专利名称：海葵荧光蛋白新基因及其克隆、表达与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新基因，特别是一种海葵荧光蛋白新基因hmGFP。本发明还涉及上述海葵荧光蛋白新基因hmGFP的克隆、表达及应用。
背景技术：
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物的生物发光蛋白，当受到紫外光或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。来源于水母(Aequora victoria)的GFP基因是目前被克隆并研究得最为透彻和应用最为广泛的荧光蛋白。早在六十年代初期，Shimomura等首先从多管水母(Aequoria victoria)中分离出一种称为aequoria的蛋白，该蛋白在结合钙离子后可发射蓝光，当时称为光蛋白(photoprotein)。1994年Chalfie首次在异源细胞中表达了能发射绿色荧光的GFP，从而开创了GFP应用之先河，引起学者们的广泛兴趣。对水母GFP基因的一级结构密码子、晶体结构以及发光机制等方面进行了详尽的研究。
一级结构全长的GFP对荧光的发生是必需的，但是吸光的生色团只定位于64-69六肽间。而这个区域中Ser65-Try66-Gly67是最小生色团的环三肽，其生成的4-(对-羟基苯亚甲基)咪唑-5-啉酮是自催化反应的基础。
晶体结构水母中的GFP的晶体结构于1996年报道，是由11条β蛋白绕成一个圆柱体，一条α螺旋缠绕在圆柱体的轴位子。生色团附在螺旋上，几乎完全包埋在圆柱体的中心；被称为β-桶结构。通过对海葵及珊瑚中的GFP基因研究发现在各种荧光蛋白β-桶状结构即GFP中S65-T66-G67组成生色团被很好的保存下来；故而可以推测各种颜色的荧光蛋白是从同一个荧光蛋白祖先独立演化而来的。与GFP比较，其N短序列保守性较高，所以β-片层7-10同源性高，但C端不保守，致使有半β-桶结构的出现。GFP中主要的二级结构单元β-桶结构有较高的保守性，体现在β域与拐角域和桶帽结构的变更上。
光的吸收与荧光性质水母中的GFP受紫外光或蓝光(λmax＝395nm，λmin＝470nm)激发时发出绿光(λmax＝510nm)，GFP的荧光十分稳定没有光漂现象发生。各种颜色的荧光蛋白从水螅、珊瑚、海葵等腔肠动物体中提取出来。在海葵Anemonia sulcata中除发现绿色荧光蛋白(λmax＝499nm)外，还获得会产生痕量的红色荧光的非自然发光的GFP同源物(λmax＝565nm)。这种荧光有其特殊性绿光能增强其光密度，而蓝光则相反，有抑制作用。单个碱基的变动会使荧光量显著增强，可能是因为使蛋白恢复了原始荧光状态。该荧光可忍受热、去污剂和PH的变化而稳定存在，并且该蛋白具有可逆变性的能力。
发光机制GFP已成为检测体内基因表达及细胞内蛋白质原位定位的十分重要的报告分子。但是其发光机制和决定其参数的结构特征还是不清楚。对其他物种GFP同源物的克隆和比较分析将加深对GFP蛋白的认识。从GFP第一次报道以来，普遍认为GFP与生物发光紧密联系着，故而研究集中在发光生物。然而通过对海葵及珊瑚中的GFP基因研究发现，GFP并非一定是生物发光系统组成部分，不发光的生物中也有GFP的存在，但可能与动物的荧光显色有关。虽然基本的物理法则在整个自然界都一样，但是存在广泛的变种。这表明生物发光独立地在不同的动植物种类相对演化，多是通过联合和前功能域的调整。β-桶结构Arg96的参与是必需的，它是催化成环的关键残基。66与67位残基是保守的，而65位丝氨酸可被Gln，Arg，Lys替换。65位氨基酸的同一性是由蛋白核的结构特性决定的。GFP中另一个保守氨基酸是Glu222，它有维持中性酚生色团和酚盐阴离子生色团平衡的作用。
与现有的标记物相比，GFP具有无可比拟的优势，GFP在生命学科中的应用具有非常美好的前景。如报告活细胞内的基因表达和基因定位，细胞分化和增殖，转基因生物等。GFP荧光发射无种属依赖性；荧光是蛋白的内在属性，由其一级结构所决定；不需要辅助因子或酶的参与，因而不受底物的限制；荧光信号对光漂白具有高抗性；另外，在细菌和真核细胞中表达的GFP无明显毒性作用且对细胞无损伤；而且GFP的荧光在用甲醛处理后仍然保留，所以还可以进行固定操作；检测手段方便，可用荧光显微镜、FACS或显微成象技术在活细胞中检测。如今GFP作为报道基因，正在扩大其应用领域。
(一)研究基因表达的调控元件和蛋白质定位1.用GFP作报道基因可以很方便地进行基因调控元件的探测，比如用GFP基因作报道基因构建启动子探针载体，改造表达载体。
2.基因产物的亚细胞定位，将GFP基因和待研究的调控元件融合连接后，通过缺失、重组、诱变、竞争抑制等手段可确定调控元件的功能。例如在果蝇卵母细胞的胚胎发育过程中，bcd蛋白可诱导受精卵基因的表达，而bcd mRNA的定位需要exu基因。为了进一步证实这些基因间的相互作用，Wang等为此构建了gfp和exu的嵌合基因。他们发现在卵子发生中，融合蛋白在活体及固定的细胞内都有很强的荧光，融合蛋白营救了一个无效的exu等位基因，从而恢复了雌果蝇的生育能力。其在体内的表达及时间和空间上定位均与天然的EXU相同，并证实GFP标记物的高度敏感性是研究蛋白质亚细胞定位最理想的工具。
(二)研究基因表达的时序控制与空间定位由于gfp作报道基因可直接将基因表达的时间和空间联系起来，对研究基因表达的定位是最有效的手段。Marshall等构建了一种表达GFP-NMDAR1融合蛋白的嵌合基因，其重组蛋白是带有荧光标记的受体亚单位，用这种方法可以很方便的研究离子通道的表达、定位和运转过程。
