专利名称：通过固相技术经金属辅助的从固体载体上裂解制备m(co)的制作方法
技术领域：
本发明涉及放射性药物领域。本发明特别涉及通过金属辅助的从固体载体上裂解制备金属配位剂的方法。
在另一个方面中本发明涉及配位体与生物分子的新的固相结合的缀合物。
在另一个方面中本发明涉及新金属配位的配位体-生物分子缀合物、包括这些新配合物的组合物及其应用。
在另一个方面中本发明涉及用于制备诊断或治疗药物组合物的试剂盒。
为了在临床常规诊断或疗法中使用放射性标记的生物活性分子，即诸如，肽类，非常需要仅注射标记的化合物以避免相应受体的饱和来自″冷″未标记的化合物的体内毒性副作用。此外，大量标记的生物分子与受体结合破坏可能获得的清晰图像(闪烁图)，且由此通常不能获得清楚诊断。
根据本领域的状况，仅可以通过使用仍然产生定量标记的最低可能量(浓度)的衍生的生物分子(或与该生物分子偶联的99mTc的配位体)在正常均匀标记方法中获得高特异性活性。随配位体和配合物前体的不同，这些量通常必须相对较高，因为在低浓度下，配位率受到二级动力学控制且由此标记过于缓慢并伴有配位体或99mTc前体的分解。最低浓度限通常不易于常规应用，因为在这类浓度下条件稍加改变(温度、时间)不会产生定量标记的产物。相应地，副产物和分解产物以及原料仍然存在于最终溶液中。
从′热′化合物中以物理方式分离′冷′化合物的便利方法是通过使配位体-生物分子缀合物与固相材料结合并将其从伴随形成的配合物上裂解来进行。这类金属辅助的从固相上裂解的实例是罕见的。
美国专利US-5,789,555(Pollak等)描述了用锝-99m、铼-186或铼-188标记肽类的方法。该方法包括使所述肽类与固体载体通过与马来酰亚胺连接基形成的硫醚键共价偶联的步骤。通过将高锝酸盐引入载体，形成99mTcV(＝O)-肽配合物。在配合物形成时，99mTcV(＝O)通过打断C-S键催化从载体上裂解肽，由此从载体上释放99mTcV(＝O)-肽配合物。
从文献中得知被保护的硫醇类通过与Tc＝O中心配位释放保护基。基于这些发现，Pollak等(J.Am.Chem.Soc.121，11593-11594(1999)通过与金表面形成的硫醚键结合了四配位基螯合物。Tc(V)与这种配位体配位时，通过将S-Au-键打断为与Tc配位的硫使99mTc-配合物选择性释放入溶液中。
近来Dunn-Dufault等(Nucl.Med.Biol.27，803-807(2000)描述了这种方法的变化形式，通过使螯合物与有机聚合载体共价结合来进行。
上述用于生产Tc和Re标记的有机配合物的方法均取决于C-S或Au-S键的裂解。这种使配位体与固体载体共价结合的C-S和Au-S键对氧化敏感。因此，必须在还原条件下保存包括通过C-S键共价结合的配位体的固体载体。这对长期储存而言尤其重要。在还原条件下储存的必要性要求为储存采取的另外措施。此外，如果载体用于生产适合于药物施用的化合物，那么从药物安全性的观点来看，存在还原剂非常不理想。因此，对已知的固体结合配位体用于这类应用而言存在一定局限。
另外，这些金属氧化物种类的应用伴有对利用共同使用的配位体即四配位基的限制。现有技术中仅公开了用于99mTcV(＝O)中心的肽基配位体。
因此，存在对制备金属标记的配合物的新方法的需求，该方法通过固相技术经金属辅助的从固体载体裂解来进行，所述的固体载体使用固相结合的生物分子-配位体缀合物，它们在药物上可接受的条件下比现有技术的缀合物更为稳定。
另外，可以用于通过固相技术经金属辅助的裂解形成金属配位的配位体-生物分子缀合物的多种配位体的可用性是有利的，因为这种情况可以为这项技术提供更为灵活的应用。本发明的目的是提供用于制备标记的诊断和治疗化合物的改进方法。
在得到本发明的研究中，发现在有[Tc(H2O)3(CO)3]+存在的情况下，某些能够与金属配位并通过叔胺基团与固体载体结合的有机分子(配位体)在形成[Tc(CO)3-配位体]-配合物时从固体载体上裂解。选择性水解C-N键裂解显然由配合物形成过程中形成的低价羰基[Tc(H2O)3(CO)3]+中心介导且在没有[99mTc(H2O)3(CO)3]+存在的相同反应条件下不会发生。在从固体载体上释放后，前者叔胺以配位的仲胺存在。
