专利名称：红发夫酵母中虾青素的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种从红发夫酵母中提取虾青素的方法，具体涉及到红发夫酵母湿菌体在含抗氧化剂的有机酸或含酸酸性有机溶剂中在搅拌状态下浸泡，虾青素从胞内释放到胞外的提取技术。
背景技术：
虾青素(Astaxanthin，3，3’-二羟基-β，β’-胡萝卜素-4，4’-二酮)，属于酮式类胡萝卜素，结构如下虾青素的结构式 生理研究表明，虾青素具有很强的抗氧化功能，能清除体内由紫外线照射产生的自由基，调节降低这些由于光化学引起的伤害，对紫外线引起的皮肤癌有很好的治疗效果。虾青素的抗氧化功能高于角黄素(Canthaxanthin)、β-胡萝卜素(β-Carotene)、玉米黄素(Zeaxanthin)等其它类胡萝卜素，能抑制生物膜被氧化的作用。虾青素还能显著地促进淋巴结抗体的产生，特别是与体内T细胞相关抗原的抗体产生。
用红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)生产的虾青素在酵母细胞内合成，是胞内物质。为了让胞内虾青素提取出来，必须使细胞破壁，或者通过其它方法使虾青素通过细胞壁渗透出来。美国专利(US 5679567、US5712110、US 5709856、5972642)利用乙酸对红发夫酵母进行了提取试验，这些专利所使用的酵母菌体为干燥后的酵母菌体，这要求在提取前增加酵母干燥的工序，增加了虾青素提取工艺的复杂性，这会导致虾青素的损失较大，降低了提取收率，并且增加了能耗。因此，本发明的任务在于开发一种工业上可应用的、能直接从红发夫酵母湿菌体中提取虾青素的方法。
发明内容
本发明的任务是开发一种工业上可应用的、能直接从红发夫酵母湿菌体中提取虾青素的方法。
本发明的一种技术方案为将红发夫酵母湿菌体与含抗氧化剂的有机酸搅拌进行分散，在40℃～90℃下保温，搅拌1h～6h，胞内虾青素通过细胞壁释放到胞外溶剂中，经固液分离后，得含虾青素的有机相，然后经亲脂性有机溶剂萃取有机相，并经水洗、低温真空浓缩，获得虾青素浓缩液。
所述的有机酸为甲酸、乙酸中的任何一种，红发夫酵母湿菌体的重量与有机酸的体积之比为1∶2～10(W/V)。
所述的抗氧化剂为丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟四苯(BHT)、维生素E中的任何一种，抗氧化剂的重量与有机酸的体积比为0.1％～1.0％(W/V)。
萃取时添加的亲脂性有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯、甲苯、乙醚、二硫化碳中的任何一种，亲脂性有机溶剂与含虾青素的有机相的体积之比为1∶0.2～1.0。
本发明的另一种技术方案为将红发夫酵母湿菌体与含抗氧化剂的含酸酸性有机溶剂搅拌进行分散，在40℃～90℃下保温，搅拌1h～6h，胞内虾青素通过细胞壁释放到胞外溶剂中，经固液分离后，得含虾青素的有机相，然后经亲脂性有机溶剂萃取有机相，并经水洗、低温真空浓缩，获得虾青素浓缩液。
所述的含酸酸性有机溶剂中的有机溶剂为亲水性有机溶剂，为乙醇、丙酮、甲醇、二甲基亚砜中的任何一种，红发夫酵母湿菌体的重量与含酸酸性有机溶剂的体积之比为1∶2～10(W/V)。
含酸酸性有机溶剂中的酸为有机酸或无机酸，为乙酸、草酸、乳酸、硫酸、盐酸、磷酸中的任何一种，有机溶剂中酸的浓度为0.1％～10.0％。
所述的抗氧化剂为丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟四苯(BHT)、维生素E中的任何一种，抗氧化剂的重量与含酸酸性有机溶剂的体积比为0.1％～1.0％(W/V)。
