专利名称：艾纳香总黄酮提取物及其提取方法和药物应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及艾纳香总黄酮提取物及其提取方法，以该提取物作为活性成分的药用组合物，及其在治疗和/或预防冠心病、高脂血症和预防动脉粥样硬化的药物制备中的用途。
背景技术：
艾纳香(Blumea balsamifera(L.)DC)为菊科植物，其经典用途是从该植物中提取冰片(Borneol，又名龙脑或2-莰烷醇)。在现有技术中，以艾纳香提取物入药的制剂有“咽立爽滴丸”，其成分包括冰片和艾纳香油，其中的活性化合物主要为萜类物质，如1，8-桉叶素(Cineole)、柠檬烯(Limonene)、ι-樟脑(Camphor)、倍半萜烯醇等。以艾纳香入药的中药复方制剂有金健喉喷雾剂(主要成分艾纳香油等)、赛霉安内服剂(主要成分石膏、艾纳香、冰片等)等。
已经公开的与艾纳香提取物有关的中国专利主要涉及艾纳香油，包括下列专利(申请)97107723.1(治疗口腔和咽喉疾病)、98112092.X(治疗咽喉疾病)、95100521.9(治疗骨质增生疾病)、94102037.1(专治各种皮肤烧烫伤以及多种皮肤疾患)等。上述技术涉及的活性成分与本发明提取物的活性成分的化学类型不同。尚有部分中国专利涉及艾纳香植物粉末或经过传统中药学方法处理的复方制剂，例如，中国专利94114866.1的中国专利等，其专利内容与本发明也有本质上的差别。
此外，日本专利JP 62087589 A2涉及艾纳香所含的三种内酯类化合物Blumealactones A，B，C，与本发明涉及的活性化合物也不相同。
与艾纳香有关的文献报道，主要涉及其植物栽培、植化成分等，艾纳香成分药理学研究文献主要涉及艾纳香二氢黄酮类物质的肝保护作用，例如，许实波等，艾纳香素对实验性肝损伤的保护作用，中国药理学报1993，14(4)376～378；蒲含林等，艾纳香二氢黄酮对脂质过氧化损伤大鼠原代培养肝细胞的保护作用，中草药2000，31(2)113～115等文献。上述已经公开的各种技术没有涉及艾纳香所含黄酮类成分有良好的抗心肌缺血及降血脂作用，因而可以用于冠心病、高脂血症、动脉粥样硬化的治疗和/或预防等的报道。
发明内容
本发明目的之一是提供以黄酮类化合物为主要成分的艾纳香总黄酮提取物；本发明还提供上述艾纳香总黄酮提取物的制备方法；本发明还提供包括这种艾纳香总黄酮提取物以及药学上可接受的载体或赋形剂的药用组合物；本发明还提供上述艾纳香总黄酮提取物在治疗和/或预防冠心病、动脉粥样硬化、高脂血症的药物制备中的用途。
除另有说明外，本说明书的部分术语定义如下艾纳香是指菊科植物艾纳香[Blumea balsamifera(L.)DC]，又名大风艾、大艾等。
黄酮类化合物指化学结构上属于黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、花色素类、黄烷醇类、双苯吡酮类，异黄酮类、查尔酮类、二氢查尔酮类、橙酮类、高异黄酮类等的化合物，以及它们与单糖或寡糖形成的糖甙或其它形式的衍生物。