提出这种[Tc(CO)3-配位体]-配合物的机理如下。当固体结合的螯合剂(所谓的配位体)的叔胺基团与[M(H2O)3(CO)3]n+的金属阳离子中心配位时，它带部分正电且相邻碳原子由此被活化用于亲核攻击。剩余的羟基攻击螯合剂的亚甲基并诱导C-N键裂解(附图2)。螯合剂第三供体部位与金属中心配位且产物配合物释放入溶液中。未配合的螯合剂和未裂解的配合物保持与固相结合。
发现通过如上所述从带有[99mTc(H2O)3(CO)3]+的固体载体水解裂解配位体获得的标记化合物具有极高的特异性活性，即在溶液中几乎没有未配位的配位体。溶液中未配位的配位体的量约为10-7M数量级。因此，可以有吸引力地研发这种特异性裂解反应以制备所谓的″无载体添加的″(n.c.a.)锝和其它具有相似化学反应性的金属的配合物。
因此，本发明涉及生产金属配位剂的新方法，包括在适宜条件下使通式(I)表示的固相结合的有机缀合物与(II)[M(H2O)3(CO)3]n+接触 其中球状体为固相；C为可以被一个或两个基团R4和R5取代的亚甲基，R4和R5特别可以为脂族或芳族取代基；或RO、RS或R2N，其中R为脂族基或芳族基；L为可以存在或可以不存在的连接基，它与固体载体偶联并具有激活对C基团的亲核攻击的特性且优选苯基、烷基、烯丙基或芳基；且R1和R2相同或不同且为金属配位基团或非配位的有机基团；所述的固相结合的有机缀合物用生物活性分子任选在R1和R2之一或两者上衍生；在(II)[M(H2O)3(CO)3]n+中，M选自锝(Tc)、铼(Re)、铑(Rh)、铂(Pt)、铱(Ir)和铜(Cu)组成的组且n为1、2或3，这取决于所述金属；所述的适宜条件为使[M(H2O)3(CO)3]n+与固相结合的有机缀合物的叔胺氮原子之间形成配价键，从而使如此形成的金属配位剂从载体上释放。
连接基可以存在或可以不存在。它可以已经存在于可用的固体载体上或可以以后引入。当它存在时，优选为C上亲核攻击的良好活化基团且选自苯基、乙烯基、芳基和其它非脂族或脂族基团。所述的苯基、乙烯基、芳基、其它非脂族或脂族基团可以被取代且如果它们被取代，那么它们优选被选自OR、R、NR2的吸电子基团取代，其中R为脂族基或芳族基。
在优选的实施方案中，连接基如通式II中所示 其中X1为C或O且X2为吸电子取代基且优选-OCH3。
当R1和R2或R1和R2之一为非配位有机基团时，它们选自烷基、苯基、苄基或其衍生物。
R1和/或R2优选选自下列基团组成的组 R3-NH2其中R3正是叔胺或为含有1-3个碳的脂族链。
金属M可以为任意金属且优选选自Tc、Re、Ru、Rh、Ir、Cu和Pt组成的组。最优选的金属为99mTc、186Re或188Re。
优选金属适合于例如通过传送高能粒子或顺磁特性用作显象剂或用作放射性核素。
可以通过本领域中公知的任意合适的方法制备[M(H2O)3(CO)3]n+。用于制备[M(H2O)3(CO)3]n+的适宜方法例如来自Alberto等(J.Am.Chem.Soc.123，3135-3136(2001))或WO98/48848(Alberto等)公开的permetallate形式。
不含固体载体的通式I分子在本文中称作配位体。该配位体特别可以为三齿配位体，条件是R1和R2选自下列基团组成的组
R3-NH2所述配位体还可以为二齿螯合物，条件是R1和R2或两者之一为脂族或芳族非配位基团。
本发明与[M(H2O)3(CO)3]n+联用的配位体可以多种三齿配位体，主要需要存在叔胺基作为配位体的中心部分，它形成与固体载体偶联的C-N键并在配合物形成时被裂解。优选所用的配位体基于脂族或芳族胺或羧酸酯类及其组合作为供体。配位体还可以为二齿螯合物，条件是R1和R2均不为非配位脂族或芳族基团。如实施例10中所示。
特别可以将二亚乙基三胺、甲基吡啶胺-N-乙酸、N-(2-氨乙基)-甘氨酸或亚氨基-二乙酸用作本发明中的配位体。
可以通过首先形成卤化树脂，例如通过Ngu和Patel所述的方法使配位体与固体载体共价连接(Tet.Lett.38，973-976(1997)。这种卤化树脂随后可以与被保护的配位体发生反应。在脱保护后，得到配位体结合树脂。如果配位体通过这种方法与固相结合，那么它与固体载体结合的共价键为C-N键。例如，还可以如实施例5、6、8和9中所述，通过还原氨化和/或用烷基卤烷基化由氨基树脂作为原料在固体载体上合成配位体。实施例1-9中更详细地讨论了吸附了的树脂的制备。
在本说明书中，术语配位体指的是含有能够与金属形成配位键而形成稳定的金属-配位体配合物的至少一个金属配位原子的化合物。含有一个以上金属配位原子的配位体可以称作螯合物或多齿配位体。二齿配位体为含有两个金属-配位原子的配位体，三齿配位体为含有三个金属-配位原子的配位体，且四齿配位体为含有四个配位原子的配位体。
