专利名称：诊断心力衰竭的特异性抗体proBNP(1－108)的制作方法
技术领域：
本发明涉及室性心力衰竭的体外诊断领域。
充血性心力衰竭是一种常见的临床综合征，特别是在老年个体中。它通常表现为非特异性症状的潜伏触发，如运动引起的咳嗽、疲劳和周围水肿的出现。诊断通常是根据不同参数的研究，如临床指征(分类为4个阶段NYHA(即纽约心脏协会)的I-IV阶段)、超声心动图显象、闪烁显像、运动试验等。
由于心脏病的严重性，以及高昂的治疗费用，显然该综合征的早期诊断是非常希望的这将有助于防止该综合征快速发展为重度心力衰竭。因此，确定具有心力衰竭危险的个体是必需的。这也能够适应更快速、更容易、更便宜的治疗监测。遗憾的是，还没有完全满意的并且能够提供全部信息的诊断心力衰竭的方法。
预测心力衰竭的症状发生前标志物已经寻找了很长时间。在这方面，心肌细胞产生并分泌具有促尿钠排泄活性的肽的事实已经得到证实一种心房来源的肽，ANP(心钠素)，由Bold等人.Life Science 1981，vol.28(1)89-94在大鼠中发现，以及一种房室来源的促尿钠排泄肽，被称为BNP(脑钠素)，由Sudoh等人，Nature 1988，vol.33278-81在猪中发现，然后在人类中发现。
BNP的前体是preproBNP(1-134)，它是该分子在心肌细胞中的一种贮存形式。该前体被切割后释放信号肽和proBNP(1-108)。proBNP(1-108)由108个氨基酸的多肽组成，其序列为H1PLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR76S77PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH108(SEQ ID No.1) 在分泌之前和/或分泌过程中，它在氨基酸Arg76与Ser77之间被切割，首先产生BNP，也被称为BNP(77-108)或BNP-32，或者BNP(1-32)，以及该激素原的N端部分，BNP(1-76)，也被称为proBNP的N端片段或NT-proBNP。
BNP或BNP(77-108)是该分子的一种血管反应性形式，由32个氨基酸的肽组成，其序列为S77PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH108(SEQ ID No.2).
NT-proBNP或BNP(1-76)由proBNP(1-108)的76个N端氨基酸组成，构成下列序列H1PLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR76(SEQ ID No.3).
在显示心室营养不良的患者中，血液中激素BNP、BNP(77-108)的水平较高。而且也已经描述了血浆中BNP(77-108)的测定，用它作为预测室性心力衰竭的一种标志物。然而，众所周知，激素BNP(77-108)相对不稳定。因此，它的测定需要特别注意(Davidson，N.C.等人.Circulation 1995；911276)(Gobinet-Georges等人.Clin.Chem.Lab.Med.2000；38519-23)。另外，BNP的半衰期极短，其血浆浓度不是很高。因此，在具有心力衰竭危险的个体中得到一定数量的假阴性结果。因此，对BNP(77-108)的测定不能准确地区别处于NYHA分类阶段I的患者与正常个体(Clerico A.等人.J.Endocrinol.Invest.1998；21170-9)(Del Ry S.等人.Scand.J.Clin.Lab.Invest.2000；6081-90)。
为了避免这一困难，专利申请WO 93/24531描述了一种体外诊断心力衰竭的方法，该方法以BNP(1-76)(proBNP的N端片段)的检测为基础，BNP(1-76)是一种富含的化合物，其半衰期比BNP(77-108)激素更长。然而，申请WO 93/24531描述的方法似乎不能简单地对血样中的BNP(1-76)进行。实际上，所述的实施例不能对真正的血清进行，而是对利用合成肽BNP(47-64)——BNP(1-76)的子序列——获得的标准范围进行。为了克服这一缺点，证明非常复杂的自动化系统是必要的。
文章Hunt等人.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，vol.214(3)，1995，1175-1183描述了一种测定BNP的竞争性RIA测定，该方法对心力衰竭患者的血浆进行，涉及一种抗proBNP(1-13)N端片段的抗血清。该文章准确地证实，在心力衰竭患者中，与BNP(77-108)水平有极佳相关性的BNP(1-76)水平大大高于对照个体中观察到的水平。然而，描述的仅仅特异提取血浆BNP(1-76)的方案很复杂，因为它需要用Sep-pak C18TM柱(Millipore-Waters)随后通过HPLC层析提取血浆。而且，该文章强调，在这样使用的RIA测定中，proBNP(1-108)似乎不被识别。这提示proBNP(1-108)能够从心脏组织分泌到循环中，但是然后可能通过N端酸的切割被快速降解为较小的肽。此外，根据该文章所述，proBNP(1-108)也可能以抗proBNP(1-108)抗血清不能与之结合的方式存在。最后，他们也提出，BNP(1-76)(proBNP的N端片段)甚至可能是比BNP(77-108)或者比proANP的N端片段更特异的一种心脏功能障碍标志物。