现有技术中已经被鉴定的存在于艾纳香植物中黄酮类化合物有5，3′，4′-三羟基-7-甲氧基二氢黄酮(5，3′，4′-trihydroxy-7-metroxy-flavanone)；3，5，3′-三羟基-7，4′-二甲氧基黄酮(3，5，3′-trihydroxy-7，4’-dimetroxyflavone)；3，5，3′，4′-四羟基-7-甲氧基黄酮(3，5，3′，4’-tetrahydroxy-7-metroxy-flavone)；5，3′，4′-三羟基-3，6，7-三甲氧基黄酮(5，3′，4′-tri-hydroxy-3，6，7-trimetroxyflavone)；(2R，3R)-二氢槲皮素-4′-甲醚((2R，3R)-dihydro-quercetin-4′-methyl ether)；(2R，3R)-二氢槲皮素-4′，7-二甲醚((2R，3R)-dihydroquercetin-4′，7-dimethylether)；(2R，3R)-7，5′-二甲氧基-3，5，2′-三羟基二氢黄酮((2R，3R)-7，5′-dimethoxy-3，5，2′-trihydroxyflavanone)；(2R，3R)-5′-甲氧基-3，5，7，2′-四羟基二氢黄酮((2R，3R)-5′methoxy-3，5，7，2′-tetra-hydroxy-flavanone)；(2S)-5，7，2′，5′-四羟基黄酮醇((2S)-5，7，2′，5′-tetrahydroxyflavanone)以及7，5′-二甲氧基-3，5，2′-三羟基黄酮醇(7，5′-dimetroxy-3，5，2′-tetrahydroxy-flavone)等。
本发明提供的艾纳香总黄酮提取物是指采用任何方法从植物艾纳香[Blumea balsamifera(L.)DC]中提取获得的，以黄酮类化合物作为主要成分(或主要功效成分)的提取物，该提取物中，黄酮类化合物的总重量之和占提取物总重量的25％～100％。提取物中各种黄酮类化合物之间的含量比例可以与天然植物中的含量比例一致，也可以与天然植物中的含量比例不尽一致。
本发明的提取物的提取方法，用艾纳香植物作原料，采用含水或不含水的有机溶剂作提取溶剂，所述的提取过程包括(1)提取用含水或不含水甲醇、乙醇、丙酮或其类似物之一种或几种任意比例的混合物作溶剂，将艾纳香植物或其粉碎料加入重量5-30倍的溶剂中，经浸泡、渗漉后在一定的温度下提取或回流提取至黄酮类显色剂检测不出黄酮类物质为止，静置、过滤、浓缩并澄清得澄明提取液；然后，(2)采用吸附树脂柱进行纯化处理，上柱过程中任选采用黄酮类显色剂检测流出液以确定树脂是否吸附饱和，先后用1-5倍树脂柱体积的水、0.5～5倍树脂柱体积的体积浓度为5％～20％的乙醇水溶液洗涤，再用3～10倍树脂柱体积、体积浓度为50～80％的乙醇水溶液洗脱，浓缩，并将浓缩液进行喷雾干燥或冷冻干燥，得总黄酮提取物；或者(3)用无机酸将浓缩液pH值调至3或以下，常温或低温静置，分离沉淀并干燥得总黄酮提取物。
前述方法所得的总黄酮提取物中黄酮类化合物的重量之和为提取物总重量的25％～80％。这些总黄酮提取物，可以进一步采用常规植化方法纯化，例如各种色谱柱层析等，这些方法对于本领域内技术人员来说是不言自明的。因此，本发明总黄酮提取物定义了黄酮类化合物含量，不论各单体化合物的含量如何，只要是从植物艾纳香中提取、并且黄酮类化合物总含量在上述定义范围内，则该提取物在本发明的范围内。
本发明所述的艾纳香总黄酮提取物的提取工艺中，采用吸附树脂法作为艾纳香黄酮的分离手段，可除去大量杂质，因而使有效成分富集，同时完成了除杂和浓缩两道工序。与传统方法相比，这种方法的工序少，可缩短生产周期，而且可去除重金属污染。
本发明首次发现艾纳香总黄酮提取物具有抗心肌缺血及降血脂作用。因此，本发明提供的艾纳香总黄酮提取物能够用于治疗和/或预防某些心血管疾病，如冠心病，其包括心绞痛、冠脉粥样硬化、心肌缺血等病症；高胆固醇血脂症，包括原发或并发于其它病症的高胆固醇血脂症；脑血管病，如脑缺血和/或缺氧症；以及其它相关病症。
