专利名称：一种海葵细胞毒素基因及其表达、应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种海葵细胞毒素新基因。本发明还涉及上述基因的表达及其编码的蛋白在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用。
背景技术：
海葵(anthopleura)属于腔肠动物门(soelenterata)的珊瑚纲(anthozoa)，是海洋中较原始的动物类。在长期的生物进化过程中，为了抵御敌害及捕获食物，海葵触手的刺丝囊能够分泌多种海葵毒素，基本上是多肽类毒素，对人和动物有多种生理活性作用。根据海葵毒素的生理功能将其分为3类海葵神经毒素、海葵溶细胞素及海葵钾离子通道抑制剂。
具有细胞毒作用的海洋生物毒素已作为筛选抗癌及抗病毒制剂的来源之一。在海洋生物中发现多种多肽溶细胞毒素。这些海洋生物包括海葵、水母、海藻，海胆、海兔、海绵等。海葵溶细胞素可以破坏细胞的结构，主要是作用于细胞膜，与细胞膜的脂类或蛋白质结合，使之穿孔溶解。海葵溶细胞素是一类碱性蛋白，分子量约20kDa，含有30多个强碱性氨基酸，缺乏半胱氨酸，具有溶细胞性、心脏毒性及其他活性。其二级结构含有α螺旋、β折叠、β转角和随机卷曲结构；与膜结合后α螺旋、β折叠则有所增加，随机卷曲结构则减少。海葵溶细胞素至少有两个区域直接参与膜脂(磷脂酰胆碱、鞘氨醇、神经节苷脂)或膜蛋白的结合N末端的双亲α螺旋(氨基酸残基13-20)和富含色氨酸区域(氨基酸残基105-120)；双亲α螺旋插入细胞膜，而富含色氨酸区域的亲水区域为反向β折叠结构，伸展在细胞膜表面，精氨酸、苏氨酸及附近的氨基酸能与膜脂的极性端作用，这种和膜脂的作用方式与细菌类溶细胞素不同(细菌类溶细胞素的α螺旋是与细胞膜中的胆固醇结合，形成大的孔洞，溶解细胞膜)；海葵溶细胞素可作为真核生物溶细胞素的模型。海葵溶细胞素往往形成寡聚体起作用，其作用方式可描述为溶于水的海葵溶细胞素→与细胞膜或膜受体结合→插入细胞膜→形成寡聚体→形成膜孔道→细胞裂解。例如从海葵(Stichodactyla helianthus)分离的一种溶细胞素SticholysinII，形成四聚体，插入细胞膜形成阳离子通道，破坏细胞。
海葵溶细胞素表现出多种生物学活性；溶血活性、细胞毒性、心脏刺激活性、阻断钾离子通道等。从海葵(Heteractis magnifica)中分离的HmT对人红细胞的半溶解浓度为0.15ug/ml。从海葵(Actinia equina)分离的Equinatoxin II对老鼠的半致死浓度为35ug/kg，致死原因是心肌缺血；实验表明，Equinatoxin II可直接作用于心脏，毒性与毒素的浓度相关，引起心室压降低，使血液交换减慢的域值为0.1-1nM。Stichlysin I、Stichlysin II、Equinatoxin II对病原体Giardia(一种原生动物)有杀伤作用，LC50分别为0.5nM、1.6nM、0.8nM。在Ca++存在时，Equinatoxin II(100nM)可明显使神经细胞瘤NG108-15膨大破裂。Cytolysin III可杀伤体外培养的Ehrlich ascitic肿瘤细胞，对接种于小鼠的该肿瘤也有一定的抑制作用。对海葵新的细胞毒素的进一步的研究，有望获得某些具有心血管作用的药物或抗癌及抗病毒制剂。
海葵溶细胞素可以在E.Coli中进行融合表达，重组蛋白的溶细胞活性和细胞毒活性与天然蛋白活性相当，但在N末端加上额外氨基酸就降低重组蛋白的活性，额外氨基酸越多重组蛋白活性越低。N末端加上的额外氨基酸干扰了α螺旋与细胞膜的作用，降低毒素的活性。
目前，已经测定了一些海葵溶细胞毒素的二级结构，但是这些毒素的高级结构、分子作用机制、膜插入和寡聚体的形成的具体细节还不清楚。不过，最近得到了高分辨率的毒素蛋白晶体结构(包括水溶状态、膜结合状态和膜孔形成状态)，对阐明海葵溶细胞毒素的高级结构、分子作用机制、膜插入和寡聚体的形成是有帮助的。
发明内容本发明的目的在于提供一种新的海葵细胞毒素基因Src I。
本发明的另一目的在于提供上述新基因的表达。
本发明的另一目的在于提供上述新基因在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。