文章Karl等人.(Scand.J.Clin.Lab.Invest.1999；59(suppl230)177-181)描述了一种检测BNP(1-76)的方法，该方法类似于专利申请WO 93/24531，但是未提供对患者标本获得的任何结果。
文章Schulz等人.Scand.J.Clin.Lab.Invest.，2001，vol.61，pp.33-42也描述了一种BNP(1-76)(proBNP的N端片段)特异的放射免疫测定，该方法不需要提取，使用抗该片段的氨基酸1-21的抗血清。作者证实了BNP(1-76)测定在诊断室性心力衰竭中的优点，以及它与BNP(77-108)测定的良好相关性。在proBNP(1-108)的多种循环形式的研究中，他们提出了如下假说proBNP(1-108)将以完整激素原的形式和切割产物BNP(1-76)(proBNP的N端片段)和BNP(77-108)的形式在血液中循环。然而，该文章未提及或者建议proBNP(1-108)的任何可能的生理活性，或者proBNP(1-108)作为室性心力衰竭的预测或诊断标志物的任何诊断价值。
文章Shimizu等人.Clinica Chimica Acta，2002，vol.316，pp.129-135描述了对血液中人BNP的降解和心力衰竭患者血浆中免疫反应性BNP的循环分子形式的一项研究。在后者的血浆中发现存在两种免疫反应性BNP形式一种高分子量BNP(36KD，可能对应于proBNP(1-108)的三聚体)，和一种低分子量BNP。后者对应于同时存在BNP-32的一种形式的降解产物，其丢失了BNP-32的激素形式的N端丝氨酸和脯氨酸(即脱-SerPro-BNP(BNP3-32))(在此被称为BNP(1-32))。因此心脏分泌proBNP(1-108)和激素BNP(BNP-32、BNP(1-32)或BNP(77-108))到血液中。然而，作者似乎提出，寡聚形式(三聚体)的proBNP(1-108)以类似于循环BNP(77-108)的浓度存在，但是他们没有进行测定。因此没有研究proBNP(1-108)浓度与患者的临床状况之间的关系。同时其中也没有证明血清proBNP(1-108)的诊断或预后价值；也没有提出能够常规测定后者。
而且，已经知道proBNP(1-108)上存在一定数量的表位。因此，在BNP(77-108)的检测中，对应于BNP(77-108)的10个N端氨基酸(AA1-10)的序列S77PKMVQGSGC86(SEQ ID No.105)的表位在申请WO97/32900中描述。类似地，在BNP(1-76)(proBNP的N端片段)的检测中，对应于BNP(1-76)(proBNP的N端片段)的12个C端氨基酸的序列R65KMVLYTLRAPR76(SEQ ID No.106)的表位在申请WO 00/35951中描述，一个类似的序列H64RKMVLYTLRAPR76(SEQ ID No.107)在申请WO 00/45176中描述。然而，这些专利申请均未描述或者提出存在一种表位，它是这些序列的一种中间物或杂合物。
因此，在心力衰竭的早期诊断方面仍然需要一种能够避免现有技术的缺点的方法。具体而言，需要一种简单的方法，它能够常规使用并且可靠，能够避免检测BNP(77-108)的缺点，因为BNP(77-108)是一种不是非常富含并且相对不稳定的分子，而同时可避免复杂的提取，复杂的提取是测定BNP的其它分子形式所致的，可能需要复杂的自动化才能进行。
因此，本发明的作者努力发展了一种备选方法来解决提出的问题。本发明的中心是发明人意外地发现，在proBNP(1-108)的铰链序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85(SEQ ID No.4)或序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84(SEQ ID No.108)的结构域中存在一种具有独特性质的表位，并且至少含有序列RAPR76S77P(SEQ ID No.5)。
实际上，当用序列为CY70TLRAPR76S77PKMVQGSG85(SEQ ID No.16)的proBNP(1-108)铰链区的肽免疫兔子，或者用序列为CY70TLRAPR76S77PKMVQGS84(SEQ ID No.109)的肽免疫兔子时，他们惊讶地发现，获得的抗血清不仅含有特异地识别该铰链区的肽而基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)形式的抗体，而且还具有识别循环proBNP(1-108)的能力。
本申请的作者也第一次证实，循环proBNP(1-108)是预测心力衰竭的一种有效的标志物，它在心力衰竭患者中的浓度显著高于正常对照个体。
作者也发现，获得这类抗体的另外一种方法是用完整的proBNP(1-108)分子免疫动物。实际上，作者发现，用完整的proBNP(1-108)分子免疫能够诱导产生可特异地识别铰链区的序列的抗体。
