专利名称：抗细胞质胸苷激酶－IgY的制备及肿瘤诊断组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用人宫颈癌细胞(HeLa)TK1的C-端31肽作为抗原，制备抗细胞质胸苷激酶-lgY抗体和以IgY抗体为有效成分的肿瘤诊断组合物。
胸苷激酶(TK，ATPthymidine 5′-phosphotransferase，EC.2.7.1.21，简称TK)，在DNA合成过程中，一种嘧啶补救途径的酶，催化胸苷磷酸化为胸苷酸。人细胞中TK以两种同功酶的形式出现细胞质TK1和线粒体TK2。TK1的水平在细胞周期的G1和S期交界处开始升高，随着细胞进入G1晚期，TK1酶的水平逐渐急剧上升，直至S和G2期交界处。然而TK2仅能在静止期细胞中见到，在增殖细胞中水平非常低[1-2]。由于TK1活性是与细胞生长状态紧密联系，因此TK1可以作为一种好的标记物来检测增殖细胞的增殖活性和恶性肿瘤的增殖度[3-4]。1984年，采用胸苷类似物，[125I]-5-碘-2′-脱氧尿苷作为底物，发展了检测血清TK1(STK)的放射性同位素方法，并将它作为人血清学细胞增殖标记物[5]。在健康对照组中STK的活性相对较低，但在增殖性细胞和肿瘤细胞中有显著的增加[6-8]。此法测定虽有较高的灵敏度，但测定的是TK总活性，即TK1和TK2的活性(其中也包括来源于组织器官中的增殖较快的细胞-肿瘤、非肿瘤细胞的增殖，即恶性、良性或其它非肿瘤组织等等)。在使用放射性同位素方法测定中，[125I]-5-碘-2′-脱氧尿苷并非是TK1活性分析的专一性底物，所以在TK1的活性测定中，对pH和温度非常敏感，常产生不准确结果，因此在临床应用上有很大的局限性。
制备抗细胞质胸苷激酶-IgY抗体在国际上尚未有报道。采用增强化学发光点印迹法(Enhanced chemi luminescent(ECL)dot blot)针对恶性肿瘤作血清学的早期诊断，建立癌症测定的指标，目前在国内外尚属首创。
发明概述本发明采用人宫颈癌细胞的TK1 C-端31肽(TK1的氨基酸序列从194-225)作为抗原的设计，见(
图1)。经化学合成的氨基酸多肽(31肽)作为半抗原，与偶联分子(BSA)联接成大分子抗原，再经免疫母鸡获得IgY抗体，最后制备和纯化了抗TK1-IgY抗体。
本发明采用了以下技术方法1、抗原的设计选择TK1作为抗原是它来源于癌细胞，而TK1进行调控细胞周期活性变化的关键是氨基酸序列。
我们选择抗原的氨基酸序列是人宫颈癌细胞(HeLa)TK1的C-端的31肽(TK1的氨基酸序列从194到225，见图1)作抗原，制备的IgY抗体对肿瘤TK1分子具有高度特异性。
图1人宫颈癌细胞(HeLa)TK1的C-端31肽氨基酸序列 由于我们选用了这种调控细胞周期的活性多肽作为半抗原，因而制备的抗体可作为监视肿瘤细胞增殖速度的分子探针，也为广谱型肿瘤的早期检查提供了理论基础。通过对多种肿瘤血清学及组织学标本进行检查，测得的阳性率为83～93％，这分别高于以上介绍的肿瘤标志物的阳性捡出率。
选用这种调控细胞周期活性的TK1-C端多肽半抗原，分别对癌组织或肿瘤细胞株中的TK1抗原作特异性、稳定性及制备方法等方面比较，其结果是应用多肽抗原制备的抗体为最优方案。这种多肽抗原具有性质稳定，不易失活，便于长期保存的良好特性。