本发明所选择的海葵为玫瑰红绿海葵(Sagartia rosea)，采白广西壮族自治区北海市涠洲岛附近海域。
本发明构建了玫瑰红绿海葵毒腺cDNA表达文库首先分离海葵触手，提取总RNA，然后按Clontech公司SMARTTMcDNA LibraryConstruction Kit说明书的操作进行，获得双链cDNA，最后将双链cDNA连接到改造的质粒载体pcDNA3.0上并转化E.coli，从而构建成玫瑰红绿海葵毒腺的cDNA表达文库。
本发明通过对玫瑰红绿海葵毒腺的cDNA文库克隆的序列测定，从中得到了一个编码玫瑰红绿海葵溶细胞素的cDNA克隆，编号为Src I。这个cDNA序列编码216个氨基酸的毒素前体蛋白，包括19个氨基酸的信号肽、19个氨基酸的propart motif和178个氨基酸的成熟蛋白，成熟蛋白的等电点为4.8，分子量为19,500道尔顿，是一种酸性蛋白，这是首次报道的酸性海葵溶细胞素。成熟蛋白的N末端具有海葵溶细胞素的典型特征，即具有双亲的α螺旋。
本发明通过设计一对特异引物，将编码玫瑰红绿海葵溶细胞素成熟蛋白的核苷酸序列用PCR方法从pcDNA3.0载体上扩增出来，克隆到原核表达载体pBV220上，构建成表达质粒pBV220-Src I并将其转化大肠杆菌DH5α。经过对培养时间、培养温度、诱导时间等条件的摸索和优化，重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的15％以上，并且基本上处于不溶的包涵体状态。
上述的引物根据Src I基因编码的成熟蛋白两端序列和原核表达载体pBV220的多酶切位点合成，上游引物含有EcoR I酶切序列(GAATTC)和起始密码子(ATG)，下游引物含有BamH I酶切序列(GGATCC)和终止密码子(TTA)，序列如下上游引物，5’GGAATTC ATC TCG GGT GGT ACT GTT ATT 3’EcoR I酶切序列 起始密码子下游引物，5’TAGGATCC TGG CCA GAC GAC TTC AAT C 3’BamH I酶切序列 终止密码子本发明还摸索和优化了重组Src I蛋白的纯化条件，通过包涵体的洗涤、变性、复性和离子交换层析，可得到纯度达98％以上的重组Src I蛋白。
本发明获得的重组海葵细胞毒素具有生物活性。
本发明获得的重组Src I蛋白对体外培养的肝癌细胞BEL-7401、胃癌细胞BGC-823、肺癌细胞Nsclc有明显的作用，IC50分别为31.2ug/ml、3.1ug/ml、3.1ug/ml。
本发明获得的重组Src I蛋白对NIH小鼠进行腹腔注射，对接种于小鼠的肝癌实体瘤和S-180实体瘤有明显的抑制作用，抑瘤率分别为39.5％、26.5％，使用浓度分别为0.6mg/kg、1.2mg/kg。
本发明构建了Src I海葵细胞毒素成熟蛋白编码序列的表达质粒pBV220-Src I，由该表达质粒载体经EcoRI I/BamH I双酶切，可得到534bp的片段，即为玫瑰红绿海葵细胞毒素Src I成熟肽编码序列。
本发明通过设计另一对特异引物，将编码玫瑰红绿海葵溶细胞素的成熟蛋白核苷酸序列用PCR方法从pcDNA3.0载体上扩增出来，克隆到穿梭质粒pshuttle上，构建重组质粒pshuttle-Src I，该质粒通过PI-SceI/I-CeuI双酶切后与真核表达载体Adeno-X相连，构建成重组腺病毒Adeno-Src I质粒，Adeno-Src I的DNA通过PacI酶切后在人胚肾细胞HEK293包装成病毒粒子。重组腺病毒可在真核细胞中表达，用于相关疾病的治疗。
上述引物根据Src I基因编码的成熟蛋白两端序列和穿梭质粒pShuttle的多酶切位点合成，上游引物含有Apa I酶切序列(GGGCCC)和起始密码子(ATG)，下游引物含有NotI酶切序列(GCGGCCGC)和终止密码子(TTA)，序列如下上游引物，5’GGGGGCCC ATCTCGGGTGGTACTGTTATTG 3’Apa I酶切序列 起始密码子下游引物，5’GTCATGCGGCCG C TGGCCAGACGACTTCAATC 3’NotI酶切序列 终止密码子本发明的表达质粒载体的复制方法参照Sambrook(Sambrook，etal.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基转化细菌，碱法提取质粒。
