通过肌内注射来进行给药。由此，例如，该化合物可以以适当的聚合物或者疏水材料(例如一种可接受的油中的一种乳剂)或者离子交换树脂进行制剂化，或者制剂化成为微溶的衍生物，例如微溶的盐类。
如果需要，该组合物可以处于一种药囊或者分散器设备中，这些容器可含有一个或者多个含活性成分的单位剂型。该药囊可含有金属或者塑料箔，例如一种泡状药囊(blister pack)。该药囊或者分散器设备可附带有给药的说明。
由于这些组合物可用于癌症治疗，它们可以连同传统的化疗剂一起进行制剂化。传统的化疗剂包括烷化剂、抗代谢物、多种天然产品(例如，长春碱类、表鬼臼毒素、抗生素以及氨基酸缺失的酶)、激素以及激素拮抗剂。药剂的具体类别包括氮芥、烷基磺酸盐、亚硝脲、三氮烯、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂复合物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质激素、孕酮、雌激素、抗雌激素和雄激素。一些示例性的化合物包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、硫鸟嘌呤、长春花碱、长春新碱、阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素、顺铂、羟基脲、强的松龙、己酸羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、二乙基己烯雌酚、乙炔基雌二醇、他莫西芬、丙酸睾丸酮以及氟羟甲睾酮。在治疗乳腺癌中，例如，他莫西芬特别地优选。发明方法治疗方法本发明的治疗方法通常使用了上文所确定的双功能蛋白质。该融合蛋白质的结构域共享了特异地靶向于一种特定组织以及/或者增强一种针对该靶定组织的免疫反应的能力。因此，一种典型的方法涉及到将某种靶定细胞的一种受体结合于该融合蛋白的受体拮抗结构域并且/或者通过该正免疫调节剂结构域刺激一种T细胞依赖性的免疫反应。
治疗方法涉及到以一种治疗有效量的融合蛋白质对需要治疗的对象进行给药。“治疗有效”在此被用于表示融合蛋白质在量上足以抑制或者逆转癌的生长(例如，诱导细胞凋亡)。一些方法设计了结合已知的癌症药物或者诸如化疗(在优选的情况下使用上文列出的种类的化合物)和放疗这样的疗法而进行的综合治疗。该患者可以为分类或者非人类动物。一名患者在典型的情况下当患有一种癌症时需要治疗，该癌症的特征在于促进癌症维持或者增殖的受体水平的提高。
在体内治疗期间进行的给药可通过任意数量的途径进行，包括肠外或者口服，但优选的为肠外给药。可以使用囊内、静脉内、鞘内以及腹膜内给药途径，通常静脉内途径是优选的。技术人员将会认同给药途径应当根据待治疗的疾病而变化。
根据本发明，对该双功能蛋白质的治疗有效量的确定大体上应根据特定的患者特征、给药途径、以及待处理的疾病的特性。一般性的指导可见于Harmonisation的国际会议的出版物以及REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第27和28章，pp.484-528(MackPublishing Company 1990)。
具体确定一种治疗有效量应根据诸如药物的毒性和效力这样的因素进行。毒性可使用该领域所熟知的方法进行测定，该测定可见于上文的参考文献。效力使用同样的说明，联合下文实施例所描述的方法进行测定。因此，药学有效量为一种被临床医生认为在毒性上是可耐受的并且还是有效的药量。例如，可通过对该靶定组织中的T淋巴细胞毒性的诱导或者实质上的诱导或者通过该靶定组织的在量上的减少来测量效力。适宜的剂量可能从约1mg/kg到10mg/kg。用于测定该融合蛋白质的生物活性的筛选分析本发明还提供了基于细胞的分析系统，该分析系统可被用于对该细胞凋亡促进结构域、正免疫调节结构域以及/或者含有这两种区域的融合蛋白的生物活性进行比较。为此目的，使用一种细胞增殖分析以确保该融合蛋白的各融合区域均保持了类似于各结构域在未被融合时(即，不是融合蛋白的一个部分时)的功能。