另外，本发明的作者也证明，可被根据本发明的抗体识别的最小表位含有下列序列RAPR76S77P。他们也证明，获得作为本发明的主题的抗体的一种成功方法是用下列通式的一种肽免疫动物a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)其中，a1可以是H，或者可以代表如下官能团或化学基团，其选自硫醇、醇、氨氧基、伯胺或仲胺官能团、氨基羧基、生物素基和乙酰基，X1代表一种0-3个氨基酸的肽序列，它可能来源于或者可能不来源于proBNP(1-108)的天然序列，X2代表一种0-8个氨基酸的肽序列，优选地7个氨基酸的肽序列，它可能来源于或者可能不来源于proBNP(1-108)的天然序列，a2可以代表OH基、NH2基或烷氧基。
类似地，本发明的作者证明，用含有序列RAPR76S77P的肽或者用下列通式的肽免疫动物能够获得相同的特异性抗体X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)其中X可以是H，或者可以代表乙酰基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸。
另外，本发明的作者也证明，用下列通式的肽免疫动物能够获得相同的特异性抗体X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)其中X可以是H，或者可以代表乙酰基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸。
本发明的作者也发展了一种简单、可靠的早期诊断心力衰竭的方法，该方法以血液中循环proBNP(1-108)的检测为基础，并且研制了一种进行这种循环proBNP(1-108)检测的试剂盒。
因此本发明的一个主题是一种抗proBNP(1-108)抗体，其特征在于首先，它特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85，并且基本上不识别BNP(1-76)或BNP(77-108)，其次，它能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)。
本发明的一个主题也是一种抗-proBNP(1-108)抗体，其特征在于首先，它特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84，并且基本上不识别BNP(1-76)或BNP(77-108)，其次，它能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)。
具体而言，本发明的一个主题是一种抗-proBNP(1-108)抗体，其特征在于首先，它特异地识别proBNP(1-108)的序列RAPR76S77P，并且基本上不识别BNP(1-76)或BNP(77-108)，其次，它能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)。
本发明的一个主题也是一种获得抗-proBNP(1-108)抗体的方法，这些抗体特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)，该方法的特征在于用完整的proBNP(1-108)分子免疫动物，然后用BNP(77-108)肽和/或BNP(1-76)肽消耗所获得的抗血清。
表述获得的针对特定抗原(免疫抗原)的“抗血清的消耗”是指除去该抗血清中可能存在的非特异性抗体，方法包括使该抗血清与“非特异性抗原”，即与免疫抗原不同的抗原接触并温育，然后免疫学分离并除去可与该“非特异性抗原”反应的抗体，回收这样消耗的(即消耗非特异性抗体的)抗血清。消耗通常用来使针对指定抗原的抗血清具有特异性。
在这种情况下，识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85和/或序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84或序列RAPR76S77P的抗血清能够被消耗，即通过将其与上述BNP(77-108)和/或BNP(1-76)接触使之具有特异性，例如，对于后者能够固定在一个固相中，并且按照本领域技术人员公知的常规技术通过免疫吸附作为层析的支持体。在此，消耗的抗血清中最后存在的抗体是一种单特异性多克隆抗体。
本发明的一个主题也是下列通式的一种肽a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)其中a1可以是H，或者可以代表如下官能团或化学基团，其选自硫醇、醇、氨氧基、伯胺或仲胺官能团、氨基羧基、生物素基和乙酰基，X1代表一种0-3个氨基酸的肽序列，其可能来源于或者可能不来源于proBNP(1-108)的天然序列，X2代表一种0-8个氨基酸的肽序列，优选地7个氨基酸的肽序列，其可能来源于或者可能不来源于proBNP(1-108)的天然序列，a2可以代表OH基、NH2基或烷氧基。
本发明的一个主题也是下列通式的一种肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)其中X可以是H，或者可以代表乙酰基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸。