由此，本发明的另一方面是提供用于治疗或预防人类疾病的药用组合物，其包括有效治疗量的艾纳香总黄酮提取物以及药学上可接受的载体或赋形剂的药用组合物。所谓“有效治疗量”是指在该剂量下，本发明提取物能够改善或减轻疾病症状、或能够抑制或阻断疾病发展。
本发明的药用组合物可以是胃肠道内给药制剂，如口服给药制剂等。其中，口服固体制剂可以是片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、锭剂等。这些制剂中，除包括本发明提取物外，还可以任选含有药学上可接受的填充剂、助流剂、润滑剂、矫味剂、着色剂等。这些制剂还可以根据需要制备成缓释或控释制剂。
口服液体制剂可以是溶液、混悬液、乳化液、酏剂等。这些制剂中，除包括本发明提取物外，还可以任选含有药学上可接受的溶剂、助溶剂、增溶剂、助悬剂、乳化剂、表面活性剂、矫味剂等。
胃肠道内给药制剂还可以是舌下片、栓剂等。
本发明组合物可以是胃肠外给药制剂。这些制剂可以是溶液、混悬液、乳化液等。它们可以通过静脉内、皮下、肌内途径给药。
对于本发明组合物的口服制剂如片剂、胶囊剂等，其每日给药剂量可以是含本发明提取物10-1000mg。其可以采用每日给药一次和/或数次，每次给药一片(粒)和/或数片(粒)，例如每片(粒)含5-200mg本发明提取物，每日用药1～3次，每次1～3片(粒)。
本发明的再一个方面是提供这些药用组合物作为治疗和/或预防冠心病、高脂血症、动脉粥样硬化等疾病的药物的用途。
本发明的药用组合物的优选技术方案可以是片剂，其中每片含有10-100mg的艾纳香总黄酮提取物，作为赋形剂的淀粉、糊精250-450mg，以及作为助流剂的2.5-10mg硬脂酸盐，等。其混合、制粒、压片等工艺流程可以采用本领域内已知的常规技术流程。
本发明的药用组合物优选技术方案也可以是用于治疗或预防冠心病、脑缺血症的胶囊剂，其中每粒胶囊含有10-100mg的艾纳香总黄酮提取物，糖类赋形剂250-450mg，纤维素适量，以常规方法进行湿法制粒、干燥、整粒并装胶囊。
本发明的药用组合物优选技术方案还可以是治疗或预防冠心病、脑缺血症的注射液，在以注射用水配制的1000ml注射液中含有总黄酮提取物10-100g，含0.1-0.5％的吐温-80作为助溶剂，并含适量氯化钠以调节渗透压。溶液中还可以添加药学上可接受的适量的抗氧剂、防腐剂等。溶液的配制、灭菌、灌装等均按照本领域内已知的常规技术进行。
与现有技术相比，本发明具有以下明显的优点1、本发明人首次发现药用植物艾纳香中所含的黄酮类化合物是具有重要心血管药理活性的化合物类群，发明人采用合适的提取方法获得了具有显著的心脑血管保护作用的艾纳香总黄酮提取物，一方面有望给心脑血管疾病患者提供一种新的治疗选择，另一方面对于更加有效地利用艾纳香植物资源，拓宽艾纳香植物的应用也具有重要意义；2、本发明提供的提取方法工序少，操作简便，生产周期短，而且可去除药材中污染的有害金属或类金属元素；3、本发明提供的艾纳香总黄酮提取物及其药用组合物能够用于治疗和/或预防某些心血管疾病，如冠心病，其包括心绞痛、冠脉粥样硬化、心肌缺血等病症；高胆固醇血脂症，包括原发或并发于其它病症的高胆固醇血脂症；脑血管病，如脑缺血和/或缺氧症；以及其它相关病症。本发明的药用组合物可以制备成多种药物剂型，便于患者使用。
具体实施例方式
下列具体的实施例是对本发明进行更加详细的描述，但不对本发明的范围构成任何限制。