(三)发育分子机理研究发育过程在细胞水平上看实际是细胞生长分化的结果；从分子水平上看，是基因在不同时间和空间选择性表达的结果。分子生物学虽然在短短几十年间取得了举世瞩目的成果，但离解开发育的基因调控和分子机理之谜，以致最终说明机体是如何由受精卵一步步发育成个体的过程还相差很远。而GFP可以作为活体标记，在原位观察细胞的生长和运动。这对那些透明的动物如线虫和斑马鱼来说，无疑是非常有效的。如Chalfie等用线虫meo-7基因(编码β-Tubulin)启动子控制gfp基因转化线虫(C.elegans)。GFP可在特定的神经元中表达，其在线虫发育过程中的表达情况可以非常方便地检测到。
(四)筛选新的药物由于GFP不干扰细胞的生长和功能，同时使用不同颜色的GFP衍生物标记相关的蛋白质，来观察单细胞内相互作用的靶蛋白，再借助于荧光激活细胞分离器、等焦显微镜分离出目的细胞，从而可方便地用于大规模筛选新的药物。
(五)用于临床检验可采用基因工程的方法生产GFP标记的抗原或抗体，以取代传统的免疫学标记方法，建立一种简便、快速的免疫诊断新技术。有人已将野生型GFP与HCV的核心抗原融合在一起，将突变株S65T与HBVe基因融合在一起，分别在大肠杆菌及昆虫细胞内进行了初步表达，并测定了融合蛋白的荧光光谱及抗原性，希望能应用于临床检验。GFP与一般的免疫标记物相比，有如下优点1.对光稳定；2.对抗原或抗体的标记效率达100％；3.由于是直接的抗原抗体反应，不需要再加任何底物，因而更加方便、快速，且没有背景的干扰。
(六)在其它方面的应用基于GFP如此优良的特性，最近GFP还被用作为转基因动物、转基因植物的筛选标记；用于研究病毒与宿主的相互关系；微生物在机体内的感染途径；此外GFP作为荧光材料在商业上也将有很好的应用前景。
野生型GFP用蓝光激发的荧光强度较低，蛋白的折叠极易受温度影响。因此，用定点突变等方法筛选更适合作为报告分子的GFP变种，乃GFP研究的热点之一。近年来，基于哺乳动物表达系统的偏好密码子的GFP突变体研究取得了重要进展。对wtGFP的缺点进行了很好的系统改良。
现在，已合成各种各样的N端或C端GFP融合蛋白，并且同时具有GFP和其配体的蛋白活性。克服了野生型GFP的一些缺点，如用蓝光激发时在470nm处的荧光强度较低、蛋白质生物合成GFP及通过蛋白质折叠产生荧光的过程明显滞后、复杂的光异构化、蛋白质折叠极易受温度影响以及其基因在某些种属的哺乳动物和植物细胞中的表达较低等，对作为报告分子极为不利。为提高GFP的报告分子能力各种GFP的变种已开发出来，它们在一定程度上改变了密码子，使之更适应宿主的偏好性，提高了GFP基因在宿主体内的转录。如pS65T-C1载体将生色团中65位的丝氨酸换为苏氨酸，该变种可发出6倍于野生型的荧光。pGFPmut1-C1和pEGF-C1载体不仅有S65到T65的改变，而且将64位的苯丙氨酸改为亮氨酸。GFPmut在488nm光的激发下荧光亮度是野生型的35倍；不仅如此，GFPmut1在细菌中的可溶性提高，而且折叠得更快。EGFP与其他GFP变种不同，它编码通过190多个碱基突变产生一个包括完全适用于人密码子的偏好性的开放读码框的EGFP基因。这使该载体能在哺乳动物及植物细胞中表达出EGFPmRNA，从而增强了EGFP的表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海葵荧光蛋白新基因hmGFP。
本发明的另一目的在于提供上述新基因的克隆。
本发明的另一目的在于提供上述新基因的表达。
本发明的另一目的在于提供上述新基因的应用。
本发明所选择的海葵属于巨型幅花海葵(Heteractis magnifica)，采集自广西北海海边滩涂。巨型幅花海葵触手cDNA文库的构建首先解剖分离到的巨型幅花海葵触手，提取总RNA；进行第一链合成，LD PCR cDNA扩增，酶切消化和柱回收cDNA构建表达文库；随机挑取小量文库克隆测序获得巨型幅花海葵荧光蛋白类似物基因EST；然后用PCR的方法从巨型幅花海葵触手文库总质粒中筛选克隆到荧光蛋白类似物基因的全长基因，根据所获得的荧光蛋白类似物基因EST3’端和载体核苷酸序列，设计引物，PCR扩增得到目的条带，将目的条带连接到T-easy载体，并转化E.coli挑选重组克隆。
本发明通过对以上重组克隆进行序列测定，克隆获得巨型幅花海葵荧光蛋白类似物基因的全长基因hmGFP，并通过基因工程方法表达出重组蛋白。该新基因hmGFP编码228个氨基酸的成熟肽，所表达的蛋白质等电点为7.89，分子量约为25,903道尔顿，具有典型的荧光蛋白一级结构的特征，分子内含有Phe62-Gln63-Tyr64-Gly65组成的最小生色基团的环肽。
本发明通过设计一对引物，将编码巨型幅花海葵荧光蛋白的新基因hmGFP用PCR方法从T载体上扩增出来，克隆到原核融合表达载体pTRX上，构建成表达质粒(pTRX-hmGFP)，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。
所述的引物依据巨型幅花海葵hmGFP基因的两端序列合成，在上游引物中引入Kpn I酶切位点(GGTACC)、ATG起始密码子以及一个Prescission ProtehmGe切割位点，下游引物中引入BamH I酶切位点(GGATCC)及终止密码子TTA，TCA。