本发明的一个主题也是下列通式的一种肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)其中X可以是H，或者可以代表乙酰基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸。
应当指出，在上述通式(II)和(III)中，氨基酸编号(Y70、R76、S77、S84或G85)只是用来帮助理解本发明，以及确定该序列相对于proBNP(1-108)序列的位置。对于本申请中给出编号的其它序列同样如此。
本发明也涉及含有下列序列的任何肽序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)，或者序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)，或者分别在氨基酸位点70-85或84之一处保守或非保守置换的上述序列(II)或(III)之一，只要使RAPR76S77P部分保持完整(特别是未置换)。
因此是指一种肽，其含有通过氨基酸Y70、T71、L72、K79、M80、V81、Q82、G83、S84和G85中的一个或多个的置换，衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)或者衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)的一种序列，X可以缺失或者代表NH2基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，Z可以缺失，或者代表OH基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸。
最后，本发明涉及序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85的肽，以及序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84的肽。
本发明的一个主题也是一种获得抗-proBNP(1-108)抗体的方法，该抗体特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)的序列，并且能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)，该方法的特征在于用下列通式的肽免疫动物a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)其中，a1、X1、X2和a2的含义与上述相同，任选地，用BNP(77-108)肽和/或BNP(1-76)肽消耗所获得的抗血清。这样获得的抗体是一种单特异性抗体。
本发明的主题也是一种获得抗-proBNP(1-108)抗体的方法，该抗体特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)，该方法的特征在于用通式X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)的肽或者用通式X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)的肽免疫动物，其中X和Z如上所述定义，任选地，用BNP(77-108)肽和/或BNP(1-76)肽消耗所获得的抗血清。
本发明的一个主题也是获得一种杂交瘤的一种方法，该杂交瘤分泌抗-proBNP(1-108)抗体，该抗体特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)，该方法的特征在于用通式X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)的肽或者用通式X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)的肽免疫动物，所述肽是保守或非保守置换的形式，只要使得RAPR76S77P部分保持完整(特别是未置换)，其中X和Z如上所述定义，任选地，用BNP(77-108)肽和/或BNP(1-76)肽消耗所获得的抗血清。
本发明的主题也是一种获得抗-proBNP(1-108)抗体的方法，该抗体特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)，该方法的特征在于用序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85的肽或者用序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84的肽免疫一种动物，任选地，用BNP(77-108)肽和/或BNP(1-76)肽消耗所获得的抗血清。