萃取时添加的亲脂性有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯、甲苯、乙醚、二硫化碳中的任何一种，亲脂性有机溶剂与含虾青素的有机相的体积之比为1∶0.2～1.0。
以下对上述两个方案的具体步骤进行详细说明。
用有机酸从红发夫酵母湿菌体中提取虾青素将发酵结束后的发酵液经处理制得含水量大于60％的红发夫酵母湿菌体，在上述的红发夫酵母湿菌体(即酵母泥)中，加入有机酸，有机酸体积与酵母泥重量的比例为2～10∶1(V/W，有机酸体积/酵母泥湿重)，同时加入抗氧化剂对虾青素进行保护，在40℃～90℃下搅拌1h～6h，使酵母细胞改变通透性，并使虾青素释放到溶液中，经固液分离，得到含虾青素的有机相。
用含酸酸性有机溶剂从红发夫酵母湿菌体中提取虾青素将发酵结束后的发酵液经处理制得含水量大于60％的红发夫酵母湿菌体，在上述的红发夫酵母湿菌体(即酵母泥)中，加入含酸酸性有机溶剂，含酸酸性有机溶剂体积与酵母泥重量的比例为2～10∶1(V/W，含酸酸性有机溶剂体积/酵母泥湿重)，同时加入抗氧化剂对虾青素进行保护，在40℃～90℃下搅拌1h～6h，使酵母细胞改变通透性，并使虾青素释放到溶液中，经固液分离，得含虾青素的有机相。
从含虾青素的有机相中萃取虾青素将上述制得的含虾青素的有机相中加入亲脂性有机溶剂，进行萃取操作，亲脂性有机溶剂与含虾青素的有机相的体积之比为1∶0.2～1.0；经水洗后，进行低温真空蒸发浓缩操作，直至不再有溶剂蒸出为止，得到虾青素浓缩液。
在上述有机酸或含酸酸性有机溶剂提取过程中，其基本原理是利用有机酸或含酸酸性有机溶剂改变红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)的细胞壁结构，使虾青素通过细胞壁渗透出来，并溶解在有机酸或含酸酸性有机溶剂中。有机酸可选择甲酸或乙酸。
在有机溶剂中添加酸可以增加虾青素在有机溶剂中的溶解度，添加的酸为有机酸或无机酸，可选择乙酸、草酸、乳酸、硫酸、盐酸、磷酸中的一种，有机溶剂中酸的浓度为0.1％～10.0％。
由于虾青素与其他天然色素一样，对光、热、氧都比较敏感，易分解、破坏，因此在提取过程中，应尽量避免由这些因素而导致的分解和破坏，在提取过程中及时加入一些保护物质，如抗氧化剂，防止虾青素的氧化。在提取过程中添加的抗氧化剂可选择丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟四苯(BHT)、维生素E中的一种。抗氧化剂的使用量，根据加入红发夫酵母湿菌体中的有机酸或含酸酸性有机溶剂的添加量而定，以抗氧化剂的重量与有机酸的体积比为0.1％～1.0％(W/V)为宜；以抗氧化剂的重量与含酸酸性有机溶剂的体积比为0.1％～1.0％(W/V)为宜。
在含虾青素有机相中用有机溶剂萃取时，加入有机溶剂后充分搅拌，静置分层，取萃取相水洗，水洗至pH值5～6，然后进行低温真空蒸发浓缩，直至不再有溶剂蒸出为止，得到虾青素浓缩液。选择的有机溶剂为亲脂性有机溶剂，为二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯、甲苯、乙醚、二硫化碳中的一种。
本发明利用有机酸或含酸酸性有机溶剂在搅拌状态下直接浸泡红发夫酵母湿菌体，并采用抗氧化剂保护，虾青素从胞内释放到胞外，提取虾青素，其提取率为90％以上，该方法适合工业化生产，还具有以下积极效果
1)本发明的工艺简单，能耗低，操作容易，直接用湿菌种的原料，去除了提取前的干燥工序，提高了虾青素的收率；2)红发夫酵母中的虾青素经有机溶剂提取后，为游离态的虾青素，可以简化后续虾青素酯化工艺，提高虾青素在生物体内的利用和吸收率；3)有机酸或含酸的酸性有机溶剂破壁法可降低杂质，如核酸、蛋白质等生物大分子物质，可以简化虾青素的纯化工序。