上游引物(P1)5’-GGGGTACCCTGGAAGTTCTGTTCCAAGGTCCAATGKpn I Prescission ProtehmGe切割位点TATTCTTACATCAAAG-3’下游引物(P2)5’-CGGGATCCTCAGGAAATGATCATTTACGAAC-3’BamH I以含巨型幅花海葵hmGFP基因的pGEM-T easy质粒为模板，P1、P2为引物PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在750bp左右。PCR扩增产物先以Kpn I/BamH I双酶切后连接到BSK载体上构建成BSK-hmGFP，再以Kpn I/NotI的酶切克隆到原核融合表达载体pTRX上，构建成表达质粒载体(pTRX-hmGFP)。
上述表达载体以T7为启动子，采用分子伴侣TRX为融合伴体，TRX的C端有柔链区和6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化；所设计的上游引物含有蛋白酶3C位点，以便外源蛋白单体的获得。通过对培养时间、诱导时间、温度等条件的摸索和优化，hmGFP融合蛋白获得稳定高表达，在Ecoli.中处于部分可溶状态。
本发明还摸索和优化了重组hmGFP蛋白的纯化条件，表达产物的超声裂解液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析，得到纯度较高的融合蛋白，融合蛋白经3C蛋白酶切割和进一步的G50凝胶柱层析，可得到纯度在95％以上的成熟重组海葵荧光蛋白。
本发明获得的重组海葵荧光蛋白具有新的荧光波谱特征荧光散射波长为～502nm，最大激发波长～490nm，并在～420nm处有一肩峰。
本发明通过设计一对引物，将编码巨型幅花海葵荧光蛋白的新基因hmGFP用PCR方法从T载体上扩增出来，分别克隆到原核非融合表达载体pET21b和真核表达载体pCDNA3上，分别构建成表达质粒(pET21b-hmGFP)和(pCDNA3-hmGFP)，前者转化大肠杆菌BL21(DE3)，后者转染哺乳动物细胞(CHO)，通过对培养时间、诱导时间、温度等条件的摸索和优化，hmGFP蛋白获得稳定高表达，表达的蛋白可激发出荧光。
上述的引物依据巨型幅花海葵hmGFP基因的两端序列合成，在上游引物中引入BamH I酶切位点(GGATCC)、ATG起始密码子以及一个Kozak共有翻译起始位点，下游引物中引入NotI酶切位点(GCGGCCGC)、终止密码子TTA及为使载体其它表达元件读码框相符而插入的碱基T。
上游引物(P3)5’-CGGGATCCACCGGTCGCCACCATGTATTCTTACATCAAAG-3’BamH I Kozak共有翻译起始位点下游引物(P4)5’-TGATAGCGGCCGCTTTACGAACTCTCATCAAA-3’NotI以含巨型幅花海葵hmGFP基因的pGEM-T easy质粒为模板，P3、P4为引物PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在750bp左右。PCR扩增产物先以BamH I/Not I双酶切后连接到已作相应酶切的pCDNA3和/或pET21b载体上构建成(pCDNA3-hmGFP)和/或(pET21b-hmGFP)重组质粒。
本发明利用分子生物学的方法，找到了1个海葵荧光蛋白类似物新基因；并在原核系统实现了融合(pTRX-hmGFP)和非融合(pET21b-hmGFP)表达，及在真核系统(pCDNA3-hmGFP)获得了稳定表达，确证了hmGFP作为报告基因的可行性，可应用于欲示踪标记基因编码蛋白的胞内定位和功能研究，具有极高的应用前景及产业开发价值。
由pTRX-hmGFP表达质粒载体经Kpn I/Not I双酶切，可得到724bp的片段，即为巨型幅花海葵荧光蛋白hmGFP成熟肽编码序列(其中包含蛋白酶3C识别位点)；pET21b-hmGFP和pCDNA3-hmGFP表达质粒载体经BamHI/Not I双酶切，可得到~700bp的编码hmGFP成熟肽的序列片段。
本发明的表达质粒载体的复制方法参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基转化细菌，碱法提取质粒。
图1为巨型幅花海葵触手总RNA电泳结果；图2为巨型幅花海葵荧光蛋白类似物基因hmGFP的PCR电泳结果；图3为BSK-hmGFP中间质粒和pTRX-hmGFP表达质粒酶切鉴定图；图4为pET21b-hmGFP和pCDNA3-hmGFP表达质粒酶切鉴定图；图5为相同收菌时间，不同IPTG诱导浓度的重组巨型幅花海葵hmGFP蛋白表达及可溶性(诱导温度22℃)；图6为纯化巨型幅花海葵hmGFP蛋白的SDS-PAGE电泳；图7为含巨型幅花海葵hmGFP基因的重组质粒pTRX-hmGFP构建图；图8为含巨型幅花海葵hmGFP基因的重组质粒pET21b-hmGFP构建图；图9为含巨型幅花海葵hmGFP基因的重组质粒pCDNA3-hmGFP构建图；图10为重组巨型幅花海葵hmGFP蛋白G50样品的吸收波谱；图11为重组巨型幅花海葵hmGFP蛋白G50样品的散射波谱；图12为原核非融合表达质粒pET21b-hmGFP的IPTG浓度梯度25℃诱导表达菌体；图13表示原核融合表达质粒pTRX-hmGFP的IPTG浓度梯度25℃诱导表达菌体；图14为重组真核质粒pCDNA3-hmGFP转染CHO细胞48小时后的荧光显微分析(100X)。