可以与配位体偶联的生物活性分子(本文也称作″生物分子″)可以为在诊断或疗法中具有活性的任意分子。该分子可以偶联在除与固体载体连接的氮以外的任意位置上。它可以为使放射性产物定向于需要诊断或治疗位置的靶向分子或它可以具有不同于放射性标记的治疗活性。所述的生物活性分子可以选自下列分子组成的组氨基酸；甾类化合物；肽类；蛋白质，特别是结构蛋白质、酶或抗体；碳水化合物；多糖类和寡糖类；核苷、核苷酸、寡核苷酸和多核苷酸；脂类、肽类；和药物活性小分子，诸如中枢神经系统受体结合化合物。
所述的生物分子可以通过本领域中公知的任意合适的方法与所述的配位体连接，例如通过使醛还原氨化成配位体的伯胺基或通过在芳基体系上引入结合部位。生物分子可以在配位体与固体载体结合前或之后与配位体连接。
发现对固体载体的选择可以进一步改善本发明方法的效率。所述的固体载体可以在水中溶胀，它必须在反应条件下保持稳定且不必含有金属配位单位。特别在这种情况中，固体载体为聚乙二醇树脂或聚乙二醇与聚苯乙烯的杂化物，例如带有聚乙二醇间隔基与苄醇结合基的聚苯乙烯树脂。
本发明的方法可以进一步包括收集金属配位剂(即放射性药物)用于进一步应用的步骤。
在制备n.c.a.99mTc放射性药物后，可以收集、洗涤并重新使用固相聚合物。
优选该方法在约6.0-11.0范围、优选在约7.5-9.5范围的pH下进行。
进行该反应的适宜温度在约40-100℃范围。优选反应在约70-82℃范围的温度下进行。
本发明的另一个方面涉及通式I的固相结合的配位体-生物分子缀合物和包括这类化合物的组合物。优选这些组合物为可以在药物上可接受的条件下长期储存的形式。
使用本发明的方法可以通过过滤、但不需要进一步在标记后纯化而获得具有高特异性活性的金属配位的配位体-生物分子缀合物。
本发明的另一个方面涉及可使用本发明方法获得的金属配位的配位体-生物分子缀合物。通常这些缀合物包含在组合物中，该组合物是通过本发明方法获得的且特征在于它基本上不含未配位的配位体-生物分子缀合物，例如在含有这些缀合物的组合物中未配位的配位体-生物分子缀合物含量为10-7M。具有这类特征的组合物是本发明的另一个方面。
由于放射性药物中所用某些同位素、例如99mTc的半衰期短，所以将配位体-生物分子缀合物在使用前进行标记对配位的缀合物的特异性活性而言可能是重要的。在新标记的组合物中衰变的配合物的量低于在使用前长时间配位缀合物时的情况。
因此，本发明在另一个方面中涉及用于制备诊断或治疗药物组合物的试剂盒，包括含有通式(I)分子的容器，其中该分子与[M(H2O)3(CO)3]n+溶液发生反应。该容器可以为罐或柱。将[M(H2O)3(CO)3]n+溶液导入罐或柱以启动反应。该溶液可以为试剂盒的组成部分或可以通过其它方式提供。在可选的实施方案中，试剂盒中包括用于制备羰基金属[M(H2O)3(CO)3]n+的试剂。此外，该试剂盒可以包括过滤用具。
试剂盒的应用为可以形成的金属配合物提供了灵活性，因为可以恰在配位反应前选择合适的金属。
图1中解释了本发明的不添加载体(n.c.a.)的金属配位化合物的制备原理。三齿配位体，例如二亚乙基三胺通过连接基，本文为苄基衍生物通过叔胺与固体载体结合。使生物分子与螯合物(配位体)结合，由此形成配位体-生物分子缀合物。在引入[Tc(H2O)3(CO)3]+时，配合物形成且三齿配位体替代了两个水合配位体。[Tc(H2O)2(OH)(CO)3]+上剩余的羟基配位体可以攻击活化的亚甲基而诱导C-N-键裂解。通过使叔氨基与锝中心配位活化亚甲基，这一过程吸引来自螯合物的电子密度并使其对亲核攻击敏感。
具有对固相结合的生物分子-配位体缀合物的叔胺原子反应性的主要种类为[M(OH)(H2O)2(CO)3]。在溶液中，[M(OH)(H2O)2(CO)3]以[M(H2O)3(CO)3]n+形式和其它离解形式与缀合物保持平衡，这取决于溶液的pH。可以理解随pH的不同，因存在平衡而使[M(OH)(H2O)2(CO)3]至少部分可以与这些种类互变。
通过下面的非限制性实施例进一步解释本发明。在实施例中参照下列附图图1本发明不添加载体(n.c.a.)的金属配位化合物的制备原理。
图2配合物形成的机理。
图3裂解反应的pH依赖性。
图4裂解收率的温度依赖性。
图5实施例1、2、3、4和10的反应图解。