2、抗体的制备和纯化应用上述抗原去免疫母鸡而制备出抗TK1-IgY抗体的方法，其特征在于(1)鸡的IgY和人的IgG之间存在着分子遗传差异性；(2)鸡的TK1和人的TK1有种族差异性；(3)与传统的兔免疫制备多克隆抗体比较，IgY具备有内源分子均一性(只产生一种类型的抗体分子，即IgY)，这可大大降低非正常免疫反应的噪声，而提高正常免疫反应的灵敏度。
利用上述抗原免疫产蛋的母鸡，再从卵黄中分离纯化而得到抗体粗品。用31肽制备纯化亲和柱对IgY粗品进行亲和纯化，制备出与天然TK1分子有特异免疫反应的抗TK1-IgY抗体。
3、TK1-IgY的鉴定用三种细胞株分别鉴定抗体纯度
(1)重组人TK1程株(pT7 hTK1)；(2)一种表达TK1阳性的野生型淋巴瘤细胞株(CEM-TK+)；(3)一种表达TK1阴性的细胞株(CEM-TK-，用抗5-溴脱氧尿苷筛选得到的)。
以这三种细胞株为标准来鉴定抗体的特异性。天然TK1是从上述细胞萃取物中经SDS电泳，天然胶电泳和等电点聚集分离以后，进行西部免疫印迹，测定了其纯度和分子量。制备的抗体与重组人TK1工程株(pT7 hTK1)表达的TK1作免疫印迹实验比较，证实了该抗体具有纯度高，无非特异性免疫交叉反应，以其测定的分子量、等电点等都与文献报道的一致[9-10]。
本发明的肿瘤诊断组合物是利用上述抗体，制备用于血清学检测的增强化学发光点印迹检测和组织学检测的免疫组化检测组合物。其中增强化学发光点印迹检测组合物是由以下物质组成抗TK1-IgY抗体1瓶羊抗鸡生物素化IgG1瓶辣根过氧化物酶(Avdin-HRP)1瓶ECL Western Blot检测试剂 1瓶硝基纤维素膜 1张该检测方法采用增强化学发光点印迹法，对肿瘤的捡出灵敏度为10-11～10-12g/L，能鉴别良性和恶性肿瘤，这为肿瘤的早期捡出和鉴别提供了方法学依据。此方法灵敏度与放免法相当，但没有放射污染，且检测成本低廉，便于保存。
本发明中免疫组化检测组合物由以下物质组成抗TK1-IgY抗体1瓶羊抗鸡生物素化IgG1瓶辣根过氧化物酶(HRP) 1瓶应用上述检测试剂具有检测灵敏度高，同进口的同类型产品相比具有更高的性能价格比。本发明的特点由于抗TK1抗体是检测人血清、组织中微量TK1分子的高灵敏度探针，因此，它可直接用于探测肿瘤的基础研究，健康普查、早期诊断、鉴别良性和恶性肿瘤。它与目前在国内应用的肿瘤检测试剂相比有以下特点1、广谱性。
TK1是细胞S期DNA合成的关键酶之一。肿瘤扩增必须依赖此酶的参与方可进行，因而它可作为监视细胞快速增殖的分子探针，也为广谱性肿瘤的早期检查打下理论基础，因此能够对多种肿瘤血清及组织标本进行检查。
2、恶性肿瘤与良性肿瘤的鉴别。
对于恶性肿瘤与良性肿瘤；或良性肿瘤向恶性肿瘤的转化在临床上有相当高的研究价值。TK1作为肿瘤检测的最突出特点是检测值与肿瘤恶变程度呈正比关系，这为正常细胞、良性肿瘤与恶变肿瘤的临界值(或称阈值)的建立奠定定量基础。
3、检测方法的灵敏度高。
该检测方法采用增强化学发光，对肿瘤的捡出灵敏度为10-11～10-12g/L，这为肿瘤的早期微量标志分子捡出提供了方法学依据。此方法与放免法的灵敏度相当，但没有放射污染，操作简便。如果能与国内主流的化学发光分析仪器配合使用，可使TK1抗体的检测灵敏度提高到10-15～10-18g/L水平，这将大幅度提升检测早期肿瘤的阳性率。
4、组合物的商业应用前景TK1检测试剂主要由IgY抗体组成，这种抗体分子的稳定性远大于传统IgG，因而便于商业运输、贮存等流通环节的操作。这无疑可延长试剂的使用期，降低试剂的潜在成本，因而是其它同类肿瘤检测试剂不具备的优点。另外，TK1检测方法灵敏，其中的一抗、二抗及三抗试剂消耗量极少，可使肿瘤检测的费用降低，这便于大范围肿瘤早期诊断的推广和应用。