在一个实施方案中，该融合蛋白的生物活性将通过将该蛋白体外引入两种类型的细胞系而进行测定每个细胞系分别测定一个具体结构域的活性。例如，一种为细胞凋亡促进结构域的可靠指示剂的细胞系应当被用以检测该结构域的作用，而一种能够显示出正免疫调节结构域的细胞系应被用于监测另一种结构域的活性。
通过向一种细胞系引入一种特定结构域的不同浓度的被拮抗、非拮抗以及融合形式，本领域的技术人员能够测定该融合蛋白的细胞凋亡促进结构域的同未融合的相同结构域相比较的生物活性。测定细胞凋亡有多种途径。这些方法包括以下技术，但并不限于这些(1)细胞生存力丧失-通过不能排除活体染料或者吸收MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-溴化二苯基四唑鎓)或者MTS-PMS来进行检测；(2)DNA碎片化-通过琼脂糖凝胶电泳、PFG电泳、原位末端转移酶标记(TUNEL)进行分析；细胞和核形态学-使用显微镜以观察染色质浓缩、DNA组织以及细胞质完整性；以及半胱氨酸蛋白酶激活分析-凋亡酶(caspase)激活分析，该分析联合以通过蛋白印迹或者免疫组织化学而进行的比色或者荧光数值分析、多聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)或者层粘连蛋白切割。使用了人类乳腺癌细胞系(T-47D)的实施例4和9提供了可在该程度上被接受的分析系统的非限定的例子。
类似地，一种能够测量该正免疫调节结构域的细胞系应当被类似地用于监测该融合蛋白的这一结构域的活性。使用了一种鼠细胞系(HT-2)的实施例9是一种用于测定融合蛋白中的正免疫调节结构域的生物活性的可行但非限定性的方法。
用于测定本发明的融合蛋白质活性的另一种优选方法为体内的行为检测。用于该检测的一种适当的宿主应为一种含有癌组织的哺乳动物宿主，该癌组织能够同该细胞凋亡促进结构域相结合。一种适当的对照可以为一些细胞系，这些细胞系的特征在于没有或者鲜有该被选中的细胞凋亡促进结构域的受体位点。实施例10提供了一种使用小鼠细胞进行体内研究的非限定性的例子。
下文的实施例应当为示例性的而非限定性的实施例实施例1表达质粒pUCIG-MT-Hprla-IL2融合蛋白cDNA的克隆和构建分别对来自于hPRLA cDNA(从限制性酶切位点XbaI刚好到该序列的转录终止密码子之前)和从氨基酸序列+1位点到转录终止密码子的IL-2cDNA(购自ATCC)的PCR片段进行了扩增。接下来，将这些片段连接入哺乳动物表达载体pUCIG-MET以产生一种整合入这些片段的表达载体(即，pUCIG-MET-hPRLA-IL2)。在hPRLA和IL-2 cDNA之间加入一个用于克隆目的的BamH1限制性位点，该位点在该融合蛋白的结合处产生了两个额外的氨基酸残基(甘氨酸和丝氨酸)。实施例2将一个表达质粒转染入一种稳定细胞系我们已经产生了hPRL-IL-2以及容纳有hPRL-IL-2的稳定小鼠细胞系以用于我们的初步体外研究。在本发明的融合蛋白的生产中使用了小鼠L细胞。这些细胞一开始用编码hPRLA-IL-2 cDNA的DNA分子以及肝炎病毒Tk基因和仓鼠APRT基因(Leung et al.，1985)使用lipofectin方法(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)进行共转染，该hPRLA-IL-2 cDNA由小鼠金属硫蛋白调控序列操纵。