图6实施例5、6，、7、8和9的反应图解。
图7实施例11、12和13的反应图解。
图8实施例14和表1化合物的结构式。
图9含有生物活性分子的化合物的结构式。
实施例实施例1使模型配位体与适宜的固相树脂共价结合。该固相树脂必须在水中溶胀以使Tc-物质扩散且偶联配位体的结合基必须为用于亲核攻击的活化基团。聚苯乙烯/聚乙二醇树脂TentaGel S AC(Rapp Polymere GmbH，Tbingen，Germany)满足了这些要求。其活性部位苄醇衍生物被转化成相应的溴化物1(Ngu和Patel，Tet.Lett.38，973-976(1997))。
将N，N″-双(1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基)二亚乙基三胺(2)(101.8mg，235.9pmol)溶于DMF(5ml)，加入树脂1(196.6mg，47.2mol)并将该混合物在室温下缓慢搅拌22小时。过滤该反应混合物并用DMF(3次)、DMF和甲醇(3次，交替)和DMF(5次)洗涤树脂。通过用肼水合物在DMF(1ml)中的2％溶液将树脂洗涤10次5分钟除去保护基。过滤该反应混合物并用DMF(3次)、DMF和甲醇(5次，交替)、DMF(3次)和乙醚(3次)洗涤树脂。将树脂在高度真空中干燥而得到产物3，产量为192.3mg(97.8％；容量0.236mmol/g，偶联效率100％)。
通过显色试验观察固相树脂的游离氨基对碱性树脂使用溴酚蓝水溶液，而对伯胺类仅使用在DMF/二异丙基乙胺10∶1中的三硝基甲苯磺酸(TNBS)。树脂3在两种试验中显阳性，而被保护的中间体对TNBS染色显阴性。由通过元素分析测定的树脂的N-含量计算树脂的容量(以mmol结合的螯合剂/克计)和螯合剂与固体载体的偶联效率。
通过在室温下将树脂3在1mM[99Tc(H2O)3(CO)3]+溶液(7当量)中搅拌验证树脂3的螯合容量。通过β-液体闪烁计数分析过滤的溶液显示活性降低了14％，这一结果与在树脂上定量形成配合物一致。HPLC分析仅显示了原料峰，表明在这些适度条件下没有发生从固相的裂解。预先形成的99Tc-配合物在用于标记的条件下变稳定。甚至在80℃下的pH7.5的磷酸盐缓冲液中延长加热5小时在该溶液中也仅产生3％β-活性，至少低于预测值一个数量级。
实施例2使产生不带电荷的配合物的另一种三齿配位体与实施例1中所述相同的树脂结合。将N-甲基吡啶胺乙酸乙酯(54mg，280μmol)溶于DMF(3ml)并加入树脂1(280mg，67μmol)。将该混合物在室温下缓慢搅拌15小时，过滤该反应混合物并用DMF(3次)、DMF和甲醇(3次，交替)和乙醚(3次)洗涤树脂。被保护的中间体对溴酚蓝显阳性，而对TNBs染色显阴性。通过将树脂在水(5ml)和1M氢氧化钠(0.30ml)的混合物中缓慢搅拌28小时除去保护基。过滤树脂、用DMF(3次)、DMF和甲醇(3次，交替)、DMF(3次)和乙醚(3次)洗涤并在高度真空中干燥而得到产物4，产量为268mg(96％；容量0.209mmol/g，偶联效率87.1％)。树脂4在所有染色反应时均显阴性。
实施例3使产生带负电荷的配合物的另一种三齿配位体与实施例1中所述相同的树脂结合。将亚氨基二乙酸二甲基酯盐酸盐(6.4mg，33Fmol)和二异丙基乙胺(11.2μl，66μmol)溶于DMF(0.5ml)并加入树脂1(280mg，67μmol)。将该混合物在室温下缓慢搅拌24小时，过滤该反应混合物并用DMF(3次)、DMF和甲醇(3次，交替)和水(3次，交替)洗涤树脂。被保护的中间体对溴酚蓝显阳性，而对TNBs染色显阴性。用NaOH水溶液冲洗树脂除去保护基(0.1M，3小时，然后0.01M，12小时)。过滤树脂、0.1M NaOH(2次)、水(5次)、水和甲醇(3次，交替)，用甲醇(3次)和乙醚(3次)洗涤并在高度真空中干燥而得到产物5，产量为35mg(100％；容量4mmol/g，偶联效率18％)。树脂5对所有染色反应均显阴性。