本发明的一个主题也是获得一种杂交瘤的方法，该杂交瘤分泌抗-proBNP(1-108)抗体，该抗体特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)，该方法的特征在于-用如下肽免疫动物，所述肽选自下列通式的肽a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)其中，a1、X1、X2和a2的含义与上述相同，X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II)其中X和Z的含义与上述相同，X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)其中X和Z的含义与上述相同，X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II)其为保守或非保守置换的形式，只要使RAPR76S77P部分保持完整(特别是未置换)，其中X和Z的含义与上述相同，X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)其为保守或非保守置换的形式，只要使RAPR76S77P部分保持完整(特别是未置换)，其中X和Z的含义与上述相同，Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85和Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84；-从该动物中提取分泌免疫球蛋白的淋巴细胞，并且-使该淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，获得至少一种分泌免疫球蛋白的杂交瘤。
这相当于获得杂交瘤的常规技术，其原理在Khler和Milstein，(1975)Nature(London)，256495-497中描述。
本发明的一个主题也是这样一种杂交瘤和该杂交瘤分泌的抗-proBNP(1-108)单克隆抗体。
本发明的一个主题也是人类心力衰竭的一种体外诊断方法，包括使生物标本，优选地血液、血浆或血清，与一种抗-proBNP(1-108)抗体接触，该抗体特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)，以及检测标本中的proBNP(1-108)。
本发明通常提供人类心力衰竭的一种体外诊断方法，包括a)使生物标本，优选地血液、血浆或血清，与一种抗-proBNP(1-108)抗体接触，该抗体特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)，b)在允许形成抗原-抗体复合物的条件下温育该混合物，和c)任选地使用能够与初级(primary)复合物中存在的proBNP(1-108)特异结合的经标记的检测抗体，或者使用能够与针对初级复合物中存在的proBNP(1-108)的抗体结合的经标记的检测抗原，显示形成的抗原-抗体复合物。
具体而言，本发明提供一种诊断心力衰竭的方法，除了上述步骤a、b、c之外，还包括步骤d)将显示的抗原-抗体复合物的量与个体的临床状况相关联。
本发明的一个主题也是一种试剂盒，其用于检测生物标本，特别是血液、血浆或血清标本中的proBNP(1-108)，该试剂盒含有至少一种抗-proBNP(1-108)抗体，该抗体特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)。
最后，本发明涉及一种试剂盒，其用于检测生物标本，特别是血液、血浆或血清标本中的proBNP(1-108)，该试剂盒含有一种化合物作为标准和/或对照，该化合物含有至少一种肽，该肽选自下列通式的肽a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)其中，a1、X1、X2和a2的含义与上述相同，X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II)其中X和Z的含义与上述相同，X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II)其为保守或非保守置换的形式，只要使RAPR76S77P部分保持完整(特别是未置换)，其中X和Z的含义与上述相同，X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)其中X和Z的含义与上述相同，X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)其为保守或非保守置换的形式，只要使RAPR76S77P部分保持完整(特别是未置换)，其中X和Z的含义与上述相同，Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85，Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84。
定义在本发明上下文中，“生物标本”或者“生物液体标本”优选地包括生物液体，如血液、血浆、血清、尿、脑脊液、唾液等。
术语“心力衰竭”是指病理状态，其中心脏功能异常致使心脏不能充分地泵送血液，以满足生物的代谢需要，和/或心脏满足这种需要，但是充盈压特别高。具体而言，这可能是右心室和/或左心室衰竭。
术语“抗体”是指任何完整的抗体或一种抗体的功能片段(可能通过或者可能不通过遗传工程获得)，其含有或者由至少一个抗原结合位点组成，使得该抗体能够与抗原化合物的至少一个抗原决定簇结合。作为抗体片段的例子，可能提到Fab、Fab′和F(ab′)2片段以及单链可变片段(scFv链)。