图1中，MRNA标记；1RNA。
图2中，1PCR目的条带；21kb DNA标记。
图3中，M1Kb DNA Ladder(Gibco)；lane 1pTRX-hmGFP载体质粒KpnI，NotI双酶切产物；lane 2pTRX-hmGFP载体质粒；lane 3BSK-hmGFP载体质粒的KpnI，BamHI双酶切产物；lane 4BSK-hmGFP载体质粒。
图4中，M1Kb DNA Ladder(Gibco)；lane 1pET21b-hmGFP载体质粒BamHI，NotI双酶切产物；lane 2pET21b-hmGFP载体质粒；lane 3pCDNA3-hmGFP载体质粒的BamHI，BamHI双酶切产物；lane 4pCDNA3-hmGFP载体质粒。
图5中，C未加IPTG诱导的总菌体；M蛋白质低分子标志；IPTG浓度梯度(0.1mM、0.3mM、0.5mM和1mM)诱导表达菌体1、3、5和7超声总菌，2、4、6和8超声上清。
图6中，M蛋白质低分子标志；1G-50洗脱峰；2SP洗脱峰；3酶切；4150mM咪唑峰；5超声上清；6超声总菌；7未诱导的总菌体。
图10中，峰1420nm；峰2490nm。
图11中，峰1420nm波长激光激发的散射峰；峰2490nm波长激光激发的散射峰。
图12中，FIG1自然光下的诱导表达菌体；FIG2UV光下的诱导表达菌体；FIG3诱导表达菌体的SDS-PAGE电泳结果；1～60、0.01、0.1、0.25、0.5和1mMIPTG。
图13中，FIG1自然光下的诱导表达菌体；FIG2UV光下的诱导表达菌体；FIG3诱导表达菌体的SDS-PAGE电泳结果；1～60、0.01、0.1、0.25、0.5和1mMIPTG。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明作进一步说明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1巨型幅花海葵触手总RNA的提取、文库构建和PCR克隆筛选总RNA的提取和cDNA合成解剖一只巨型幅花海葵，收集10条触手，采用异硫氰酸胍法提取触手总RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白质.获得75μg触手总RNA，其A260/A280＝1.9986，经1％甲醛变性胶电泳检测可见清晰的28s和18s两条带，比值＞2，以及mRNA smear，见图1，表明总RNA完整性良好。进行第一链合成，LDPCR cDNA扩增，酶切消化和柱回收cDNA，构建cDNA文库。
引物设计和PCR扩增根据文库少量克隆随机测序结果所获得的巨型幅花海葵荧光蛋白类似物基因(hmGFP)EST 3’端和载体核苷酸序列设计引物，T7引物5’-TAA TAC GAC TCA CTA TA-3’；hmGFP引物5’-CAT GGG TAA GTA GGCTAC GA-3’。每50μl PCR反应体积加入1μl文库总质粒作为模板，PCR扩增，电泳检测，发现在650bp附近出现预期的特异性扩增带，见图2，回收此带。
实施例2巨型幅花海葵hmGFP荧光蛋白基因序列的测定和分析将回收的电泳产物连接至T-easy载体，转化DH5α大肠杆菌，挑选重组克隆测序。一共测定了18个克隆，Blast同源分析表明，其中有12个是hmGFP荧光蛋白基因序列，这12个hmGFP荧光蛋白基因长度都是904bp，编码1个长度为228个氨基酸的hmGFP荧光蛋白蛋白，编号为H175。它和水母绿色荧光蛋白的氨基酸序列不完全相同，核苷酸序列相似性约达61％，蛋白质序列同源性仅达50％，是1个新的荧光蛋白基因。
利用工具软件DNAtools对其碱基序列进行分析，并获得其最大读码框，在靠近5’端处出现起始密码子ATG，并且在ATG前-3位为A，可以确认紧跟其后出现的ATG为巨型幅花海葵hmGFP基因全长序列的起始密码子；序列分析还发现，在靠近3’端终止密码子处发现一个加尾信号(AATAAA)，并且在3’端处的确出现了polyA序列，由此亦可以确认此序列已经终结。故根据以上的多方面分析可以判断本发明所采用的巨型幅花海葵hmGFP基因序列为全长序列。
另外通过Clustalw分析软件可得如下比较结果wtGFP -MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTG-KLPVPWPEGFP MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTG-KLPVPWPhmGFP ——MYSYIKETMRSKVYMEGNVNNHAFKCTAEGEGKPYKGSQKLTITVTEGGPLPFAFD. :. .: * ::*:**.**. :.****.. *. .*.: * * **..:wtGFP TLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTEGFP TLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDThmGFP ILSHAFQYGNKVFTYPDDIP—DFFKQSLSGGFTWKRVSNYEGGVLTVDQKTSLEGDC* ::** : *::***.: ****.::. *:. :*. ::*.