在TK+和APRT+表型的双选择后，稳定的hPRL或者hPRL类似物分泌型小鼠L细胞系被建立并且在Dulbecco Modified Eagles培养基(DEME，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)进行维持，该DEME中添加了10％的Nu-血清(Collaborative Research，Bedford，MA)、15μg/ml次黄嘌呤、1μg/ml氨基喋呤、15μg/ml胸苷以及50μg/ml的庆大霉素。将细胞转入T150烧瓶直至达到90％汇合。每24小时在这一时刻收集无血清条件培养基并合并。经合并的培养基在-20℃下进行冷冻直至完成进一步纯化。实施例3纯化该融合蛋白为获得提高产量的融合蛋白，根据本领域所熟知的程序应当首先对这些蛋白进行纯化。这些步骤包括通过离心从培养基中取出细胞，随后进行沉淀，交叉流动超滤并且使用层析方法，例如低压SEC和制备级RP-HPLC层析。在这些步骤后进行缓冲液交换、脱热原以及冷冻干燥(lyophilation)。
步骤1取出细胞——将80-100％的条件培养基以6000×g在4℃下离心30分钟。该初始细胞培养基的体积为80-100升。所有的hPRL-G129R在该步均被回收。
步骤2沉淀——该沉淀步骤通过向10升细胞培养基中在恒速搅拌下逐渐加入3.5kg硫酸铵来进行。将该溶液在4℃下放置12小时。通过离心去掉上清。随即将该沉淀溶解于2升的蒸馏水中。通过离心除去不溶杂质。所有的离心步骤均以6000g在4℃下进行30分钟。溶液的最终体积约为5升。
步骤3使用交叉流动超滤降低体积——在2000ml搅拌腔中使用一种10K分子截留膜来降低该溶液的体积，从而使该体积达到SEC大小排阻柱的柱床体积的10％。这一膜过滤步骤在55psi下操作。
步骤4低压SEC——这一低压SEC步骤的目的在于除去可能污染制备级RP-HPLC柱的较大或者较小的杂质。低压SEC在44×1000mmAmicon玻璃柱中进行，该柱中填装有Bio-Rad P60凝胶。该凝胶的柱床体积为1231ml。以0.5ml/min的流速将0.05M的硫酸铵流过该柱。整个设置被置于冰箱中并且维持于4℃。
步骤5制备级RP-HPLC——在本步工作中使用了一种带有紫外可见监测仪的Waters(Millipore Corp.，Bedford，MA)制备以及HPLC系统。使用一种来自Rainin Instrument，Inc.(Woburn，MA)的制备级(preparative-scale)Dynamax C，RP-BPLC柱(21.4×250mm，5gm，300A孔大小)来获得高纯度的hPRL-G129R产品。使用一种从40％的乙腈(ACN)(v/v)+0.1％三氟乙酸(TFA)到80％的乙腈+0.1％三氟乙酸的线性梯度来进行分离。在60分钟内建立该线性梯度，流动相的流速为5ml/min。将该UV监测仪设置于220nm。
步骤6缓冲液交换——使用膜透析通过缓冲液交换而除去残余的有机溶剂。以一种Amicon YMIO膜在一个50ml的搅拌腔中进行缓冲液交换。在加入蛋白质样品之前根据脱热原方案对该超滤系统进行准备。该有机溶剂以无热原蒸馏水进行几个回合的渗滤。hPRL-G129R被保留于该50ml滞留溶液中。
步骤7脱热原——由于这些产品将被用于体内，因此无热原产品是优选的。因此使用100K膜过滤步骤以除去热原。脱热原在50ml搅拌腔中以100K膜完成。根据脱热原方案以0.1N NaOH溶液处理该搅拌腔。以无热原水洗涤该滞留物3次，并且该hPRL-G129R被收集于透过物。透过物的体积为～100ml。通过放射免疫矩阵(matrix)分析(RIMA)来测定hPRL或者hPRL-G129R的浓度。