实施例4使产生带负电荷的配合物的另一种三齿配位体与实施例1中所述相同的树脂结合。将N5-叔丁氧羰基-5-氨基-3-氮杂戊酸乙酯(74mg，280μmol)溶于DMF(3ml)并加入树脂1(300mg，72μmol)。将该混合物在室温下缓慢搅拌15小时，过滤该反应混合物并用DMF(3次)、DMF和甲醇(3次，交替)和乙醚(3次)洗涤树脂。被保护的中间体对溴酚蓝显阳性，而对TNBs染色显阴性。通过将树脂在水(5ml)和1M氢氧化钠(1.40ml)的混合物中缓慢搅拌28小时除去乙酯基。过滤树脂，用DMF(3次)、DMF和甲醇(3次，交替)、DMF(3次)和乙醚(3次)洗涤并在高度真空中干燥而得到Boc保护的酸。通过将树脂在TFA和DCM(1∶1)的混合物中搅拌5分钟、过滤并通过将树脂再在TFA和DCM(1∶1)的混合物中搅拌10分钟除去Boc基。如上所述洗涤得到产物6，产量为72mg(96％；容量22mmol/g，偶联效率94％)。树脂对6 TNBs染色显阴性。
实施例5NovaSyn TG树脂含有脂族氨基结合基。在本实施例中描述了在固体载体上合成螯合物甲基吡啶胺乙酸。
在室温下将NovaSyn TG树脂(100mg，30umol)和吡啶2-醛(14.3μl，150μmol)在甲醇(3ml)中搅拌20小时。过滤该反应混合物并用DMF(3次)和DMF和甲醇(3次，交替)洗涤树脂。向树脂中加入在DMF(2ml)中的三乙酰氧基硼氢化钠(31.8mg，150μmol)。在室温下搅拌5小时后，过滤该反应混合物并用DMF(4次)和甲醇(3次)洗涤树脂。向树脂中加入NaHCO3(10％水溶液)。3小时后，用DMF(3次)、水(3次)、乙醇(3次)和乙醚(3次)洗涤树脂并干燥至得到氨基吡啶中间体，它对溴酚蓝染色显阳性，而对TNBS染色显弱阳性。
向树脂中加入溴乙酸乙酯(16.6μl，150μmol)和二异丙基乙胺(5.1μl，30μmol)在乙醇(2.5ml)中的混合物。在室温下搅拌24小时后，过滤该反应混合物并用乙醇(5次)洗涤树脂且干燥。向树脂中加入NaOH(1M)以除去乙酯保护基。在室温下搅拌1天后，过滤该反应混合物并用水(5次)、乙醇(3次)和乙醚(2次)洗涤树脂且干燥至得到8，产量为86.4mg(83.7％；容量0.10mmol/g，偶联效率43％)。
实施例6使NovaSyn TG树脂(100mg，30mol)、溴乙酸乙酯(33.21，300mol)和二异丙基乙胺(12.9J.1，75Fmol)如实施例5第二部分中所述反应而得到9，产量为96.2mg(93％)。
实施例7NovaSyn TGT树脂含有羟基三苯甲基结合基。如所述将羟基转化成氯化物(J.M.J Frechert等，Tetrahedron Lett.1975，3055)。
将亚氨基乙酸二甲基酯盐酸盐(16.2mg，82umol)和二异丙基乙胺(21ul，123umol)溶于DMF(2ml)。加入氯化Novasyn TGT树脂(41umol)。如实施例3中所述进行偶联反应和酯水解，但不包括在3小时反应时间后加入二异丙基乙胺(14ul，82umol)。得到产物10，产量为132mg(81％；容量0.015mmol/g，偶联效率6％)。
实施例8NovaSyn TGR树脂含有氨甲基结合基与在亚甲基上的两个芳基取代基。按照与实施例5中所述合成8类似的方法制备树脂11。
使NovaSyn TG R树脂(166mg，30umol)与实施例5中所述相同量的试剂反应而得到11，产量为153mg(90％；容量0.08mmol/g，偶联效率44％)。
实施例9按照与实施例6中所述合成9类似的方法制备树脂12。
使NovaSyn TGR树脂(166mg，30umol)与实施例6中所述相同量的试剂反应而得到12，产量为142.2mg(84％)。
实施例10在本实施例中，使二齿螯合物与Tentagel S AC溴化物1结合。
将N，N′-二甲基乙二胺(110ul，1040umol)溶于DMF(1ml)，加入树脂1(108.6mg，26mol)并将该混合物在室温下缓慢搅拌24小时。过滤该反应混合物并用DMF(3次)、DMF和甲醇(3次，交替)、水(3次)、DMF和异丙醇(3次，交替)、水(3次，异丙醇(3次)和乙醚(3次)洗涤树脂。将树脂在高度真空中干燥而得到13，产量为101.6mg(98.1％；容量0.24mmol/g，偶联效率100％)。对溴酚蓝树脂13显阳性，而对TNBs染色显阴性。
实施例11在本实施例中描述了产生嵌入双链DNA的生物活性配合物的缀合物的合成。使生物活性单位芘衍生物结合在固体载体上的螯合单位上。