* .. :..:***wtGFP LVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLE-YNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQEGFP LVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLE-YNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQhmGFP IICNIKVHGTNFPADGPVMQKQTNGWEPSTETVIPRGEGILLRDVPALKLRNNKGHLLCV:: .*:::* :* ** :: :: : :: .:..* .: :*:*:* .wtGFP LADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYEGFP LADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYhmGFP METTYKPNKRVN——LPKLHFHHLRMEKDSISDDEK-TIKQHEDVRASYFNVRFDESS: *:*. :.**. *: : .. .:::: : * * *: :.: :**wtGFP KEGFP KhmGFP -“*”表示相同；“”表示差异较小；“.”表示差异明显；空格表示完全不同。
由上分析结果可以看出，本发明采用的巨型幅花海葵hmGFP基因与其他物种的同源基因具有一定的同源性，具有典型的荧光蛋白基因一级结构的特征。其氨基酸序列内含有Phe62-Gln63-Tyr64-Gly65组成的特征性最小生色基团的环肽，是自催化成环而发生荧光所必需的，如序列表所示。
在PCR扩增反应中，用普通的Taq酶会出现约10-4的错配，由于目的片段不大，PCR的循环数不超过30个，降低了错误参入的概率，从实验结果来看，这个序列在多个克隆测序中重复出现，可排除错误参入，说明本实验PCR的结果有较高的可信度。
实施例3重组巨型幅花海葵hmGFP基因表达质粒的构建依据巨型幅花海葵hmGFP基因的两端序列合成一对引物，在上游引物中引入Kpn I酶切位点(GGTACC)、ATG起始密码子以及一个Prescission ProtehmGe切割位点，下游引物中引入BamH I酶切位点(GGATCC)及终止密码子TTA，TCA。
上游引物(P1)5’-GGGGTACCCTGGAAGTTCTGTTCCAAGGTCCAATGKpn I Prescission ProtehmGe切割位点TATTCTTACATCAAAG-3’下游引物(P2)5’-CGGGATCCTCAGGAAATGATCATTTACGAAC-3’BamH I以含巨型幅花海葵hmGFP基因的pGEM-T easy质粒为模板，P1、P2为引物PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在750bp左右。PCR扩增产物先以Kpn I/BamH I双酶切后连接到BSK载体上构建成BSK-hmGFP，再以Kpn I/NotI的酶切克隆到原核融合表达载体pTRX上。克隆载体和表达载体分别用Kpn I/BamH I和Kpn I/Not I进行双酶切鉴定，酶切结果见图3。克隆载体和表达载体中的外源基因经测序鉴定正确。所设计的上游引物中含Prescission ProtehmGe切割位点，以便切除融合伴侣TRX。载体的构建过程见图7。
依据巨型幅花海葵hmGFP基因的两端序列合成另一对引物，在上游引物中引入BamH I酶切位点(GGATCC)、ATG起始密码子以及一个Kozak共有翻译起始位点，下游引物中引入NotI酶切位点(GCGGCCGC)、终止密码子TTA及为使载体其它表达元件读码框相符而插入的碱基T。
上游引物(P3)5’-CGGGATCCACCGGTCGCCACCATGTATTCTTACATCAAAG-3’BamH I Kozak共有翻译起始位点下游引物(P4)5’-TGATAGCGGCCGCTTTACGAACTCTCATCAAA-3’NotI以含巨型幅花海葵hmGFP基因的pGEM-T easy质粒为模板，P3、P4为引物PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在750bp左右。PCR扩增产物先以BamH I/Not I双酶切后连接到已作相应酶切的pCDNA3和/或pET21b载体上构建成pCDNA3-hmGFP和/或pET21b-hmGFP重组质粒，构建过程分别见图8、9。重组质粒用BamHI/NotI进行双酶切鉴定，酶切结果见图4。重组质粒中的外源基因经测序鉴定正确。所设计的上游引物中含Kozak共有翻译起始位点，以便进一步提高翻译起始的效率。
实施例4 重组巨型幅花海葵hmGFP蛋白的原核融合和非融合表达将pTRX-hmGFP和pET21b-hmGFP转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌超声裂解上清液经SDS-PAGE电泳分析表明，菌体经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与用软件PROTEIN ANALYSIS预测的理论值40.3KD(pTRX-hmGFP)和25.9KD(pET21b-hmGFP)相符。两者的工程菌诱导表达后，自然光下菌体均呈现绿色，紫外光下菌体激发成明亮稳定的荧光，见图12、图13。