步骤8冷冻干燥——冷冻干燥为最终产品的贮藏所需。hPRL-G129R在冻干形式下更为稳定。所有的液体溶剂均在具有离心真空蒸发器的冻干设备中被除去。该冻干的hPRL-G129R样品随后在-20℃冷冻设备中储存于N2中。实施例4通过放射性受体结合分析进行的纯化hPRL和hPRL-G129R生物活性检测除了以PRL代替GH之外，放射性受体结合分析根据在Chen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 875061(1991)中的描述而进行。简而言之，T47-D细胞在6孔组织培养板中生长至90％汇合(～105细胞/孔)。将单层细胞在无血清RPMI-1640培养基中受饥2小时。随后将这些细胞在室温下于无血清RPMI-1640培养基中在存在或者不存在不同浓度的hPRL(来自NIH，作为标准)和hPRL-G129R的情况下温育，该培养基含有8×104CPM的125I hPRL(比活性＝30μCi/μg；NEN Dupont，Boston，MA)。随后这些细胞在无血清RPMI-1640中洗涤3次并且在0.5ml的0.1N NaOH/1％SDS中溶解，并且通过伽马计数器(ICNBiomedical，4/600plus型；Costa Mesa，CA)测定结合的放射性。随后算出hPRL和hPRL-G129R的EC50值并且以平均值±SD的形式表示。通过斯氏t检验来进行比较。实施例5通过STAT5磷酸化/免疫沉淀分析进行的纯化hPRL和hPRL-G129R生物活性检测在含有10％的Charcoal Stripped胎牛血清(CSFBS；生长培养基)的RPMI-1640培养基中生长T-47D细胞。对于每个实验，细胞在达到90％汇合时分转入6孔培养板中的培养基中。在实验当天，细胞在无血清培养基中进行1小时的耗竭(deplete)并且在hPRL、hPRL-G129R以及两者的组合物中温育30分钟。处理之后，以冰冷的PBS洗涤T47-D细胞一次，并且轻柔地刮下收集于1ml冰冷的裂解缓冲液中[20mM Tris-Cl(pH7.4)、100mM NaCl、2mM EDTA、1％的NP-40、1mM苯甲基磺酰氟化物、10μg/ml抑酶肽、10μg/ml亮抑酶肽]。随即将该裂解混合物以避免气泡的方式通过一个22号针头几次并且以最大速度旋转20分钟。随即将上清转入一个新的微量离心管中。随后向100微升(200-500微克总蛋白)的细胞裂解物中加入5μg的STAT5单克隆抗体以及向每一反应中加入400微升ddH2O以及500微升2×IP缓冲液[1％Triton X-100、150mM NaCl、10mM Tris pH7.4、1mM EDTA、1mM EGTA、0.2mM钒酸钠、0.2mM PMSF、0.5％NP-40]。4℃下温育过夜并且进行轻柔的旋转后，将50微升经预洗涤的(1×IP缓冲液)蛋白A琼脂糖珠将入各IP反应中并且在4℃下再继续温育2小时。在温育结束时，以1×IP缓冲液洗涤该琼脂糖珠3次，并且随后通过在50微升1×SDS PAGE上样缓冲液中重悬浮该蛋白A琼脂糖珠而将蛋白质洗脱。随即将样品用于4-12.5％SDS-PAGE并且使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗磷酸酪氨酸抗体PY20和ECL试剂盒(Amersham，IL)来进行免疫印迹分析。随后将印迹物对X射线胶卷进行曝光并且使用标准程序进行显影(Kodak，Rochester，NY)。在T-47D人类乳腺癌细胞中使用hPRL和hPRL-G129R所获得的结果表明hPRL-G129R能够阻断由hPRL所诱导的信号转导，这显示了其拮抗效果。实施例6通过TUNEL分析进行的纯化hPRL和hPRL-G129R生物活性检测该分析Fluorescein Apoptosis detection system，promega(orp.)通过对片段化的DNA的3-OH末端的缺刻进行标记而发挥作用。通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶在3-OH末端引入了荧光素标记的dUTP。使用了T47-D人类乳腺癌细胞。在分析之前，将该乳腺癌细胞转入10％Charcoal-Striped胎牛血清(CCS)一星期。