专利名称：一种蚯蚓dna酶及其提取方法
技术领域：
本发明涉及一种可以降解DNA的酶及其提取方法。
蚯蚓，中药称地龙，是我国应用很广的传统中药，自然界的蚯蚓品种数目繁多，食性很广，许多污染环境的有机物质可作为它的食料，故常用它来处理有机废物，净化环境。蚯蚓还具有繁殖率高，来源广泛，蛋白质含量丰富的特点，且蚯蚓生存环境差，其体内各种蛋白发挥作用对外界条件要求低。
发明要点本发明的目的是提供一种从蚯蚓组织蛋白中提取的DNA酶。本发明提取出的这种DNA酶最适温度在41℃左右，耐高温，90℃三小时活性无明显改变，最适pH值为5.4左右。Mn，Mg，Ba等重金属离子对其有较强的激活作用，其中以Ba离子作用最强。该酶具有广泛的应用前景，如配合以蛋白酶和RNA酶可以作为天然空气清新剂、消毒剂、杀灭环境中的DNA病毒、还可作为针对各种农作物病毒的农药等。
本发明提取该酶的方法包括蚯蚓除毒、细胞破碎、盐析、脱盐、层析、凝胶过滤等六步骤(图1)。其中细胞破碎可用机械破碎或超声破碎法，层析可用P11纤维素阳离子交换层析、CM纤维素阳离子交换层析、DEAE阴离子交换层析；Sephacry-S200凝胶过滤、SephadexG75凝胶过滤或Bio-gel P100凝胶过滤。
以下实施例可以帮助更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1.除毒在蚯蚓体内含有大量对人体有害的毒素，因此，首先要将毒素除掉。具体先将蚯蚓洗尽，浸泡两日，至其体内泥土完全排出，身体呈洁净半透明状。再将蚯蚓用20v电脉冲刺激使之排毒。及时更换盐溶液3至4次，直至无肉眼可见黄色毒液分泌为止。
实施例2.细胞破碎将上述步骤所得的无毒蚯蚓用超声细胞破碎器进行匀浆，再用高速冷冻离心机离心，此步采用以下方法提高DNA酶的分离纯化效率利用此酶在pH值5.4时溶解度较大，而其它蛋白在pH4-5之间的溶解度最小的特点，将过夜抽提液在pH5.4环境下，4℃，12000转离心20分钟，可见试管中淡黄色澄清透明的上清液，管底褐色混浊的沉淀物，粗提物中大部分杂蛋白被去除，此过程大大提高了纯化效率。此方法明显优于一般所使用的中性偏碱性环境下此酶的分离纯化。该方法可用于等电点偏低的蛋白的分离纯化。
实施例3.盐析将上述步骤用硫酸铵分段法盐析。样品为0.1M柠檬酸-0.2M NaH2PO4缓冲液，pH 5.4，盐析温度4℃，盐析时间18小时；弃40％饱和度时的沉淀和70％饱和度时的上清液，收集70％饱和度时沉淀蛋白，即有DNA酶活性部分，离心速度为12000rpm。
实施例4.脱盐将上述步骤所得有活性盐析部分用超滤法常规除盐，超滤缓冲液为0.1M柠檬酸-0.2M NaH2PO4，获得粗提取液。
实施例5.Sephacryl-S200凝胶过滤将上述步骤所获得的粗提液进行Sephacryl-S200凝胶过滤(洗脱液为pH8.0Tris盐酸，流速为24ml/h)，即可得到一种具有活性的洗脱液。
实施例6DEAE阴离子交换层析将上述步骤所得活性部分分别用pH8.0的Tris盐酸缓冲液进行透析平衡，调样品pH值至8.0上样后进行连续梯度洗脱。洗脱条件为20mM Tris盐酸；pH8.0，0-0.1M Nacl；24ml/h洗脱速度。收集0-0.1M/L Nacl范围的活性峰洗脱液，即可得到一种层析纯或电泳纯DNA酶，分子量为45000±300道尔顿的蛋白。
本发明所得到的这种蛋白可将环状的质粒DNA、链状的嗜菌体DNA、鲑精DNA、小牛血清DNA降解成小核苷酸片段，兼有外切和内切DNA作用，是一种非特异的DNA酶。经测定发现此种酶最适温度在41℃左右，耐高温，90℃三小时活性无明显改变，最适pH值为5.4左右。Mn，Mg，Ba等重金属离子对其有较强的激动作用，其中以Ba离子作用最强。
发明效果用本发明的方法，从蚯蚓组织中提取的DNA酶，酶量大，纯度高，且化学性质稳定，生产工艺简单，产量高，成本低，易保存运输。该酶具有广泛的应用前景，如根据其广泛的非特异的对各种DNA的酶切作用，及其耐酸、耐高温特点，配合以蛋白酶和RNA酶可以作为一种优良的体外抗病毒方法，因其主要成分来源于蚯蚓，据此可配制成天然环保的空气清新剂、消毒，、杀灭环境中的DNA病毒，还可用作针对各种农作物病毒的农药等。
图1——蚯蚓DNA酶提取流程图
权利要求
1.一种蚯蚓DNA酶及其提取方法，其特征是所述的方法包括蚯蚓除毒、细胞破碎、盐析、脱盐、层析、凝胶过滤等步骤。
2.按照权利要求1所述的蚯蚓DNA酶及其提取方法，其特征是细胞破碎可采用机械破碎或超声破碎法。
3.按照权利要求1所述的蚯蚓DNA酶及其提取方法，其特征是层析可采用PII纤维素阳离子交换层析、CM纤维素阳离子交换层析或DEAE阴离子交换层析。
4.按照权利要求1所述的蚯蚓DNA酶及其提取方法，其特征是凝胶过滤采用Sephacry-S200、SephadexG75或Bio-gelP100凝胶。
全文摘要
本发明涉及一种高效稳定的蚯蚓DNA酶及其提取方法,此酶可将环状的质粒DNA、链状的嗜菌体DNA、鲑精DNA、小牛血清DNA降解成小核苷酸片段,化学性质稳定,最适温度在41℃左右,耐高温,90℃三小时活性无明显改变,最适pH值为5.4左右,Mn,Mg,Ba等大部分重金属离子对其有较强的激活作用,提取该酶的方法包括蚯蚓除毒、细胞破碎、盐析、脱盐、层析、凝胶过滤等六步骤,此酶生产工艺简单,产量高,成本低,化学性质稳定,易保存运输,该提取方法提取DNA酶量大,纯度高,实验设备要求简单,具有广泛的应用前景。
文档编号C07K1/00GK1386854SQ0211782
公开日2002年12月25日 申请日期2002年5月22日 优先权日2002年5月22日
发明者牛勃, 杨利军, 杨琦, 向前, 闫占清, 胡晓年, 刘晓玲, 杨涛, 常冰梅 申请人:中国医药生物技术协会北方生物诊疗中心, 四川汉龙高新技术开发有限公司