图1为玫瑰红绿海葵触手总RNA电泳结果；图2为玫瑰红绿海葵触手双链cDNA电泳结果；图3为玫瑰红绿海葵触手cDNA文库总质粒、SfiI酶切和PCR检测电泳结果；图4为玫瑰红绿海葵触手cDNA文库重组子的PCR检测电泳结果；图5为含基因Src I的重组质粒pBV220-Src I表达质粒构建；图6为玫瑰红绿海葵Src I基因的PCR产物电泳结果；图7为含基因Src I的pBV220-Src I表达质粒酶切和PCR鉴定电泳结果；图8为重组Src I蛋白的表达、包涵体变性、复性和离子交换层析的SDS-PAGE；图9为重组Src I蛋白等电点图；图10为重组Src I蛋白的溶血曲线图；图11为重组Src I蛋白作用人肝癌细胞BEL-7402的光镜照片；图12为重组Src I蛋白作用人肝癌细胞BEL-7402的荧光照片；图13为重组Src I蛋白作用人胃癌细胞BGC-823的光镜照片；图14为重组Src I蛋白作用人胃癌细胞BGC-823的荧光照片；图15为重组Src I蛋白作用人肺癌细胞Nsclc的结果；图16为Adeno-Src I表达系统的构建；图17为重组腺病毒Adeno-Src I的PI-SceI/I-CeuI酶切鉴定；图18为重组腺病毒Adeno-Src I的PacI酶切。图1中，1RNA ladder(Promega公司)；2玫瑰红绿海葵触手总RNA。图2中，11kb DNA ladder(Promega公司)；2玫瑰红绿海葵触手dsDNA。图3中，11kb DNA ladder(Promega公司)；2文库总质粒的PCR结果；3文库总质粒；4文库总质粒的SfiI酶切结果。图4中，M1kb DNA ladder(Promega公司)；1-21文库重组子的PCR检测。图6中，11kb DNA marker(NEB公司)；2玫瑰红绿海葵Src I基因的PCR产物。图7中，11kb DNA marker(NEB公司)；2pBV220-Src I的EcoRI/BamHI双酶切；3pBV220-Src I的PCR鉴定。图8中，1marker；2未诱导的总菌体；342℃诱导的总菌体；4超声上清；5超声沉淀；6包涵体经洗涤的上清；7复性后的Src I经离子交换层析的0.3M Nacl洗脱峰；8复性后的Src I经离子交换层析的0.8M Nacl洗脱峰。图9中，1marker；2Src I重组蛋白。图17中，1Adeno-Src I的PI-SceI/I-CeuI酶切；21kb DNA marker(NEB公司)。图18中，1Adeno-Src I的PacI酶切；21kb DNA marker(NEB公司)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明，将有助于本领域的普通技术人员理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例一 玫瑰红绿海葵毒腺cDNA文库的构建玫瑰红绿海葵毒腺总RNA的提取参考《现代分子生物学实验技术》的一步快速热酚抽提法进行；cDNA的合成按Clontech公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit说明书操作。
采用异硫氰酸胍一步法提取的毒腺总RNA经1％甲醛变性胶电泳检测可见清晰的28S、18S两条rRNA条带，如图1，表明总RNA完整性良好。采用SMARTTMcDNA Library Construction Kit合成的cDNA在1％的琼脂糖凝胶上电泳，结果呈现均匀的smear，如图2，大小在200bp到8kb的范围内，主要是在3kb以下的区域，在500bp附近更为集中，表明cDNA的完整性良好。将cDNA插入质粒载体pcDNA3.0上构建成cDNA表达文库，文库克隆数为2.4×105。提取总文库质粒进行酶切和PCR分析，如图3，结果表明cDNA插入片段大小落在300bp-8kb的范围内，挑取172个克隆提取质粒，酶切和PCR鉴定表明超过95％的克隆为重组子，如图4，表明该cDNA表达文库具有较好的质量。