如制备3中所述使N-Boc-N″-Dde被保护的二亚乙基三胺与1偶联。双保护的中间体对溴酚蓝显阳性，而对TNBs染色显阴性。通过将树脂在肼水合物(1.5ml，在DMF中2％)中搅拌5次10分钟，随后过滤除去De保护基。用TNBS染色显阳性证实除去了Dde保护基。通过还原氨化引入芘基。向单保护的树脂(103mg，24μmol)中加入1-芘醛(28.5mg，120μmol)和甲醇(4ml)并将该混合物在室温下搅拌20小时。过滤并用DMF洗涤后，加入在DMF(5ml)中的三乙酰氧基硼氢化钠(25mg，120μmol)并将该混合物在室温下搅拌24小时。用DMF和甲醇(如上所述)洗涤得到Boc-保护的树脂结合的芘二亚乙基三胺衍生物，它对溴酚蓝显阳性，而对TNBs染色显阴性。最终通过将树脂在三氟乙酸(在CH2Cl2中50％)中搅拌5分钟，随后过滤并用三氟乙酸(在CH2Cl2中50％)处理10分钟除去Boc保护基。洗涤(如上所述)得到产物7(容量0.18mmol/g，偶联效率82％)。树脂7对溴酚蓝显阳性，而对TNBs染色显阴性。
实施例12在本实施例中，使生物素(维生素H)与螯合单位结合。与实施例11相反，在与固体载体结合前合成螯合物/生物分子-缀合物。将三亚乙基四胺(0.150ml，1.00mmol)溶于THF(30ml)并将该溶液冷却至-78℃。在-78℃下30分钟内加入三氟乙酸乙酯(0.109ml，1.00mmol)在THF(5ml)中的溶液并将该溶液在相同温度下搅拌4小时。然后将其加热至0℃。
同时将在DMF(8ml)中的(+)-生物素(244mg，1.00mmol)加热至80℃而得到无色溶液。向该热溶液中加入N，N′-二环己基碳化二亚胺(216mg，1.05mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(121mg，1.05mmol)。将该混合物缓慢冷却至室温。白色粉末沉淀。持续搅拌4小时。
将这两种混合物在0℃下混合并搅拌30分钟而得到白色凝胶。蒸发THF至得到白色混悬液。在室温下搅拌18小时后。在真空中蒸发溶剂并向残余物中加入水。将pH调节至3-4。过滤该混合物，中和洗脱液并在真空中除去水。通过柱色谱法(二氧化硅，二氯甲烷/甲醇/三乙胺5∶1∶0.1)提纯而得到N-生物素基-N-三氟乙酰基-三亚乙基四胺，产量为60.5mg(0.129mmol，12.9％)。通过质谱法和NMR验证结构。
如实施例1中所述使N-生物素基-N-三氟乙酰基-三亚乙基四胺(40.3mg，86umol)、三乙胺(1.8ul，17umol)和树脂1(71.7mg，17umol)反应。将TFA-树脂在高度真空中干燥至得到产物14，产量为67mg(85％，容量3mmol/g，偶联效率13％)。树脂14对溴酚蓝显阳性，而对TNBs染色显阴性。根据TNBS染色时的阴性结果，用碳酸钠(10％水溶液)除去TFA的保护基的尝试失败。
实施例13在本实施例中描述了制备标记的肽衍生物的方法。使含有游离羧基端基的被保护的二肽与部分保护的多胺偶联。除去所有的保护基并引入Dde保护以便选择性打断肽和螯合物上的伯氨基。这可以使缀合物通过由螯合物的未被保护的仲氨基之一形成叔氨基而选择性结合固体载体。
将N，N′，N″-三(叔丁氧羰基)三亚乙基四胺(103.3mg，234.5umol)、Boc-Phe-Gly-OH(75.6mg，234.5umol)、PyBOP(183mg，352mol)和二异丙基乙胺(20ul，117umol)溶于二氯甲烷(2.5ml)。将该溶液在室温下搅拌4小时。定期加入二异丙基乙胺(20ul，117umol)以保持pH＞7。在真空中除去溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯并用盐水(3次)、0.5M冷HCl(3次)、10％NaHCO3(2次)和盐水(3次)洗涤。用MgSO4干燥有机相并在真空中除去溶剂而得到N-(叔丁氧羰基-苯丙氨酰基-甘氨酰基)-N′，N″，N-三(叔丁氧羰基)-三亚乙基四胺，产量为175.2mg(231.6umol，98.8％)。通过质谱法和NMR验证结构。
通过将产物(162.2mg，0.169mmol)在HCl的乙酸乙酯溶液(约1M，3ml)中搅拌除去Boc保护基。在室温下搅拌9小时后，在真空中除去溶剂。将残余物溶于水并搅拌1小时(pH为2-3)，然后加入NaOH(1M，313mmol)以中和该溶液并在真空中蒸发溶剂而得到定量产量的H-Phe-Gly-NH-C2H4-NH-C2H4-NH-C2H4-NH2。通过质谱法和NMR验证结构。