实施例1 艾纳香总黄酮提取物的提取实施例1-11提取取艾纳香原药材(干燥茎叶)150g，粉碎，在77～85℃的温度下，以1500ml的70％乙醇水回流提取2遍(1500ml×2)，每次1.5小时。合并提取液，室温下静置过夜，过滤，去沉淀，滤液减压浓缩(50℃，0.07～0.1Mpa)至总体积1000ml，浓缩液加入5g氯化钙，搅拌2min，4℃下静置约3～6小时，离心(4000r/min×10min)，去残渣。上清液过新处理的D101大孔吸附树脂柱(柱体积约500ml，流速约500ml/hr，以盐酸—镁粉反应监测流出液以确证树脂柱是否吸附饱和)。随后，依次以1500ml水、1000ml 20％乙醇水、1500ml 70％乙醇水洗脱，洗脱速度约500ml/hr。收集70％乙醇水洗脱液，并减压浓缩(50℃，0.07～0.1Mpa)至近干，真空干燥箱内(室温，0.08～0.1Mpa，硅胶干燥剂)干燥12～72小时，得黄色粉末状艾纳香黄酮类提取物约2.2g(含水量≤5％)。
2含量检测(1)HPLC谱图色谱条件固定相-BDS柱(5.0mm×25cm×10μm)；流动相-0.4％磷酸∶甲醇(55∶45)；流速-1ml/min；柱温-30℃；检测波长-289nm；进样量-10～20μl。所得HPLC图谱如
图1示，其中峰面积大于10％的谱峰保留时间(min)分别为10.908、14.398、19.791、38.607、43.063。
(2)主要组分的定性鉴别主要成分分离分离系统-BCHI中压柱制备系统；固定相-BDS柱(15cm×60cm×38μm)；流动相-0.4％磷酸∶甲醇(55∶45)；流速-16ml/min；柱压-10Bar；检测波长-289nm；进样量-20ml；流份收集器自动收集样品。
定性鉴别方法将所收集的样品编号，经HPLC分析，确认与提取物HPLC谱峰对应的流份。检测主要流份的紫外光谱[岛津UV-2401]，并分别采用盐酸-镁粉显色反应、四氢硼钠显色反应、柠檬酸显色反应、醋酸镁显色反应、氢氧化钠显色反应进行定性鉴别(见姚新生主编，天然药物化学，第二版，人民卫生出版社，1996198-201)。
结果与保留时间(min)为10.908、14.398、19.791、38.607、43.063相对应的流份的定性鉴别结果如表1所示。
表1主要组分定性鉴别 *HPLC RTHPLC保留时间。
以上反应结果显示，与HPLC保留时间(min)10.908、14.398、19.791、38.607、43.063相对应的艾纳香总黄酮提取物组分与黄酮类化合物通性一致。
(3)含量测定紫外分光光度法。测定条件如下对照品溶液取槲皮素对照品，用乙醇制成每1ml含0.16mg的溶液；供试品溶液取本品，加3mol/L的盐酸溶液15ml，摇匀，水浴下加热回流3h，取出冷至室温，滤过，收集滤液至50ml量瓶中并用乙醇洗涤残渣及容器，滤液用乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法取对照品溶液及供试品溶液，按分光光度法(中国药典2000版附录IV A)，在373nm处测定吸收度，总黄酮物质含量为78％。
3药效学检测(1)艾纳香总黄酮提取物抗心肌缺血作用实验之一实验方法SD大鼠，灌胃给药(实施例1之1.1提取物10mg/kg，给药3天，每天2次)，第4日麻醉后，开胸结扎冠状动脉，记录II导联心电图。
实验结果与空白对照组相比，提取物给药组动物在冠脉结扎后各时段II导联心电图的ST段电位均显著降低。