实施例二 玫瑰红绿海葵触手cDNA文库的克隆、序列测定和分析挑选玫瑰红绿海葵触手cDNA文库的克隆，按Omega Biotek PlasmidMiniprep Kit的方法提取质粒DNA。随机测定了150个cDNA序列。使用ABI PRISM 377 DNA Analyzer(Applied Biosystems)，采用T7和SP6通用引物为测序引物，进行正反向序列测定，对cDNA片段超过1000bp的序列，根据已测得的序列设计引物，继续测通cDNA。测序工作由广州市中山大学生命科学学院中心实验室完成。所得序列经BlastX初步分析。结果表明玫瑰红绿海葵毒腺cDNA文库包含的基因多种多样，其中毒素基因的丰度较高，有三个编码海葵神经毒素的cDNA序列和一个编码海葵溶细胞素的cDNA序列，其中编码溶细胞素的cDNA编号为Src I，如序列表所示，它编码216个氨基酸的蛋白，其中包括19个氨基酸残基的信号肽、19个氨基酸残基的propart motif和178个氨基酸残基的成熟蛋白，成熟蛋白的N末端具有海葵溶细胞素特征性α螺旋。成熟蛋白的分子量为19,500道尔顿，蛋白的等电点为4.8，是酸性溶细胞素。目前，所有报道的海葵溶细胞素为强碱性蛋白，等电点在9.0以上，在海葵中发现酸性溶细胞素尚属首次。
Src I的核苷酸序列及推测的氨基酸序列见序列表。以玫瑰红绿海葵触手总RNA为出发材料，根据已获得的溶细胞素cDNA序列设计3’端引物，以SMARTTMcDNA Library Construction Kit的文库构建引物为5’端引物，进行RT-PCR，在800bp处出现预期的特异扩增带，回收此带。将回收的PCR产物连接到pGEM-T Easy Vector，转化DH5α大肠杆菌，挑选阳性克隆测序。经测序分析证实，是我们所希望得到的目的基因，测定的8个克隆，为同一cDNA序列。
实施例三 重组玫瑰红绿海葵溶细胞素表达质粒的构建根据Src I基因编码的成熟蛋白两端序列和原核表达载体pBV220的多酶切位点，合成一对引物，序列如下上游引物，5’GGAATTC ATC TCG GGT GGT ACT GTT ATT 3’单下划线部分为EcoR I酶切序列，双下划线为起始密码子下游引物，5’TAGGATCC TGG CCA GAC GAC TTC AAT C 3’单下划线部分为BamH I酶切序列，双下划线为终止密码子PCR扩增、基因克隆皆按常规方法进行。PCR产物约600bp，编码178个氨基酸残基，如图6。将目的基因克隆到原核表达载体pBV220上，构建成表达质粒pBV220-Src I，构建过程见图5。经酶切鉴定和测序分析表明克隆的基因为目的基因如图7。
原核表达载体pBV220含PRPL启动子，同时含有cI调控基因，带有起始密码子的外源基因可插入启动子下游的多酶切位点，表达非融合蛋白，产品可供临床使用。
实施例四 重组玫瑰红绿海葵溶细胞素蛋白的表达将表达质粒pBV220-Src I转化大肠杆菌DH5α。含目的基因的工程菌在30℃生长到OD600＝0.5时，立即在42℃诱导4小时。收集菌体，经SDS-PAGE电泳分析表明基因工程菌经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与预测值20kD相符，如图8。薄层扫描分析表明在此条件下重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的17％以上，基本上处于不可溶的包涵体状态。
实施例五 重组玫瑰红绿海葵溶细胞素蛋白的纯化诱导后的菌体通过超声破菌，离心取沉淀，沉淀通过不同的缓冲溶液洗涤，去除杂蛋白，洗涤后的包涵体纯度为80％。在包涵体洗涤中用到的溶液有超声buffer(10mM Tris-Hcl，pH7.0，1mM EDTA)、buffer1(0.1M Tris-Hcl，pH8.0，10mM EDTA，0.5％Triton X 100)、buffer 2(50mMPB，0.5M Nacl，3M尿素)和buffer 3(0.1M Tris-Hcl，pH8.5，10mM EDTA，3M尿素)。
洗涤后的包涵体在变性液(8M尿素，10mM Tris-Hcl，pH8.0，10mMDTT)中溶解。将变性蛋白在复性液(3M尿素，20mM Tris-Hcl，pH8.0，0.1mM氧化型谷胱甘肽，0.9mM还原型谷胱甘肽)中通过透析复性。
复性蛋白通过离子交换层析和疏水层析可获得纯度在99％以上的重组蛋白，如图8。