根据本发明的抗-proBNP(1-108)抗体可以是多克隆或单克隆类型。根据本发明的一种多克隆抗-proBNP(1-108)抗体尤其可以如下获得用完整的proBNP(1-108)免疫一种动物，如兔、小鼠等，分离获得的抗血清，然后利用本领域技术人员公知的方法，例如用含有BNP(77-108)和/或BNP(1-76)的免疫吸附剂对其进行消耗。根据本发明的一种单克隆抗-proBNP(1-108)抗体尤其可以用Khler和Milstein(Nature(London)，256495-497(1975))的常规方法获得。
在本发明中有用的单克隆抗体或单特异性多克隆血清，或者通过筛查基因组文库获得的抗体，利用下文详细描述的常规技术产生。
术语“捕获抗体”是指一种抗体或一种抗体的一部分，其优选地附着于固相上，通过亲和结合能够保留生物标本中的proBNP(1-108)抗原。
生物标本中抗原的存在通过“检测工具(单元)”显示。关于抗原的检测，本发明具体涉及使用至少一种“检测抗体”的检测。通过识别与捕获抗体所识别的位点不同的表位位点，标记的这种检测抗体能够通过亲和结合与捕获的抗原结合。
术语“经标记的”是指直接标记(利用酶、放射性同位素、荧光染料、发光化合物等)和间接标记(例如利用直接标记的抗体或者使用标记的“亲和对”的试剂，例如，但是不排除标记的抗生物素蛋白-生物素对，等等)。
术语“抗原片段”是指proBNP(1-108)的任一部分，其能够在免疫的动物中诱导合成仅对proBNP(1-108)特异的抗体。
根据本发明，一个“抗原片段”至少含有“表位位点”或表位RAPR76S77P。“表位位点”或“表位”是一种氨基酸序列，它能够被至少一种抗体识别，并且允许其特异结合。
术语“单特异性多克隆抗体”是指具有单表位特异性的任何多克隆抗体。是指一种抗体，它能够结合序列proBNP(1-108)的含有含表位的氨基酸的氨基酸序列，但是不能结合序列proBNP(1-108)的不合含表位的氨基酸的氨基酸序列。
当指抗体对抗原的识别或特异性结合时，术语“特异地”是指该抗体与该抗原相互作用，而基本上不与其它抗原相互作用，或者如果指与一种表位的“特异性”识别，实际上只识别该表位。缔合常数大于108L·mol-1是优选的。
术语“保守置换”具体地是指一类氨基酸被同一类氨基酸置换，相对于来源肽，这种置换不会显著改变获得的肽的免疫反应性。在多个氨基酸类别中，含有一个极性侧链的氨基酸(如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)，含有一个非极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸)，含有一个碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，和含有一个酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)通常可以区别。
术语“非保守置换”是指其它任何类型的置换，相对于来源肽，它不会显著改变获得的肽的免疫反应性。
表述“基本上不识别BNP(1-76)或BNP(77-108)”是指本发明所述的抗体显示与BNP(1-76)或BNP(77-108)有不到20％，特别是不到10％，优选地不到5％的交叉反应。百分交叉反应按照本领域技术人员公知的方法测定，如实施例5所述。
“基本上”不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)肽优选地对应于本发明的抗体与这些肽的反应的缺乏，或者实际上的缺乏。
表述“基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)”是指抗体“基本上不识别BNP(1-76)或BNP(77-108)”，含义如上。
特异性抗体的产生本发明使用的抗体是抗原特异性抗体，因此，是单克隆抗体或单特异性多克隆抗体，即它们只特异地识别一种表位。
单克隆抗体能够利用Khler和Milstein，Nature，1975，256495-497所述的常规淋巴细胞融合和杂交瘤培养方法获得。制备单克隆抗体的其它方法也已知(Harlow等人编著，1988《抗体实验室手册》)。单克隆抗体能够如下制备免疫一种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔或人等)，利用淋巴细胞融合技术产生杂交瘤(Khler和Milstein，1975)。
这种常用技术具有备选技术。例如，通过表达从一种杂交瘤中克隆的核酸，能够产生单克隆抗体。通过噬菌体展示技术，通过将抗体cDNA导入载体中，也能够产生抗体，这种载体一般是丝状噬菌体，它在噬菌体表面呈现V基因文库(例如，对于大肠杆菌为fUSE5，J.K.Scott和G.P.Smith，Science，1990，249386-390)。Marks等人，1991，J.Mol.Biol，222581-597描述了构建这些抗体文库的方案。
按照常用的程序，用一种性质为肽的抗原免疫动物，能够从该动物的血清中获得多克隆抗体。如果需要，可以利用本领域技术人员公知的技术，例如柱免疫吸附，通过用BNP(77-108)和BNP(1-76)消耗，使这样获得的多克隆抗体对序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、对序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或对含有序列RAPR76S77P的肽具有单特异性，从而确保对于proBNP(1-108)的特异性，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)。