经过对培养时间，诱导浓度，温度等条件的摸索，基因工程菌的培养条件为接单菌落于50ml氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养过夜，取过夜培养物20ml接种于2L的氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD600＝0.6(扩大培养约2h)，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至终浓度分别为1mM和0.2％，25℃，250rpm诱导培养10h后离心收获菌体。经SDS-PAGE电泳分析分析表明，在此条件下巨型幅花海葵触手TRX-hmGFP融合蛋白和hmGFP非融合蛋白的表达量均占菌体总蛋白的20％以上，小部分处于可溶状态，见图5、图6、图12、图13。
实施例5 重组巨型幅花海葵hmGFP融合蛋白的纯化及成熟蛋白的获得将收获的总菌体用TE(pH8.0)洗涤，再用Tis(50mM，pH7.0)悬浮，超声处理后，裂解上清液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析一步纯化，经SDS-PAGE分析和薄层扫描分析表明融合蛋白的纯度达到80％，见图5、图6、图12、图13。以1L基因工程菌培养物为材料，最终获得约40mg纯化的融合蛋白。
为了提高重组蛋白的得率和浓度，简化实验步骤，缩短对重组蛋白的处理时间，在用Ni2+亲和色谱层析纯化重组蛋白时，我们采用一步法进行纯化。根据载体质粒pTRX所表达的外源蛋白与Ni2+亲和柱的结合能力较强的特点，选用了较简化的洗脱条件50mM Tris，500mM NaCl，pH7.0(A液)；50mM Tris，500mMNaCl，pH6.0(B液)；50mM咪唑，50mM Tris，500mM NaCl，pH6.0(C液)；100mM咪唑，50mM Tris，500mM NaCl，pH6.0(D液)；150mM咪唑，50mM Tris，500mMNaCl，pH6.0(E液)。重组hmGFP融合蛋白在D液和E液被洗脱下来，见图5。从SDS-PAGE结果来判断分离效果最好的部分。
利用Folin-酚法测定重组hmGFP的蛋白浓度，收获浓度在0.7mg/ml以上的洗脱液，加入Prescission ProtehmGe切割位点进行切割，用SDS-PAGE检测酶切结果，可明显看到26kD附近代表成熟重组hmGFP的谱带，见图6。将反应液用Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析柱纯化(条件同前)，收获含成熟重组hmGFP的穿流液，并用Sephadex G-50进一步纯化(洗脱液为PBS)，便得纯度在95％以上的成熟重组巨型幅花海葵触手hmGFP蛋白，见图5、图6。
实施例6重组巨型幅花海葵hmGFP蛋白的荧光波谱分析吸取成熟重组巨型幅花海葵触手hmGFP蛋白2ml(0.275mg/ml)进行荧光分光光度分析，以PBS洗脱液校准调零。参考绿色荧光蛋白的波谱，选定吸收峰测定参数，以488nm波长激光激发样品，测得重组巨型幅花海葵hmGFP蛋白的最大吸收峰波长为490nm及一波长为420nm的肩峰，见图10。同样以PBS洗脱液校准调零，选定散射峰测定参数，以上述测定的吸收峰490nm和420nm波长激光激发样品，测定样品散射峰，其最大散射峰波长为510nm，见图11。
实施例7 重组巨型幅花海葵hmGFP蛋白的真核哺乳动物细胞(CHO)表达将对数生长期的CHO细胞(约5×104细胞/孔)铺入24孔板，37℃二氧化碳培养箱中过夜。第二天，利用脂质体介导转染细胞的转染剂将重组真核表达质粒pCDNA3-hmGFP转入CHO细胞内。孵育48小时后，多聚甲醛固定，倒置荧光显微镜观察，发现转染入pCDNA3-hmGFP的CHO细胞在紫外光激发下发出稳定强烈的荧光(100X)，照相记录结果，见图14。
<110>中山大学<120>海葵荧光蛋白新基因及其克隆、表达与应用<130><140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>904<212>DNA<213>巨型幅花海葵(Heteractismagnifica)<220><221>CDS<222>(67)..(750)<400>1gattttggac agctgttcaa ccaggcaaat tcaagaagtc atcatcttta tctctcagtc 60aggaaa atg tat tct tac atc aaa gaa acc atg cgc agt aag gtt tac108Met Tyr Ser Tyr Ile Lys Glu Thr Met Arg Ser Lys Val Tyr1 5 10atg gaa gga aat gtt aac aac cac gcc ttt aag tgc act gca gaa gga 156Met Glu Gly Asn Val Asn Asn His Ala Phe Lys Cys Thr Ala Glu Gly15 20 25 30gaa gga aaa cca tac aaa ggc tca caa aaa ctg acg att acc gta act 204Glu Gly Lys Pro Tyr Lys Gly Ser Gln Lys Leu Thr Ile Thr Val Thr35 40 45gaa