实施例六 重组玫瑰红绿海葵溶细胞素蛋白等电点的测定通过平板电泳测定重组蛋白的等电点，等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳按常规方法进行。测定的结果为pH 4.81，如图9。与预测的等电点基本相符。
实施例七 重组海葵溶细胞素蛋白的溶血活性鉴定取人血5ml，加入3.8％的柠檬酸钠(柠檬酸钠血液为1∶9)，室温，3000rpm，离心5分钟。去上清，用Hank’s液洗涤红细胞，直到上清清亮(约需用Hank’s洗涤2-3次)，用Hank’s将红细胞配成0.5％或1％(v/v)的细胞悬液，将样品加入到2ml的红细胞悬液中，37℃温育20分钟，室温，3000rpm，离心5分钟，取上清，测定OD540。以Hank’s为阴性对照，用终浓度0.1mg/ml皂苷使红细胞100％溶血。每个浓度的样品做三个平行实验。结果如图10。
实施例八 重组海葵溶细胞素蛋白对体外培养的肿瘤细胞的作用将肿瘤细胞按1.0×106cell/ml接种于24孔板，当细胞生长到60％-70％汇合度时加入样品，每个样品浓度做4个平行实验，以Hank’s作为阴性对照。
细胞凋亡的荧光检测(Hoeches 55258染色法)用4％的多聚甲醛在4℃将细胞固定20分钟，用Hank’s洗涤2次，加入Hoeches 55258染液，终浓度为5-10ug/ml，在室温染色10分钟，用Hank’s洗涤2次，在荧光显微镜下观察。
将不同浓度的重组蛋白(0.31ug/ml、3.1ug/ml、7.8ug/ml、15.6ug/ml、31.2ug/ml、72.1ug/ml)加入到人肝癌细胞BEL-7402中，在0-36小时内观察，0.31-15.6ug/ml浓度的样品对细胞没有影响，在31.2ug/ml的浓度时能引起细胞形态明显的改变，如图11，细胞明显拉长，此现象在加入蛋白8小时后就比较明显，一直维持到36小时(36小时后没有观察)，光镜观察没有坏死现象，通过Hoeches 55258染色法染色没有观察到细胞凋亡的现象，如图12。从重组蛋白的溶血现象看，重组蛋白应能与细胞膜作用，从重组蛋白作用肝癌细胞BEL-7402的现象来看，重组蛋白不仅与细胞膜作用，还可能与膜上的蛋白作用，引起信号的改变，导致微管、微丝等的变化，引起细胞形态的改变。
将不同浓度的重组蛋白(0.31ug/ml、3.1ug/ml、7.8ug/ml、15.6ug/ml、31.2ug/ml、72.1ug/ml)加入到人低分化胃癌细胞BGC-823中，加入样品后进行观察，6小时后，3.1ug/ml的样品浓度就可使细胞变圆变小，如图13，经荧光染色，可见细胞核明显变小，胞质仅剩包裹在核外的一薄层，如图14。
将不同浓度的重组蛋白(0.31ug/ml、3.1ug/ml、7.8ug/ml、15.6ug/ml、31.2ug/ml、72.1ug/ml)加入到人非小细胞肺癌Nsclc中，加入样品后进行观察，6小时后，3.1ug/ml的样品浓度就可使细胞膨大、破裂，如图15，经Hoeches 55258染色可知，细胞并非凋亡，绝大多数细胞坏死。
实施例九 重组海葵溶细胞素蛋白对小鼠肝癌(Heps)和肉瘤S-180的抗肿瘤试验重组蛋白的抑瘤试验按常规方法进行；动物为NIH小鼠，由第一军医大学试验动物中心提供(2000A037)；给药方法为腹腔注射；阴性对照为生理盐水，阳性对照为环磷酰胺；试验由广东省职业卫生检验中心完成；试验结果见表1，2。
纯化的重组蛋白对NIH小鼠进行腹腔注射，对接种于小鼠的肝癌实体瘤和S-180实体瘤均有抑制作用，对肝癌实体瘤的抑瘤率为39.1％，作用浓度为0.6mg/kg；对S-180实体瘤的抑瘤率为26.9％，作用浓度为1.16mg/kg。
表1 重组Src I蛋白对于小鼠肝癌实体瘤(Heps)的抑制作用剂量组动物数 体重 瘤重 抑瘤率P值(mg/ml) 开始 结束开始 结束(Mean±Sd)(％)09 9 18.2 22.41.89±0.65 - -0.0659 9 18.0 21.61.15±0.5639.15＜0.05Cp，20 1010 18.5 19.40.72±0.2761.90＜0.01P值与对照组比较，方差分析。