(四)具体实施方案下面，参照附随的实施例对本发明进行更详细的描述，这些实施例决不是对本发明的限制。
实施例1(1)发酵液的前处理，获得含水量60％以上的红发夫酵母湿菌体将发酵完毕的红发夫酵母发酵液进行固液分离，可采用离心法和过滤法离心法可用离心机进行离心分离；过滤法可用板框压滤法和陶瓷膜过滤法，但在过滤前需将发酵液进行预处理，如进行凝聚、絮凝、加热、加助滤剂等，以提高过滤的速度，要求这些操作对虾青素的效价影响最小。
a.利用过滤法分离红发夫酵母发酵液中的菌体在发酵液700L中加入35kg的珍珠岩，经充分搅拌后，边搅拌边用泵将混合液输送到板框压滤机中进行过滤，过滤完毕后，用自来水冲洗，再用压缩空气洗涤，得到含珍珠岩的酵母泥(即红发夫酵母湿菌体)88kg，虾青素含量为206μg/g。
b.利用离心法分离红发夫酵母发酵液中的菌体在发酵液中加入0.5％氯化钙和磷酸盐，搅拌反应生成磷酸钙盐沉淀物，同时使酵母菌体一起凝聚沉淀；再加入0.1％聚丙烯酰胺，搅拌使沉淀物絮凝，形成更大的沉淀。通过连续式卧螺离心机进行离心分离沉淀物。所得到的酵母菌体(即红发夫酵母湿菌体)的含水率较上述a法的高。
(2)利用乙酸对红发夫酵母细胞进行破壁和虾青素提取。
在100kg红发夫酵母湿菌体(含虾青素225μg/g)中加入乙酸500L和丁基羟四苯(BHT)1kg，搅拌，使菌体均匀分散，然后在40℃～60℃下保温2h～5h，板框压滤，水洗，得到虾青素的初提取液(含虾青素的有机相)624L，其中虾青素的含量为33μg/ml，利用乙酸提取胞内虾青素的收率为91.5％。
(3)初提液经过萃取和浓缩，得到虾青素浓缩液。
以上述获得的624L初提液为基数，进行萃取和浓缩操作。
在初提液624L(含虾青素33μg/ml)中加入500L氯仿，经充分搅拌后，静置分层，若不能分层，可采取加入水来促使分层；取萃取相，水洗至pH为5～6，得到萃取液422L(虾青素含量为46μg/ml)；将萃取液放入浓缩锅，进行低温真空蒸发浓缩操作，直至不再有溶剂蒸出为止，得到虾青素浓缩液16.1L，其中虾青素含量为1135μg/ml，从酵母泥到浓缩液的总提取率为81.2％。
实施例2(1)发酵液的前处理，获得含水量60％以上的红发夫酵母湿菌体，步骤同实施例1中的第(1)步。
(2)利用甲酸对红发夫酵母细胞进行破壁和虾青素提取。
在100kg红发夫酵母湿菌体(含虾青素213μg/g)中加入甲酸1000L和丁基羟四苯(BHT)10kg，搅拌，使菌体均匀分散，然后在50℃～65℃下保温3h～6h，板框压滤，水洗，得到虾青素的初提取液1258L，其中虾青素的含量为16μg/ml，利用甲酸提取虾青素的收率为95％。
(3)以1258L初提液为基数经过萃取和浓缩，得到虾青素浓缩液。
在初提液1258L(含虾青素16μg/ml)中加入800L二氯甲烷，其余过程同实施例1中的第(3)步，得到虾青素浓缩液13.8L，其中虾青素含量为1255μg/ml，从酵母泥到浓缩液的总提取率为81.3％。
实施例3(1)发酵液的前处理，获得含水量60％以上的红发夫酵母湿菌体，步骤同实施例1中的第(1)步。
(2)利用盐酸-乙醇溶剂对红发夫酵母细胞进行破壁和虾青素提取。
在100kg红发夫酵母湿菌体(含虾青素215μg/g)中加入1M盐酸-乙醇混合溶剂(1M盐酸与乙醇的体积比为1∶4)500L和丁基羟基茴香醚(BHA)1kg，搅拌，使菌体均匀分散，然后在40℃～50℃下保温4h～6h，板框压滤，水洗，得到虾青素的初提取液636L，其中虾青素的含量为31μg/ml，利用盐酸-乙醇溶液提取虾青素的提取收率为91.7％。