gga ggt cct ctg cca ttt gct ttc gac att ctt tcg cac gcc ttt 252Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ser His Ala Phe50 55 60cag tat ggc aat aag gtg ttc acc aag tac ccc gac gat att cct gat 300Gln Tyr Gly Asn Lys Val Phe Thr Lys Tyr Pro Asp Asp Ile Pro Asp65 70 75ttc ttt aag cag tct ctt tct gga ggt ttt act tgg aaa aga gta agc 348Phe Phe Lys Gln Ser Leu Ser Gly Gly Phe Thr Trp Lys Arg Val Ser80 85 90aac tat gag gac gga gga gtc ctt acc gtt gac caa aaa act agt ctg 396Asn Tyr Glu Asp Gly Gly Val Leu Thr Val Asp Gln Lys Thr Ser Leu95 100 105 110gag gga gat tgc att att tgc aac att aaa gta cat ggc act aac ttc 444Glu Gly Asp Cys Ile Ile Cys Asn Ile Lys Val His Gly Thr Asn Phe115 120 125ccc gca gat ggt ccg gtg atg caa aaa cag acc aat gga tgg gag cca 492Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Gln Thr Asn Gly Trp Glu Pro130 135 140tca act gaa act gtt att cca cgg ggt gaa gga att ctg ctg cgc gat 540Ser Thr Glu Thr Val Ile Pro Arg Gly Glu Gly Ile Leu Leu Arg Asp145 150 155gtg ccc gca ctg aag ctg cgt aat aac aaa gga cat ctt ctc tgt gtc 588Val Pro Ala Leu Lys Leu Arg Asn Asn Lys Gly His Leu Leu Cys Val160 165 170atg gaa aca act tac aag cca aac aaa agg gtg aac ctg cca aaa ctg 636Met Glu Thr Thr Tyr Lys Pro Asn Lys Arg Val Asn Leu Pro Lys Leu175 180 185 190cac ttt cat cat ttg cga atg gag aag gat agt att agt gac gat gag 684His Phe His His Leu Arg Met Glu Lys Asp Ser Ile Ser Asp Asp Glu195 200 205aag acc att aag cag cac gag gat gtg agg gca agc tac ttc aat gtg 732Lys Thr Ile Lys Gln His Glu Asp Val Arg Ala Ser Tyr Phe Asn Val210 215 220cgc ttt gat gag agc tcg taaatgatca tttccttatt gatttcaatg 780Arg Phe Asp Glu Ser Ser225ttagggcatt cagtttccaa attttcttat acacagtcat ttcccttcgt agcctactta 840cccatgtttt gttgaagtca ataaacagct aagcccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900aaaa 904<210>2<211>228<212>PRT<213> 巨型幅花海葵(Heteractismagnifica)<400>2Met Tyr Ser Tyr Ile Lys Glu Thr Met Arg Ser Lys Val Tyr Met Glu15 10 15Gly Asn Val Asn Ash His Ala Phe Lys Cys Thr Ala Glu Gly Glu Gly20 25 30Lys Pro Tyr Lys Gly Ser Gln Lys Leu Thr Ile Thr Val Thr Glu Gly35 40 45Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ser His Ala Phe Gln Tyr50 55 60Gly Asn Lys Val Phe Thr Lys Tyr Pro Asp Asp Ile Pro Asp Phe Phe65 70 75 80Lys Gln Ser Leu Ser Gly Gly Phe Thr Trp Lys Arg Val Ser Asn Tyr85 90 95Glu Asp Gly Gly