将H-Phe-Gly-NH-C2H4-NH-C2H4-NH-C2H4-NH2(113mg，0.152mmol)和2-乙酰基双甲酮(Dde-OH)(70.0mg，0.335mmol)溶于乙醇(4ml)。在室温下搅拌20小时后，通过TLC分析显示所述胺完全转化成单一产物。除去溶剂而得到Dde-Phe-Gly-NH-C2H4-NH-C2H4-NH-C2H4-NH-Dde。通过质谱法验证结构。不经分离剩余2-乙酰基双甲酮而使用粗产物。
如实施例1中所述使Dde-Phe-Gly-NH-C2H4-NH-C2H4-NH-C2H4-NH-Dde(76mol)和树脂1(79.2mg，19umol)反应。被保护的中间体对溴酚蓝显阳性，而对TNBs染色显阴性。也如实施例1中所述除去Dde保护基而得到产物15。树脂15对溴酚蓝显阳性，而对TNBs染色显阴性。
实施例14标记条件使用碳酸硼试剂盒由[99mTcO4]-制备[99mTC(H2O)3(CO)3]+(Alberto等，J.Am.Chem.Soc.123，3135-3136(2001))。向[99mTC(H2O)3(CO)3]+-溶液(1ml)中加入1mg固相结合的螯合物(0.2mmol)，将该混合物短暂超声处理且然后加热至82℃ 30分钟。通过过滤从固相树脂中分离该溶液并通过带有γ-检测的HPLC分析。
由于使用了所有的固相结合的螯合物，所以观察到形成可溶性配合物。产率随螯合物类型和反应条件的不同在5-50％之间改变(标1)。
实施例15按照单罐法标记树脂3和4，将[99mTC(H2O)3(CO)3]+形成与裂解反应合并。向碳酸硼试剂盒中加入1mg固相结合的螯合物(0.2mmol)(MallinckrodtMedical，Petten，the Netherlands；Alberto等，J.Am.Chem.Soc.123，3135-3136(2001))。将从发生器中洗脱的NaTcO4加入到小瓶中并将该混合物保持在78℃-82℃下20-60分钟。PH为11。裂解收率为8-32％，高锝酸盐的转化率为40-54％。
实施例16就在树脂4上的标记反应而言，改变诸如pH值和反应温度的反应条件以找到最佳反应条件。为了用作放射指示剂，要求原料[99mTC(H2O)3(CO)3]+的完全转化和形成一种单产物。因样品的放射性及其快速衰变(t1/2＝6.2小时)而必须避免在标记步骤后的纯化步骤。需要高裂解收率以得到高放射性溶液。
裂解反应的pH依赖性如附图3中所示。裂解收率从pH6开始在pH8.5时增加到最大值。这一结果与[99mTC(H2O)3(CO)3]+脱质子化成[99mTC(OH)(H2O)2(CO)3]的结果一致(铼类似物的pKs7.5；Egli等，Organometallics 16，1833-1840(1997))且由此使用Tc-配位的羟基离子是攻击CH2-基团的亲核体以裂解C-N键的理论。将pH增加至11再次降低了裂解收率。这可能是由于形成带负电荷的物质[99mTC(OH)2(H2O)(CO)3]-所致，它降低配位氨基的亲电性。
通过分析[99mTC(H2O)3(CO)3]+完全转化后的反应产物研究树脂4与[99mTC(H2O)3(CO)3]+反应的温度依赖性。在室温下，仅在树脂上形成配合物，从固相过滤后的溶液没有显示出放射性。在43℃时，观察到裂解收率，但较低。然后随温度的增加而增加(图4)。这一结果清楚地表明树脂上配合物形成与裂解反应之间有竞争性，其中裂解反应具有较高的反应能垒。然而，鉴于固相树脂和结合的生物分子的稳定性，极高的温度可能是缺点。对树脂4而言优选70℃-82℃的反应温度。
表1固相结合的螯 裂解的99mTC- 裂解收率 条件合剂(树脂)配合物3(TentaGel) 27％ 1小时82℃4(TentaGel) 52％ 1小时82℃28％ 2小时56℃5(TentaGel) 20％ 1小时82℃6(TentaGel) 22％ 1小时82℃7(TentaGel) 5％ 1小时82℃8(NovaSyn TG)8％ 1小时82℃9(NovaSyn TG) 11％ 1小时82℃4％ 3小时56℃
10(NovaSyn TGT) 93％ 1小时82℃79％ 3小时56℃11(NovaSyn TGR) 53％ 1小时82℃15％ 3小时56℃12(NovaSyn TGR) 83％ 1小时82℃78％ 3小时56℃13(TentaGel)10％ 1小时82℃14(TentaGel) 14％ 1小时82℃14(TentaGel)13％ 2小时82℃