表2 重组Src I蛋白对小鼠肉瘤(S-180)的抑制作用剂量组 动物数 增加体重 瘤重抑瘤率 胸腺指数 脾指数 肝指数(mg/ml) 开始 结束 (g) (g)(％) (1/1000) (1/1000) (1/100)0 10102.58±2.24 1.53±0.44 - 3.28±0.854.93±1.62 5.35±0.62Cp，20 10101.23±1.29 0.64±0.2558.33▲▲2.16±0.40▲▲4.07±1.02 5.80±0.560.116 10103.26±1.07 1.12±0.5826.87▲3.41±0.786.54±1.76▲5.54±0.550.031 10103.49±1.14 1.19±0.4715.56 3.29±0.605.79±0.78 5.26±0.52P值与对照组比较，方差分析。▲P＜0.05，▲▲P＜0.01实施例十 重组腺病毒Adeno-Src I的构建操作方法按Clontech公司的Adeno-XTMExpression System UserManual进行。根据Src I基因编码的成熟蛋白两端序列和穿梭质粒pShuttle的多酶切位点，合成一对引物，序列如下上游引物，5’GGGGGCCC ATCTCGGGTGGTACTGTTATTG 3’单下划线部分为Apa I酶切序列，双下划线为起始密码子下游引物，5’GTCATGCGGCCG C TGGCCAGACGACTTCAATC 3’单下划线部分为NotI酶切序列，双下划线为终止密码子PCR扩增、基因克隆、质粒提取等按常规方法进行。将PCR产物克隆到穿梭质粒pShuttle上，构建成pShuttle-Src I质粒；pShuttle-Src I通过PI-SceI/I-CeuI双酶切后与腺病毒载体连接，构建成重组腺病毒Adeno-SrcI；重组腺病毒Adeno-Src I经过PacI酶切，如图18，后转染人胚肾HEK293细胞，在HEK293细胞中包装成病毒粒子，提取的重组腺 病毒可用于体外细胞和体内试验，产品可供临床使用。重组腺病毒的构建详细过程见图16。经酶切鉴定和测序分析表明克隆的基因为目的基因，如图17。
序列表<110>中山大学<120>一种海葵细胞毒素基因及其表达、应用<130><140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>749<212>DNA<213>玫瑰红绿海葵(Sagartia rosea sp)<220><221>CDS<222>(54)..(701)<220><221>sig_peptide<222>(54)..(110)<220><221>mat_peptide<222>(168)..(701)<220><221>precursor_RNA<222>(110)..(167)<400>1agttcaagtc aaaagatacc cctttcattg ctggaaagat tgaacgtcaa atc atg 56Metagt cgc ctg atc gtc gtt tgc att gtc att tcg atg ata tgc gga gcc 104Ser Arg Leu Ile Val Val Cys Ile Val lle Ser Met Ile Cys Gly Ala-35 -30 -25ctt tcc ttg tcg tca acc aag atg gct gat gaa aaa aaa gaa aaa gat 152Leu Ser Leu Ser Ser Thr Lys Met Ala Asp Glu Lys Lys Glu Lys Asp-20 -15 -10gaa gac gag aaa ccc aaa atc tcg ggt ggt act gtt att gca gct ggg 200Glu Asp Glu Lys Pro Lys Ile Ser Gly Gly Thr Val Ile Ala Ala Gly-5 -1 1 5 10aga ttg acc ctg gat ctc ttg aaa acg ttg ctc ggt aca ctt ggt agt 248Arg Leu Thr Leu Asp Leu Leu Lys Thr Leu Leu Gly Thr Leu Gly Ser15 20 25atc tct aga aag att gca att ggt gtt gac aac gag acg ggt ggg cta 296Ile Ser Arg Lys Ile Ala Ile Gly Val Asp Asn