(3)以上述获得的636L初提液为基数，进行萃取和浓缩操作。
在初提液636L(含虾青素31μg/ml)中加入600L二硫化碳，经充分搅拌后，静置分层，若不能分层，可采取加入水来促使分层；取萃取相，水洗至pH为5～6，得到萃取液522L(虾青素含量为35μg/ml)；将萃取液放入浓缩锅，进行低温真空蒸发浓缩操作，直至不再有溶剂蒸出为止，得到虾青素浓缩液16.9L，其中虾青素含量为1021μg/ml，总提取率为80.2％。
实施例4(1)发酵液的前处理，获得含水量60％以上的红发夫酵母湿菌体，步骤同实施例1中的第(1)步。
(2)利用硫酸-甲醇溶剂对红发夫酵母细胞进行破壁和虾青素提取。
在100kg红发夫酵母湿菌体(含虾青素218μg/g)中加入1M硫酸∶甲醇＝1∶4的硫酸-甲醇混合溶剂500L和维生素E 1.2kg，搅拌，使菌体均匀分散，然后在50℃～70℃下保温1h～5h，板框压滤，水洗，得到虾青素的初提取液620L，其中虾青素的含量为32μg/ml，利用硫酸-甲醇溶剂对红发夫酵母细胞进行破壁和虾青素提取的收率为91％。
(3)以上述获得的620L初提液为基数，进行萃取和浓缩操作。
在上述初提液620L(含虾青素32μg/ml)中加入500L石油醚，其余过程同实施例1中的第(3)步，得到虾青素浓缩液16.8L，其中虾青素含量为1056μg/ml，从酵母泥到浓缩液的总提取率为81.4％。
实施例5(1)发酵液的前处理，获得含水量60％以上的红发夫酵母湿菌体，步骤同实施例1中的第(1)步。
(2)在100kg红发夫酵母湿菌体(含虾青素234μg/g)中加入10M磷酸∶丙酮＝1∶9的磷酸-丙酮混合溶剂500L和丁基羟基茴香醚(BHA)1kg，搅拌，使菌体均匀分散，然后在50℃～80℃下保温4h～6h，板框压滤，水洗，得到虾青素的初提取液618L，其中虾青素的含量为35μg/ml，利用磷酸-丙酮溶剂对红发夫酵母细胞进行破壁和虾青素提取收率为92.4％。
(3)以上述获得的618L初提液为基数，进行萃取和浓缩操作。
在上述初提液618L(含虾青素35μg/ml)中加入500 L乙酸乙酯，其余过程同实施例1中的第(3)步，得到虾青素浓缩液16.9L，其中虾青素含量为1141μg/ml，从酵母泥到浓缩液的总提取率为82.4％。
实施例6(1)发酵液的前处理，获得含水量60％以上的红发夫酵母湿菌体。步骤同实施例1中的第(1)步。
(2)利用乳酸-丙酮溶剂对红发夫酵母细胞进行破壁和虾青素提取。
在100kg红发夫酵母湿菌体(含虾青素208μg/g)中加入80％乳酸∶丙酮＝1∶8的乳酸-丙酮混合溶剂500L和丁基羟基茴香醚(BHA)1kg，搅拌，使菌体均匀分散，然后在80℃～90℃下保温5h～6h，板框压滤，水洗，得到虾青素的初提取液622L，其中虾青素的含量为31μg/ml，利用乳酸-丙酮溶剂对红发夫酵母细胞进行破壁和虾青素提取为92.7％。
(3)以上述获得的622L初提液为基数，进行萃取和浓缩操作。
在上述初提液622L(含虾青素31μg/ml)中加入500L甲苯，其余过程同实施例1中的第(3)步，得到虾青素浓缩液16.9L，其中虾青素含量为998μg/ml，从酵母泥到浓缩液的总提取率为81.1％。
实施例7(1)发酵液的前处理，获得含水量60％以上的红发夫酵母湿菌体。步骤同实施例1中的第(1)步。
(2)利用草酸-二甲基亚砜溶剂对红发夫酵母细胞进行破壁和虾青素提取。
在100kg红发夫酵母湿菌体(含虾青素216μg/g)中加入0.5M草酸∶二甲基亚砜＝1∶3的草酸-二甲基亚砜混合溶液800L和维生素E1kg，搅拌，使菌体均匀分散，然后在60℃～70℃下保温2h～6h，板框压滤，水洗，得到虾青素的初提取液903L，其中虾青素的含量为22μg/ml，利用草酸-二甲基亚砜溶剂对红发夫酵母细胞进行破壁和虾青素提取收率为92％。