随后，将这些细胞铺于8隔室玻片系统(8chambered slide system)(LabTekII)，每隔室汇合为60-70％。第二天，这些乳腺癌细胞在条件化培养基中(0.5％CSS)以各种浓度的hPRL-G129R进行处理。约24到48小时后，拆开隔室并且在制造商的指导下进行该分析。使用PlympusIX 70显微镜系统在FITC滤光片下检测这些玻片。实施例7hPRLA-IL-2融合蛋白质的浓度的检测进行了SDS-PAGE和免疫印迹以进一步确认该被表达的hPRLA-IL-2融合蛋白质具有适当的分子量。收集来自于瞬时转染的小鼠L细胞的培养液并将之用于15％SDS-PAGE，该电泳在我们的实验室内使用Bio-Rad Protean II或者Mini-Protean II系统(Bio-Rad，Hercules，CA)进行常规的实施。在进行蛋白质转移后，在含2％的明胶的TBS中室温下轻微振荡1小时来封闭硝酸纤维素膜，随后以含0.05％Tween 20的TBS洗涤三次(每次洗涤5分钟)。将含多克隆兔抗-hPRL(来自BioDesign International，Kennebunk，Maine，1∶200稀释)的1％的明胶/TBS加至硝酸纤维素膜并且在室温下轻微振荡温育过夜。除掉一级抗体后，以含0.05％Tween20的TBS洗涤该硝酸纤维素膜三次，并且随后在含有羊抗兔IgG辣根过氧化物酶(HRP)偶联物(Boehringer Mannheim Biochemicals)的1％明胶/TBS中室温温育过夜。以二抗进行的温育之后以含0.05％Tween20的TBS洗涤该硝酸纤维素膜三次。
为使该蛋白带可见，将该硝酸纤维素膜在一种混合物中温育10分钟，该混合物为含有0.018％H2O2(v/v)的50ml TBS同含有30mg HRP显色试剂(Bio Rad)的10ml甲醇的混合物。以水漂洗该硝酸纤维素膜，在空气中干燥并进行照相。纯化的hPRL以及IL-2(AccurateChemical & Scientific Corp.Westbury，NY)被用于通过照相和密度比色计法对表达的hPRLA-IL-2进行定量(Fernadez andKopchick，1990)。实施例8使用放射性受体结合分析以及人类乳腺癌细胞测定hPRLA-IL-2融合蛋白的结合性质本试验的主要目的在于使用人类乳腺癌细胞来比较hPRL、hPRLA以及该hPRLA-IL-2融合蛋白质的结合亲和性，以此确定hPRLA同IL-2的融合并不影响其同乳腺癌细胞hPRLR的结合能力。
放射性受体结合分析的实施如在Chen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 875061(1991)中的描述那样进行。简而言之，T-47细胞在6孔组织培养板中生长直至90％汇合(～105细胞/孔)。将单层细胞在无血清RPMI-1640培养基中受饥2小时。随后将这些细胞在室温下于无血清RPMI-1640培养基中在存在或者不存在不同浓度的hPRL(来自NIH，作为标准)和hPRL-G129R的情况下温育，该培养基含有8×104CPm的125I hPRL(比活性＝30μCi/μg；NEN Dupont，Boston，MA)。随后这些细胞在无血清RPMI-1640中洗涤3次并且在0.5ml的0.1N NaOH/1％SDS中溶解，并且通过伽马计数器(ICN Biomedical，4/600plus型；Costa Mesa，CA)测定结合的放射性。随后算出hPRL和hPRL-G129R的EC50值并且以平均值±SD的形式表示。通过斯氏t-检验来进行比较。通过加入1μg/ml的非标记hRPL+1μg IL-2来测定非特异结合。实施例9使用细胞扩增分析进行IL-2、hPRLA以及hPRLA-IL-2融合蛋白的生物活性比较该项研究中使用了两种类型的细胞增殖分析以确认hPRLA-IL2融合蛋白保持了类似于IL-2的活性以及类似hPRLA的活性。鼠T细胞系(HT-2细胞)为一种IL-2反应型细胞系，该细胞系在典型的情况下被用于检测重组小鼠和人IL-2的生物活性，在此用于检测融合蛋白的类IL-2活性(Taniguchi et al.，1983；Rosenberg et al.，1984)。另外，使用人类乳腺癌细胞来检测该融合蛋白的可能的拮抗活性。