各组大鼠冠脉结扎后不同时相点心电图ST段电位(mV)(n＝6)组别 5m 10m 30m 60m 120m空白对照组0.24±0.130.27±0.130.31±0.16 0.32±0.140.30±0.13提取物0.08±0.05*0.09±0.04**0.13±0.05*0.09±0.03**0.13±0.05*(10mg/kg)与空白对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01(t-test)(2)艾纳香总黄酮提取物抗心肌缺血作用实验之二实验方法SD大鼠，灌胃给药(实施例1.1提取物10mg/kg，给药3天，每天2次)，第4日麻醉后，开胸结扎冠状动脉，2小时后取心脏，染色，观察心肌梗死区域的大小。
实验结果与空白对照组相比，提取物给药组动物在冠脉结扎后心肌梗死区域面积显著减小。
各组大鼠冠状动脉结扎后心肌梗死区域面积比组别 梗死区域面积比(％)空白对照组 30.42±1.99提取物(10mg/kg)23.23±3.82**与空白对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01(t-test)(3)艾纳香总黄酮提取物调节异常血脂作用实验实验方法大鼠在实验环境下喂普通饲料1周，眼眶采血，测血脂作为正常值。正常对照组喂普通饲料，高脂模型对照组喂高脂饲料，实验组喂高脂饲料同时给药(实施例1.1提取物5mg/kg)，灌胃，2周后摘眼球取血，测定各项指标。
实验结果提取物给药可以显著降低血清总胆固醇及低密度脂蛋白含量。
大鼠高血脂模型各组降脂实验结果(n＝10)总胆固醇甘油三脂 低密度脂蛋白组别(mmol/L)(mmol/L) (mmol/L)正常对照组2.99±0.42 0.83±0.24 0.97±0.24**高脂模型对照组3.19±0.13 1.20±0.45 1.69±0.37提取物(5mg/kg)2.88±0.31*1.31±0.55 1.36±0.23*与空白对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01(t-test)实施例1-2取艾纳香原药材50g，粉碎，置索氏提取器中，加甲醇450ml，在55～70℃温度下回流提取3小时，合并提取液，4℃下静置12小时，过滤除去絮状沉淀。滤液减压浓缩(55～70℃、0.07～0.1Mpa)至约100ml。浓缩液加10％HCl调pH2.5，低温0～4℃放置8～12小时，析出粉状沉淀，母液浓缩放置又析出沉淀，合并沉淀，水洗(20ml×3)抽滤，真空干燥(室温，0.08～0.1Mpa)12～72小时，即得艾纳香总黄酮提取物约3.8g，含量40％(含量检测方法同实施例1)。
实施例2 总黄酮提取物的药用组合物实施例2-1含艾纳香总黄酮提取物的片剂制备处方成分 数量艾纳香总黄酮提取物(实施例1)60g淀粉 50g糊精 60g蔗糖 10g硬脂酸镁 2g制成 1000片制法上述处方成分按照常规制剂方法进行混合、制粒并压制成片剂。
实施例2-2含艾纳香总黄酮提取物的胶囊剂制备处方成分 数量艾纳香总黄酮提取物(实施例1-1)60g乳糖 60g糊精 15g淀粉(120目) 45g3％HPMC 适量制成1000粒制法艾纳香总黄酮提取物(实施例1)过80目筛，与淀粉、乳糖、糊精按等量倍增法混合均匀，加入预先配好的HPMC溶液制成软材，20目筛制粒，60℃干燥约30分钟，18目筛整粒，装2#胶囊即可。