本发明将通过以下实例作进一步的描述实施例1细胞质胸苷激酶活性部位氨基酸序列的获得。
HeLa细胞中的TK1是一种分子量为96kD的四聚体分子，其单体是由234个氨基酸组成TK1的C-端40个氨基酸(氨基序从194到234)是TK1调控细胞周期活性变化的关键序列。若要消除这其中的40个氨基酸，则TK1将失去调控细胞周期的活性。如果消除末端的10个氨基酸，TK1仍显示出调控细胞周期的活性。我们经过活性筛选实验研究，选出的氨基酸序列是从211到225的15肽和氨基酸序列从194到225的31肽。这种多肽经人工合成，再与偶联分子(BSA)联接成抗原的抗体制备技术，已证实了用TK1-31肽抗原(氨基酸序列从194到225)制备的抗体特异性好于15肽，这是本发明中选用31肽作为免疫抗原的依据。
实施例2细胞培养。
采用常规细胞培养方法，将实验所用的CEM TK+，CEM TK-细胞进行培养(使用含10％小牛血清的1640培养液)，当培养瓶中细胞数長到40×106时，将收获的细胞进行处理。
实施例3pT7 hTK1工程株的制备与纯化。
按文献[6]提供的方法制备。纯化的hTK1(剪去了N端15个氨基酸)经天然胶电泳和SDS电泳鉴定为一条带，分子量为22Kd。用ECL Western Blot方法进一步分析，hTK1与纯化的抗TK1-gY抗体产生免疫反应，在22Kd位置见到一条清晰印迹带。
实施例4TK活性分析。
采用放射免疫沉淀方法对TK1酶活性分析。测定结果表明在CEM TK+的细胞株中，TK1酶活性是随着抗体浓度增加而升高呈正比关傺。在CEM TK-细胞株无TK1酶活性反应。
实施例5抗TK1-IgY抗体制备。
鸡的免疫及粗品抗体制备按Philip方法[11]进行，将KLH-TK1 31肽用PBS缓冲液溶解后，再与福氏完全佐剂按1∶1混合，注射到产蛋母鸡的胸肌。经两次给鸡用福氏不完全佐剂与抗原混合液的加强免疫，四周后每天收集鸡蛋在4℃下储存。IgY抗体的粗品纯化参照Akita等的水稀释法[12]，用有网眼的漏斗将蛋黄与蛋白分离，完整的蛋黄用无离子水洗涤干净后用摄子去掉蛋黄表皮，收集蛋黄液。用6倍体积的蒸餾水稀释蛋黄液，搅拌均匀后调pH5.2，在4℃下放置过夜。蛋黄液以1,200×g，离心30分钟，至100ml，加硫酸胺至60％饱和度，4℃下过夜。以8,000×g，离心20分钟，将离心的沉淀用双蒸水稀释至100ml，加乙醇稀释至25％乙醇浓度，-20℃放置30分钟后，以10,000×g冷凍离心20分钟，离心的上清液用pH7.0，30mmol/L PBS稀释至一定浓度，混匀后再次以10,000g×g，冷冻离心20分钟，取上清液冷凍干燥后，置-20℃保存。
实施例6IgY抗体亲和层析纯化。
300mg经CNBr活化的Sepharose 4 Fast Flow冷冻干燥凝胶用冷的pH2.5，1mmol/L HCl溶胀后直接装层析柱，抽真空洗涤200ml体积。2.0mg TK1-31肽(C-31肽)在pH6.5，0.1mol/L NaHCO3，0.5mol/L NaCl缓冲液里溶解后加到小层析柱里摇摆混匀1小时。用3倍柱体积冷的碳酸缓中液(pH6.5，0.1mol/L，NaHCO3)抽滤洗涤未偶联的肽，再用pH7.0，1.0mol/L乙酸胺洗涤2～3倍柱体积，4℃过夜。用pH3.0，0.1mol/L，0.5mol/L NaCl醋酸缓冲液洗涤吸附过剩的肽。