使用了一种人类乳腺癌细胞系(T47-D)(来自ATCC)。这些细胞根据ATCC的建议在对应的培养基上生长。分析条件由Ginsburg和Vonderharr(1995)所描述并且可根据各细胞系而进行修正。一般来说，细胞在37℃下维持于含5％CO2的加湿空气环境中。对于个体生长实验，这些细胞以约2×104/ml/孔的密度被铺于12孔培养板中。将细胞贴壁一天并且除去培养基并以含有ITS+(胰岛素-转铁蛋白-硒-BSA亚油酸培养基添加物；Collaborative Research Bedford，MA)的培养基换成无血清条件。加入了多种浓度的hPRL、hPRLA、hPRLA-IL-2或其中两种的组合(1∶1、5∶1、10∶1等等比例的hPRLA∶hPRL或者hPRLA-IL-2∶hPRL)。再培养三天后，在胰酶消化后收集细胞并在细胞计数器下计数。实施例10使用同基因小鼠模型进行体内研究以检测hPRLA-IL-2融合蛋白的抗肿瘤活性hPRLA-IL-2的抗肿瘤效果的最终实验是体内实验。为此目的而使用了同基因的具有免疫能力的C3H小鼠以及来自相同株小鼠的乳腺肿瘤细胞以检测该融合蛋白的可能的抗肿瘤活性。
具体使用了CRL-6326和/或CRL-6378小鼠乳腺癌细胞。为查明PRLR在这些细胞中的状态，对这些细胞进行了放射性受体结合分析以确认它们含有PRLA。使用两种细胞系作为阳性以及阴性对照。一种细胞系为C3H衍生的小鼠L细胞，购自ATCC。这些转化的成纤维细胞如果被用于皮下注射可诱导肿瘤。由于GHR或者PRLR在L细胞中表面不能被检测到(数据未出示)，因此这些L细胞被用作为非乳腺癌对照。经过hPRLR cDNA的稳定转染的小鼠L细胞同样被用于在C3H小鼠中诱导肿瘤。由这些细胞所诱导的肿瘤由于在其表面的hPRLR高水平表达而被视为阳性对照。
通过接种5×106个癌细胞而对皮下肿瘤进行诱导以用作为癌模型。它在10天内诱导肿瘤生长至25μl的体积，上文引及的Reisfeldet al.(1996)的文献。这时，通过IL-2、PRLA以及hPRLA-IL-2融合蛋白的静脉内注射而对这些动物进行7天的处理。对各组使用了两种剂量(每次注射5μg和25μg)。在处理结束时，处死这些动物并且测量未接受处理或者接受了IL-2、hPRLA或者hPRLA-IL-2的动物体内的肿瘤重量，并且进行了统计分析。
同样进行了免疫组织化学评估以检测原位细胞浸润的证据。简而言之，冷冻切片在冰冷的丙酮中通过以0.03％的H2O2除去内源过氧化物酶并且以含10％血清的1％BSA/PBS封闭产生胶原的元件而进行10分钟的固定。随后将CD45特异性抗体以预定的稀释度(～20μg/ml)覆盖于系列切片并且在加湿室中将切片温育30分钟。以生物素化的二级抗体处理10分钟，随后通过连接于链亲合素的碱性磷酸酶处理10分钟，各步骤之间均以PBS进行洗涤。再次洗涤之后，加入底物并且在黑暗中将载玻片温育20分钟。以PBS洗涤之后，对该载玻片进行负染、固封并且使用Olympus(Bew Hyde Park，NY)BH2显微镜进行观察。
下表所示为使用同基因小鼠以及肿瘤细胞以检测hPRLA-IL-2融合蛋白的生物活性的实验设计。