实施例2-3含艾纳香总黄酮提取物的注射液制备处方成分 数量艾纳香总黄酮提取物(实施例1-1) 25g硫柳汞 0.01g吐温-801.5g氯化钠 3g羧甲基纤维素钠(30-60cpa·s)5g注射用水加至 1000ml制法硫柳汞加于50％量的注射用水中，加羧甲基纤维素钠，搅匀，溶解后用200目尼龙网滤过，密闭备用。氯化钠溶于适量注射用水中，4号垂熔漏斗滤过后，加入预热硫柳汞溶液及吐温-80搅匀，加热使沸腾，加入艾纳香总黄酮提取物，搅匀，取出冷至室温，加注射用水调至总体积，用200目尼龙布过筛两次，分装(5ml/支)，灭菌即得。
权利要求
1.一种艾纳香总黄酮提取物，其特征在于从艾纳香植物中提取获得，黄酮类化合物之总量占提取物总重量的25％～100％，所述的黄酮类化合物是指化学结构属于黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、花色素类、黄烷醇类、双苯吡酮类，异黄酮类、查尔酮类、二氢查尔酮类、橙酮类、高异黄酮类的化合物以及它们与单糖或寡糖形成的糖甙或其它形式的衍生物。
2.权利要求1所述的提取物的提取方法，其特征在于用艾纳香植物作原料，采用含水或不含水的有机溶剂作提取溶剂，提取过程包括(1)提取用含水或不含水甲醇、乙醇、丙酮或其类似物之一种或几种任意比例的混合物作溶剂，将艾纳香植物或其粉碎料加入重量5-30倍的溶剂中，经浸泡、渗漉后在一定的温度下提取或回流提取至黄酮类显色剂检测不出黄酮类物质为止，静置、过滤、浓缩并澄清得澄明提取液，然后，(2)采用吸附树脂柱进行纯化处理，上柱过程中以黄酮类显色剂检测流出液确定树脂是否吸附饱和，先后用1-5倍树脂柱体积的水、0.5～5倍树脂柱体积的重量浓度为5％～20％的溶剂洗涤，再用3～10倍树脂柱体积、重量浓度为50～80％的溶剂洗脱，浓缩，并将浓缩液进行喷雾干燥或冷冻干燥，得黄酮类提取物，或者(3)用无机酸将浓缩液pH值调至3或以下，常温或低温静置，分离沉淀并干燥得黄酮类提取物，前述方法所得的总黄酮提取物为提取物总重量的30％～80％。
3.含权利要求1所述提取物的药用组合物，其特征在于包括艾纳香总黄酮提取物以及药学上可接受的载体或赋形剂。
4.权利要求3所述的药用组合物，其特征在于其单位剂型中艾纳香总黄酮提取物的含量为5～1000mg。
5.根据权利要求3所述的药用组合物，其特征在于其制剂剂型为片剂，每片所含的艾纳香总黄酮提取物为10～100mg。
6.根据权利要求3所述的药用组合物，其特征在于其制剂剂型为胶囊剂，其每粒胶囊所含的艾纳香总黄酮提取物为10～100mg。
7.根据权利要求3所述的药用组合物，其特征在于其制剂剂型为注射液，其单位剂型中所含总黄酮提取物为10-100mg。
8.权利要求1的提取物在制备抗心肌缺血及降血脂药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了艾纳香总黄酮提取物及其提取制备方法，酮类化合物之总量占提取物总重量的25％～100％，用艾纳香植物作原料，采用含水或不含水的有机溶剂作提取溶剂，提取过程包括提取、用吸附树脂柱进行纯化处理或者用无机酸将浓缩液pH值调至3或以下，竟后处理得黄酮类提取物，用艾纳香总黄酮提取物以及药学上可接受的载体或赋形剂制备成各种药物剂型，其单位剂型中艾纳香总黄酮提取物的含量为5～1000mg，用于抗心肌缺血及降血脂药物，具有工艺简单、治疗效果好等优点，广泛用于治疗和/或预防冠心病、高脂血症和预防动脉粥样硬化。
文档编号C07D311/00GK1403451SQ0213492
公开日2003年3月19日 申请日期2002年10月8日 优先权日2002年10月8日
发明者康暉, 姚倩, 赵金华, 梅映昊, 李靖, 冯汉林 申请人:深圳海王药业有限公司