权利要求
1.生产金属配位剂的方法，包括在适宜条件下使通式I表示的固相结合的有机缀合物与(II)[M(H2O)3(CO)3]n+接触 其中球状体为固相；C为可以被一个或两个基团R4和R5取代的亚甲基，R4和R5特别可以为脂族或芳族取代基；或RO、RS或R2N，其中R为脂族基或芳族基；L为可以存在或可以不存在的连接基，它与固体载体偶联并具有激活对C基团的亲核攻击的特性且优选苯基、烷基、烯丙基或芳基；且R1和R2相同或不同且为金属配位基团或非配位的有机基团；所述的固相结合的有机缀合物用生物活性分子任选在R1和R2之一或两者上衍生；在(II)[M(H2O)3(CO)3]n+中，M选自锝(Tc)、铼(Re)、铑(Rh)、铂(Pt)、铱(Ir)和铜(Cu)组成的组且n为1、2或3，这取决于所述金属；所述的适宜条件为使[M(H2O)3(CO)3]n+与固相结合的有机缀合物的叔胺氮原子之间形成配价键，从而使如此形成的金属配位剂从载体上释放。
2.权利要求1的方法，其中所述的连接基选自苯基、乙烯基、芳基和其它非脂族基和脂族基组成的组。
3.权利要求2的方法，其中所述的苯基、乙烯基、芳基或其它非脂族基和脂族基被选自OR、R、NR2的吸电子基团取代，其中R为脂族基或芳族基。
4.权利要求2的方法，其中所述的连接基如通式II所示 其中X1为C或O且X2为吸电子取代基且优选-OCH3。
5.权利要求1的方法，其中R1和/或R2选自下列基团组成的组 R3-NH2
6.权利要求1的方法，其中R1和R2为脂族或芳族取代基，诸如-CH3、CxH5或CH2C6H5。
7.权利要求1的方法，其中M选自Tc、Re、Ru、Rh、Ir、Cu和Pt组成的组。
8.如权利要求7中所述的方法，其中所述的金属选自99mTc、186Re和188Re组成的组。
9.权利要求1的方法，其中所述的生物分子选自下列分子组成的组氨基酸；甾类化合物；肽类；蛋白质，特别是结构蛋白质、酶或抗体；碳水化合物；多糖类和寡糖类；核苷、核苷酸、寡核苷酸和多核苷酸；脂类、肽类；和药物活性小分子，诸如中枢神经系统受体结合化合物。
10.权利要求1的方法，其中固体载体为聚乙二醇树脂或聚乙二醇与聚苯乙烯的杂化物，例如带有聚乙二醇间隔基与苄醇结合基的聚苯乙烯树脂。
11.权利要求1的方法，进一步包括收集金属配位剂以便进一步应用的步骤。
12.权利要求1的方法，其中该方法在约6.0-11.0范围、优选在约7.5-9.5范围的pH下进行。
13.权利要求1的方法，其中该方法在约40-100℃范围、优选在约70-82℃范围的温度下进行。
14.权利要求11的方法，进一步包括将收集的金属标记的缀合物制成药物上可接受的形式。
15.通式I表示的固相结合的有机缀合物 其中L、C、R1、R2、R4和R5如权利要求1中所定义。
16.权利要求15的固相结合有机分子，其特征在于所述的生物活性分子选自下列分子组成的组氨基酸；甾类化合物；肽类；蛋白质，特别是结构蛋白质、酶或抗体；碳水化合物；多糖类和寡糖类；核苷、核苷酸、寡核苷酸和多核苷酸；脂类、肽类；和药物活性小分子，诸如中枢神经系统受体结合化合物。
17.权利要求15的固相结合有机分子，其中固体载体为聚乙二醇树脂或聚乙二醇与聚苯乙烯的杂化物，例如带有聚乙二醇间隔基与苄醇结合基的聚苯乙烯树脂。
18.如表1中所示的权利要求15的固相结合有机分子。
19.通过权利要求1所述方法获得的金属配位有机分子。
20.用于制备诊断或治疗药物组合物的试剂盒，包括含有通式(I)分子的容器，其中可以发生所述分子与[M(H2O)3(CO)3]n+溶液的反应。
21.如权利要求20中所述的试剂盒，其中所述的容器为罐或柱。
22.如权利要求20中所述的试剂盒，进一步包括[M(H2O)3(CO)3]n+溶液。
23.如权利要求20中所述的试剂盒，进一步包括用于制备羰基金属[M(H2O)3(CO)3]n+的试剂。
24.如权利要求20中所述的试剂盒，进一步包括过滤用具。
全文摘要
本发明涉及生产水溶性金属配位剂的方法，包括在适宜条件下使通式I表示的固相结合的有机缀合物与[M(H
文档编号C07F1/08GK1703249SQ03820789
公开日2005年11月30日 申请日期2003年9月2日 优先权日2002年9月3日
发明者罗杰·艾伯托, 斯蒂芬·芒德威勒 申请人:苏黎世大学