Glu Thr Gly Gly Leu30 35 40att aca gga aat aac gta tat ttc cgt tcc ggg acc tct gat gac atc 344Ile Thr Gly Asn Asn Val Tyr Phe Arg Ser Gly Thr Ser Asp Asp Ile45 50 55ctc cct cat cgt gtg gaa act ggt gaa gcg ctt ctc tat aca gct cgc 392Leu Pro His Arg Val Glu Thr Gly Glu Ala Leu Leu Tyr Thr Ala Arg60 65 70 75aaa act aaa ggc cca gtc gca aca ggt gcc gtt gga gta ttt act tat 440Lys Thr Lys Gly Pro Val Ala Thr Gly Ala Val Gly Val Phe Thr Tyr80 85 90tac ttg agc gat gga aac aca ctg gca gtg tta ttc agc gtc ccc ttt 488Tyr Leu Ser Asp Gly Asn Thr Leu Ala Val Leu Phe Ser Val Pro Phe95 100 105gat tat aac ttc tac agc aac tgg tgg aat gtc aag atc tat tca gga 536Asp Tyr Asn Phe Tyr Ser Asn Trp Trp Asn Val Lys Ile Tyr Ser Gly110 115 120aaa cgg aat gcg gac tat gat atg tac cat gag ctg tac tat gat gcg 584Lys Arg Asn Ala Asp Tyr Asp Met Tyr His Glu Leu Tyr Tyr Asp Ala125 130 135aat cca ttc gag ggg gac gat acc tgg gag tat aga tac ctt gga tat 632Asn Pro Phe Glu Gly Asp Asp Thr Trp Glu Tyr Arg Tyr Leu Gly Tyr140 145 150 155gga atg agg atg gaa ggt tac atg aac agc ccc gga gaa gcg att ctt 680Gly Met Arg Met Glu Gly Tyr Met Asn Ser Pro Gly Glu Ala Ile Leu160 165 170aag atc acg gtg atg ccc gat tgaagtcgtc tggccaaagc aaaaaaaaaa 731Lys Ile Thr Val Met Pro Asp175aaaaaaaaaa aaaaaaaa 749<210>2<211>216<212>PRT<213>玫瑰红绿海葵(Sagartia rosea sp)<400>2Met Ser Arg Leu Ile Val Val Cys Ile Val Ile Ser Met Ile Cys Gly-35 -30 -25Ala Leu Ser Leu Ser Ser Thr Lys Met Ala Asp Glu Lys Lys Glu Lys-20 -15 -10Asp Glu Asp Glu Lys Pro Lys Ile Ser Gly Gly Thr Val Ile Ala Ala-5 -1 1 5 10Gly Arg Leu Thr Leu Asp Leu Leu Lys Thr Leu Leu Gly Thr Leu Gly15 20 25Ser Ile Ser Arg Lys Ile Ala Ile Gly Val Asp Asn Glu Thr Gly Gly30 35 40Leu Ile Thr Gly Asn Asn Val Tyr Phe Arg Ser Gly Thr Ser Asp Asp45 50 55Ile Leu Pro His Arg Val Glu Thr Gly Glu Ala Leu Leu Tyr Thr Ala60 65 70Arg Lys Thr Lys