Val Leu Thr Val Asp Gln Lys Thr Ser Leu Glu Gly100 105 110Asp Cys Ile Ile Cys Asn Ile Lys Val His Gly Thr Asn Phe Pro Ala115 120 125Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Gln Thr Asn Gly Trp Glu Pro Ser Thr130 135 140Glu Thr Val Ile Pro Arg Gly Glu Gly Ile Leu Leu Arg Asp Val Pro145 150 155 160Ala Leu Lys Leu Arg Asn Asn Lys Gly His Leu Leu Cys Val Met Glu165 170 175Thr Thr Tyr Lys Pro Asn Lys Arg Val Asn Leu Pro Lys Leu His Phe
180 185 190His His Leu Arg Met Glu Lys Asp Ser Ile Ser Asp Asp Glu Lys Thr195 200 205Ile Lys Gln His Glu Asp Val Arg Ala Ser Tyr Phe Asn Val Arg Phe210 215 220Asp Glu Ser Ser22权利要求
1.一种海葵荧光蛋白基因hmGFP，来源于巨型幅花海葵触手cDNA文库，核苷酸序列如序列表所示。
2.如权利要求1所述的海葵荧光蛋白基因hmGFP，其特征在于长度为904bp，编码228个氨基酸的成熟肽，所表达的蛋白质等电点为7.89，分子量约为25,903道尔顿，具有典型的荧光蛋白一级结构的特征，分子内含有Phe62-Gln63-Tyr64-G1y65组成的最小生色基团的环肽，氨基酸序列如序列表所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于含有如权利要求1所述的海葵荧光蛋白基因hmGFP，是以硫氧环蛋白为融合伴体，中间插入6个His的亲和标记位点及蛋白酶3C识别位点的原核融合表达载体pTRX-hmGFP。
4.一种重组表达载体，其特征在于含有如权利要求1所述的海葵荧光蛋白基因hmGFP，是在pET21b质粒的BamHI和NotI位点之间插入hmGFP基因的原核非融合表达载体pET21b-hmGFP。
5.一种重组表达载体，其特征在于含有如权利要求1所述的海葵荧光蛋白基因hmGFP，是在pCDNA3质粒的BamHI和NotI位点之间插入hmGFP基因的真核表达载体pCDNA3-hmGFP。
6.如权利要求3或4所述的重组表达载体，其特征在于载体为大肠杆菌表达载体。
7.如权利要求3或4或5所述的重组表达载体，其特征在于载体的表达产物的荧光散射波长为～502nm，最大激发波长～490nm，并在～420nm处有一肩峰。
8.一种用作引物的DNA片段，其特征在于由权利要求1所述基因的核苷酸序列的一部分序列组成，在上游引物中引入Kpn I酶切位点GGTACC、ATG起始密码子以及一个Prescission ProtehmGe切割位点，下游引物中引入BamH I酶切位点GGATCC及终止密码子TTA，TCA上游引物(P1)5’-GGGGTACCCTGGAAGTTCTGTTCCAAGGTCCAATGKpn I Prescission ProtehmGe切割位点TATTCTTACATCAAAG-3’下游引物(P2)5’-CGGGATCCTCAGGAAATGATCATTTACGAAC-3’BamH I
9.一种用作引物的DNA片段，其特征在于由权利要求1所述基因的核苷酸序列的一部分序列组成，在上游引物中引入BamH I酶切位点GGATCC、ATG起始密码子以及一个Kozak共有翻译起始位点，下游引物中引入NotI酶切位点GCGGCCGC、终止密码子TTA及为使载体其它表达元件读码框相符而插入的碱基T上游引物(P3)5’-CGGGATCCACCGGTCGCCACCATGTATTCTTACATCAAAG-3’BamH I Kozak共有翻译起始位点下游引物(P4)5’-TGATAGCGGCCGCTTTACGAACTCTCATCAAA-3’NotI
10.权利要求1所述的海葵荧光蛋白基因hmGFP在欲示踪标记基因编码蛋白的胞内定位和功能研究中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种海葵荧光蛋白新基因hmGFP，该新基因长度为904bp，编码228个氨基酸的成熟肽，所表达的蛋白质等电点为7.89，分子量为25,903道尔顿；本发明还公开了该新基因的克隆、表达，设计了两对引物，分别构建原核融合表达载体pTRX－hmGFP、原核非融合表达载体pET21b－hmGFP、真核表达载体pCDNA3－hmGFP；表达的重组海葵荧光蛋白的荧光散射波长为～502nm，最大激发波长～490nm，并在～420nm处有一肩峰。本发明将hmGFP分别克隆于原核表达载体pET21b和真核表达载体pCDNA3实现了原核非融合表达和真核哺乳细胞表达，可用于欲示踪标记基因编码蛋白的胞内定位和功能研究。
文档编号C07K14/435GK1464059SQ0213465
公开日2003年12月31日 申请日期2002年9月3日 优先权日2002年9月3日
发明者徐安龙, 涂洪斌, 熊茜 申请人:中山大学