用偶联缓冲液(pH6.5，0.1mol/L NaHCO3，0.5mol/L NaCl)在小型层析系统上洗涤至无蛋白为止(280nm/OD≤0.01)，TBS缓冲液(pH8.0，0.1mol/LTris/HCl，0.5mol/L NaCl)平衡过夜。6.0mg IgY抗体粗品加少量的PBS缓冲液(pH5.5，20mmol/L)溶解，以0.02ml/每分钟的泵速上样于亲和柱，用TBS缓冲液(pH8.0，0.1mol/L Tris/HCl，0.5mol/L NaCl)洗涤无杂蛋白为止(280nm/OD≤0.01)，用甘氨酸缓冲液(pH3.0，0.1mol/L Glycine)洗脱IgY抗体，以0.01ml/每分钟的泵速收集洗脱峰。将1.0ml/管的洗脱峰分别进行蛋白含量及免疫活性测定，最后合并洗脱峰，调溶液pH至8.0，加等量的甘油至50％，加NaN3至0.05％，-20℃保存。
实施例7抗体的纯度测定。
按常规的天然胶(Native gel)电泳，IEF电泳对纯化的IgY抗体进行了纯度、分子量、等电点测定。SDS电泳中标记分子量的标准蛋白为MW9.3-183.2Kd，IEF水平等电聚焦电泳条件2000V，50mA，20W，4℃，70分钟。蛋白质样品等电点测定用表面pH电极以0.5cm等距测定凝胶的pH梯度后作标准曲线求得。
实施例8免疫沉淀。
将培养处于对数期的细胞(CEM TK+，CEM TK-，LM TK+，LM TK-)用PBS缓冲液洗涤，800×g离心，重复处理2次。离心的沉淀部分按细胞数40×106细胞/ml，加入1ml样品缓冲液(pH7.6，10mmol/L Tris，5.0mmol/L MgCl2，5.0mmol/LNaF，250mmol/L蔗糖，1.0mmol/L PMSF，2.0mmol/LDDT，0.25％NP-40)，放冰浴里保温30分钟，8,000×g离心5分钟，离心的上清液加甘油至50％，-70℃保存。1.0ml细胞提取液(1mg蛋白/ml)加30μg亲和层析纯化的IgY抗体，在4℃下过夜，然后加入生物素化-羊抗鸡IgG抗体(1mg/ml)2μl混匀，冰浴放置2小时后加入蛋白G-Sepharose，4℃下转动30分钟。以15,000×g离心的沉淀物用3倍体积的细胞抽提缓冲液洗涤后，再改用2倍体积的pH7.6，10mmol/L Tris/HCl缓冲液洗涤，最后得到的沉淀物用IgY抗体作Western Blot分析。
实施例9ECL Western Blot分析。
用培养的对数期细胞(CEM+，CEM-)抽提液进行SDS电泳；天然胶电泳，将电泳凝胶上的蛋白质用Trans-Blot半干电转移仪转移到PVDF转印膜上，晾干保存。将蛋白转移的PVDF膜片在甲醇中浸30秒，用双蒸水洗去膜上的甲醇。加10％脱脂奶粉/TBS缓冲液(pH7.5，20mmol/L Tris，0.15mol/L NaCl)于每个反应槽中，室温下震摇4小时。移去槽中的溶液，用TBST缓冲液(pH7.5，20mmol/L Tris，0.15mol/L NaCl，0.1％吐温-20)震摇洗涤3次(15分钟/每次)，加生物素化羊抗鸡-IgG抗体(按反应的缓冲液体积，以1∶2万倍稀释抗体)，室温下震摇反应1小时。用TBST缓冲液震摇洗涤3次(15分钟/每次)，加入抗生物素蛋白-HRP(按反应的缓冲液体积，以1∶1.5万倍稀释)，室温下震摇反应1小时。移去反应液，用TBST缓冲液洗涤3次。加ECL发光试剂精确反应1分钟，甩干后加上一层薄膜，迅速移去膜里的空气，放入底片夹内与X光胶片夹紧，在暗室内感光2～5分钟后，立即显影、定影，然后进行蛋白印迹图谱分析。