(3)以上述获得的903L初提液为基数，进行萃取和浓缩操作。
在上述初提液903L(含虾青素22μg/ml)中加入500L苯，其余过程同实施例1中的第(3)步，得到虾青素浓缩液17.1L，其中虾青素含量为1038μg/ml，从酵母泥到浓缩液的总提取率82.2％。
权利要求
1.一种红发夫酵母中虾青素的提取方法，其特征是将红发夫酵母湿菌体与含抗氧化剂的有机酸搅拌混合，保温提取，然后经亲脂性有机溶剂萃取，水洗，低温真空浓缩，获得虾青素浓缩液。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征是所述的有机酸为甲酸、乙酸中的一种，红发夫酵母湿菌体的重量与有机酸的体积之比为1∶2～10。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征是所述的抗氧化剂为丁基羟基茴香醚、丁基羟四苯、维生素E中的一种，抗氧化剂的重量与有机酸的体积比为0.1％～1.0％。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征是所述的亲脂性有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯、甲苯、乙醚、二硫化碳中的一种，亲脂性有机溶剂与含虾青素的有机相的体积之比为1∶0.2～1.0。
5.一种红发夫酵母中虾青素的提取方法，其特征是将红发夫酵母湿菌体与含抗氧化剂的含酸酸性有机溶剂搅拌混合，保温提取，然后经亲脂性有机溶剂萃取，水洗，低温真空浓缩，获得虾青素浓缩液。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征是红发夫酵母湿菌体的重量与含酸酸性有机溶剂的体积之比为1∶2～10。
7.根据权利要求5或6所述的提取方法，其特征是所述的含酸酸性有机溶剂中的酸为有机酸或无机酸，为乙酸、草酸、乳酸、硫酸、盐酸、磷酸中的一种，有机溶剂中酸的浓度为0.1％～10.0％。
8.根据权利要求5或6所述的提取方法，其特征是所述的含酸酸性有机溶剂中的有机溶剂为亲水性有机溶剂，为乙醇、丙酮、甲醇、二甲基亚砜中的一种。
9.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于所述的抗氧化剂为丁基羟基茴香醚、丁基羟四苯、维生素E中的任何一种，抗氧化剂的重量与含酸酸性有机溶剂的体积比为0.1％～1.0％。
10.根据权利要求5所述的提取方法，其特征是所述的亲脂性有机溶剂，为二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯、甲苯、乙醚、二硫化碳中的一种，亲脂性有机溶剂与含虾青素有机相的体积之比为1∶0.2～1.0。
全文摘要
一种红发夫酵母中虾青素的提取方法，红发夫酵母湿菌体与含抗氧化剂的有机酸或酸性有机溶剂搅拌混合提取虾青素，红发夫酵母湿菌体的重量与含酸和含抗氧化剂的有机酸或酸性有机溶剂的体积之比为1∶2～10，胞内虾青素通过细胞壁释放到胞外溶液中，然后经萃取、水洗和低温真空浓缩后获得虾青素浓缩液产品，本发明用有机酸或含酸酸性有机溶剂提取虾青素的提取收率达到90％以上，从酵母泥到虾青素浓缩液的总提取收率达到80％以上，且适合工业化生产。
文档编号C07C403/00GK1548420SQ0311703
公开日2004年11月24日 申请日期2003年5月17日 优先权日2003年5月17日
发明者郑裕国, 陈小龙, 汪钊, 沈寅初, 胡忠策 申请人:浙江工业大学