序列表SEQ ID NO1(MNIKGSPWKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP)LPICPGGAARCQVTLRDLFDRAVVLSHYIHNLSSEMFSEFDKRYTHGRGFITKAINSCHTSSLATPEDKEQAQQMNQKDFLSLIVSILRSWNEPLYHLVTEVRGMQEAPEAILSKAVEIEEQTKRLLE GMELIVSQVHPETKENEIYPVWSGLPSLQMADEESRLSAYYNLLHCLRRDSHKIDNYLKLLKCRIIHNNNC
权利要求
1.一种治疗癌症的方法，该方法包括给予患者有效量的具有一种受体拮抗结构域以及一种正免疫调节剂结构域的蛋白。
2.权利要求1的方法，其中该受体拮抗结构域为一种促乳素拮抗剂结构域。
3.权利要求1的方法，其中该正免疫调节剂结构域为一种白细胞介素。
4.权利要求3的方法，其中该白细胞介素为白细胞介素2(IL-2)。
5.权利要求3的方法，其中该正免疫调节剂结构域为白细胞介素12(IL-12)。
6.权利要求3的方法，其中该正免疫调节剂结构域为γ干扰素(IFNγ)。
7.权利要求1的方法，其中该蛋白质为一种促乳素拮抗剂-白细胞介素2(hPRLA-IL-2)融合蛋白。
8.权利要求2的方法，其中该促乳素拮抗剂结构域的特征在于对应于促乳素蛋白129位上的甘氨酸被单氨基酸取代为精氨酸。
9.权利要求2的方法，其中该促乳素拮抗剂结构域含有一种具有SEQ ID NO01(hPRLA)的氨基酸序列的蛋白质或其保守变体。
10.权利要求2的方法，其中该促乳素拮抗剂结构域含有一种天然促乳素序列的截短形式或其保守变体。
11.一种蛋白质，该蛋白质含有一种受体拮抗结构域以及一种正免疫调节剂结构域。
12.权利要求11的蛋白质，其中该受体拮抗结构域为一种细胞凋亡促进结构域。
13.权利要求12的蛋白质，其中该细胞凋亡促进结构域为一种促乳素拮抗剂结构域。
14.权利要求12的蛋白质，其中该正免疫调节剂结构域为一种白细胞介素。
15.权利要求14的蛋白质，其中该白细胞介素为白细胞介素2(IL-2)。
16.权利要求14的蛋白质，其中该正免疫调节剂结构域为IL-12。
17.权利要求14的蛋白质，其中该正免疫调节剂结构域为IFNγ。
18.权利要求12的蛋白质，其中该蛋白质为一种促乳素拮抗剂-白细胞介素2(hPRLA-IL-2)融合蛋白。
19.权利要求13的蛋白质，其中该促乳素拮抗剂结构域的特征在于对应于促乳素结构域129位上的甘氨酸被单氨基酸取代为精氨酸。
20.权利要求13的蛋白质，其中该促乳素拮抗剂结构域含有一种具有SEQ ID NO01(hPRLA)的氨基酸序列的蛋白质或其保守变体。
21.权利要求13的蛋白质，其中该促乳素拮抗剂结构域含有一种天然促乳素序列的截短形式或其保守变体。
22.权利要求3的方法，其中该癌症的特征为表达一种促乳素受体。
23.一种蛋白质，该蛋白质包含具有SEQ ID NO01的氨基酸序列或其保守变体序列的第一种结构域以及一种正免疫调节剂结构域。
24.权利要求1的方法，其中该受体拮抗结构域为一种细胞凋亡促进结构域。
25.权利要求24的方法，其中该细胞凋亡促进结构域通过在靶细胞中抑制STAT3磷酸化而发挥功能。
26.权利要求12的蛋白质，其中该细胞凋亡促进结构域通过在靶细胞中抑制STAT3磷酸化而发挥功能。
27.一种药物组合物，该组合物含有一种治疗有效量的权利要求11的蛋白质以及一种适量的载体介质。
全文摘要
一种新的融合蛋白质，该蛋白质含有一种受体拮抗结构域以及一种正免疫调节结构域，其特征在于，例如在于其阻断细胞凋亡以及/或者抑制内分泌反应的能力，它可用于癌症治疗。例如，一种人类促乳素拮抗剂－白细胞介素2(hPRLA－IL－2)融合蛋白组合了细胞凋亡诱导以及免疫治疗作用，用以在乳腺或者前列腺中抵抗癌症。
文档编号C07K19/00GK1432064SQ01809991
公开日2003年7月23日 申请日期2001年3月23日 优先权日2000年3月23日
发明者M·Y·陈, T·E·瓦格纳 申请人:格林维尔医院系统公司