实施例10免疫组化及图像分析。
TK1-IgY抗体染色采用石腊包埋切片，常规ABC-免疫组化染色法处理肿瘤组织标本，第一抗体，即抗TK1-IgY抗体稀释1∶200-400，作为第二抗体的生物素化-羊抗鸡抗体为1∶200稀释，作为过氧化物酶的联接复合物(抗生物素蛋白-HRP)以1∶100稀释。图像分析时，用正常组织，癌组织及癌旁区的免疫组化切片各6个视野进入程序测定，结果以100个细胞计算染色强度指数，0表示0-5％的细胞染色；+表示有5-25％细胞染色；++表示有25-50％；+++表示50％以上的细胞染色。
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权利要求
1.一种以人宫颈癌细胞(HeLa)TK1C-端的活性多肽作半抗原，其特征在于hTK1单体C端-31肽分子的氨基酸序列K195GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ 225。
2.根据权利要求1所述的抗原，对免疫制备IgY抗体纯化的方法，其特征是制备亲和柱和亲和层析法纯化IgY。
3.根据权利要求2所述纯化方法，在制备亲和柱时，其特征是经CNBr活化的Sepharose4 Fast Flow冷冻干燥凝胶和TK1-31肽的配比比例是150∶1。
4.根据权利要求2所述纯化方法，在亲和层析纯化IgY时，其特征是用甘氨酸缓冲液洗脱IgY抗体，其中甘氨酸的摩尔浓度是0.1mol/L，pH3.0。
5.一种对抗细胞质胸苷激酶-IgY抗体进行鉴定的方法，其特征在于SDS电泳中TK单体蛋白的标记分子量为25Kd，pI8.3。
6.一种对抗细胞质胸苷激酶-IgY抗体进行免疫沉淀的方法，其特征在于1.0ml细胞提取液(1mg蛋白/ml)加30μg经亲和层析纯化的IgY抗体。
7.一种增强化学发光点印迹肿瘤诊断组合物，包括抗细胞质胸苷激酶-IgY抗体、羊抗鸡生物素化IgG、辣根过氧化物酶(HRP)、ECL Western Blot检测试剂和硝基纤维素膜为有效成份。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征是抗细胞质胸苷激酶-IgY抗体的稀释比例为1∶10000-20000。
9.一种免疫组化肿瘤诊断组合物，包括抗细胞质胸苷激酶-IgY抗体、羊抗鸡生物素化IgG、辣根过氧化物酶(HRP)为有效成份。
10.根据权利要求9所述组合物，其特征是抗细胞质胸苷激酶-IgY抗体的稀释比例为1∶200-400。
全文摘要
本发明涉及用人宫颈癌细胞(HeLa)TK1的C－端31肽作为抗原，制备抗细胞质胸苷激酶－IgY抗体以及用上述抗体制备的试剂盒在肿瘤诊断中的应用。TK1的C－端31肽的氨基酸序列为K195GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ 225。本发明同时提供了应用该抗原制备的抗细胞质胸苷激酶－IgY抗体及试剂盒产品的制备工艺和检测方法，本发明提供的抗体试剂盒具有检测灵敏度高、抗体理化性质稳定，检测成本低廉等特点，通过增强化学发光点印迹检测法和免疫组化检测法能够定性和定量地对多种肿瘤进行早期检测、鉴别和预后监测。
文档编号C07K16/18GK1414017SQ0213472
公开日2003年4月30日 申请日期2002年9月13日 优先权日2002年9月13日
发明者Q何, 吴传京 申请人:深圳市华瑞同康生物技术有限公司