Gly Pro Val Ala Thr Gly Ala Val Gly Val Phe Thr75 80 85 90Tyr Tyr Leu Ser Asp Gly Asn Thr Leu Ala Val Leu Phe Ser Val Pro95 100 105Phe Asp Tyr Asn Phe Tyr Ser Asn Trp Trp Asn Val Lys Ile Tyr Ser110 115 120Gly Lys Arg Asn Ala Asp Tyr Asp Met Tyr His Glu Leu Tyr Tyr Asp125 130 135Ala Asn Pro Phe Glu Gly Asp Asp Thr Trp Glu Tyr Arg Tyr Leu Gly140 145 150Tyr Gly Met Arg Met Glu Gly Tyr Met Asn Ser Pro Gly Glu Ala Ile155 160 165 170Leu Lys Ile Thr Val Met Pro Asp17权利要求
1.一种海葵细胞毒素基因Src I，来源于玫瑰红绿海葵毒腺cDNA文库，核苷酸序列如序列表所示。
2.如权利要求1所述的基因，其特征在于编码216个氨基酸的毒素前体蛋白，包括19个氨基酸的信号肽、19个氨基酸的propart motif和178个氨基酸的成熟蛋白，成熟蛋白的等电点为4.8，分子量为19，500道尔顿，是一种酸性蛋白，成熟蛋白的N末端具有海葵溶细胞素的典型特征，即具有双亲的α螺旋，氨基酸序列如序列表所示。
3.一种重组原核表达载体，其特征在于含权利要求1所述的基因SrcI，是将其克隆到原核表达载体pBV220上构建成的非融合表达载体pBV220-Src I。
4.一种重组真核表达载体，其特征在于含有如权利要求1所述的基因Src I，是将其克隆到穿梭质粒pshuttle上，构建重组质粒pshuttle-Src I，并通过PI-SceI/I-CeuI双酶切后与真核表达载体Adeno-X相连，构建成的重组真核表达载体Adeno-Src I。
5.一种用作引物的DNA片段，其特征在于由权利要求1所述基因编码成熟蛋白两端序列和原核表达载体pBV220的多酶切位点合成，上游引物含有EcoR I酶切序列(GAATTC)和起始密码子(ATG)，下游引物含有BamH I酶切序列(GGATCC)和终止密码子(TTA)，序列如下上游引物，5’GGAATTC ATC TCG GGT GGT ACT GTT ATT 3’EcoR I酶切序列 起始密码子下游引物，5’TAGGATCC TGG CCA GAC GAC TTC AAT C 3’BamH I酶切序列 终止密码子
6.一种用作引物的DNA片段，其特征在于由权利要求1所述基因编码的成熟蛋白两端序列和穿梭质粒pShuttle的多酶切位点合成，上游引物含有Apa I酶切序列(GGGCCC)和起始密码子(ATG)，下游引物含有NotI酶切序列(GCGGCCGC)和终止密码子(TTA)，序列如下上游引物，GGGGGCCC ATCTCGGGTGGTACTGTTATTG 3’Apa I酶切序列 起始密码子下游引物，5’GTCATGCGGCCG C TGGCCAGACGACTTCAATC 3’NotI酶切序列 终止密码子
7.如权利要求2所述蛋白在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新的海葵细胞毒素基因SrcI，该基因编码216个氨基酸的毒素前体蛋白，包括19个氨基酸的信号肽、19个氨基酸的propart motif和178个氨基酸的成熟蛋白，成熟蛋白的分子量为19,500道尔顿，等电点为4.8，是一种酸性海葵溶细胞素。本发明还公开了该新基因的表达及应用，设计了两对引物，分别构建了重组原核表达载体pBV220－SrcI和重组真核表达载体Adeno－SrcI。本发明的重组海葵细胞毒素具有抗肿瘤活性；本发明建立了玫瑰红绿海葵溶细胞素的大肠杆菌表达系统和腺病毒表达系统，可用于开发新的抗肿瘤药物。
文档编号C07K14/435GK1405311SQ0213465
公开日2003年3月26日 申请日期2002年9月3日 优先权日2002年9月3日
发明者徐安龙, 姜孝玉, 彭立胜, 涂洪斌, 陈慧萍, 杨文利 申请人:中山大学