捕获和/或检测抗体在夹心技术中，选择捕获抗体，使其特异地识别患者自然抗原上的一种表位，而且选择检测抗体，优选地但不是必要地，使其特异地识别患者自然抗原上的另外一种表位。
生物标本能够任选地在前一个步骤中处理，或者在促使待检测表位暴露的条件下，直接将其与至少一种捕获抗体置于一起。
根据本发明的诊断方法能够按照本领域技术人员公知的多种形式进行在固相或均相中；一步或者两步；以夹心法或者竞争法，作为非限制性实例。
根据一个优选实施方案，捕获抗体固定于一个固相上。作为固相的非限制性实例，可以使用微孔板，特别是聚苯乙烯微孔板，如丹麦Nunc公司所售。也可以使用固体颗粒或珠、磁珠，如Dynal或Merck-Eurolab(法国)提供的(商标为EstaporTM)，或者聚苯乙烯或丙烯试管，等等。
一种免疫测定形式，如两种抗体(捕获和检测抗体)的夹心法，特别有利于检测生物标本中存在的抗原。
通过竞争检测抗原的一种免疫测定形式也是可用的。另外一些免疫测定模式也能够涉及，且本领域技术人员公知。
ELISA测定、放射免疫测定或其它任何检测技术都能够用来显示形成的抗原-抗体复合物的存在。
试剂盒用来根据本发明的方法检测生物液体标本中的proBNP(1-108)的试剂盒和试剂，能够用来实施本发明，它容易进行且适用于多种生物标本。
用于检测生物标本中的proBNP(1-108)的试剂盒能够含有至少一种如上所述定义的抗体。含有至少一种通式(I)或(II)的肽或如上所述定义的一种置换肽作为标准和/或对照的另外一些试剂盒也可以用来实施本发明。
因此，本发明的另外一个具体主题是一种检测生物液体标本中的proBNP(1-108)的试剂盒，其含有-至少一种抗-proBNP(1-108)抗体，其特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)，优选地是一种用于捕获该生物标本中存在的proBNP(1-108)的抗体，和-一种经标记的偶联物，它能够与形成的抗原-抗体复合物特异结合。
如上所述，捕获抗体有利地可以是固定在一个固相(例如，但不只是，微孔板)上的形式。
一种优选的试剂盒至少含有-一种抗-proBNP(1-108)捕获抗体，其特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)，该捕获抗体固定于一个固相上；和-一种经标记的检测抗体，它针对proBNP(1-108)的另外一种完整的表位，或者任选地，-一种经标记的检测抗原，它是proBNP(1-108)的一种肽或者是proBNP(1-108)本身。
根据一个具体实施方案，用于检测生物标本中的proBNP(1-108)的一种试剂盒可以-在一个容器中含有至少一种如上所述定义的抗体；-在另外一个容器中含有至少一种如上所述定义的肽，该肽具体可以用作标准和/或对照。
下列附图和实施例说明本发明，而非限制其范围。
图例
图1显示用蛋白A-sepharose纯化的来自兔#046 805的多克隆抗体与吸附于微孔板上的0.25μg/ml proBNP(1-108)、BNP(1-76)片段、BNP(77-108)或GST(谷胱甘肽-S-转移酶，用作对照蛋白质)的反应性。
图2显示在BNP-K3-NHS-sepharose树脂上消耗后获得的，兔#046805的滤过物的多克隆抗体的反应性。这些多克隆抗体以2-20μg/ml的稀释范围制备，然后在包被吸附的0.25μg/ml proBNP(1-108)、BNP(1-76)或BNP(77-108)多肽的孔(cupule)上检测。
图3显示在BNP-K3-NHS-sepharose树脂上消耗后获得的，兔#046832的滤过物的多克隆抗体的反应性。这些多克隆抗体以5-20μg/ml的稀释范围制备，然后在包被了吸附的0.25μg/ml proBNP(1-108)、BNP(1-76)或BNP(77-108)多肽的孔上检测。
图4显示在BNP-K3-NHS-sepharose树脂上消耗后获得的，兔#046805的多克隆血清的洗脱物的反应性。这些该多克隆抗体以2-20μg/ml的稀释范围制备，然后在包被吸附的0.25μg/ml proBNP(1-108)、BNP(1-76)或BNP(77-108)多肽的孔上检测。
图5显示在BNP-K3-NHS-sepharose树脂上消耗后获得的，兔#046832的多克隆血清的洗脱物的反应性。这些多克隆抗体以5-20μg/ml的稀释范围制备，然后在包被吸附的0.25μg/ml proBNP(1-108)、BNP(1-76)或BNP(77-108)多肽的孔上检测。
图6显示利用斑点技术，对来自兔#046 805的消耗之前的多克隆血清的表位分析(对于该实施例，背景噪音为30.4±5.93相对强度单位)。
图7显示利用斑点技术，对来自兔#046 805的在BNP-K3-NHS-sepharose树脂上消耗之后的多克隆血清的表位分析(对于该实施例，背景噪音为31.3±6.31相对强度单位)。
图8显示稀释为1/2的杂交瘤3D4的培养上清液的反应性，在包被吸附的1μg/ml proBNP(1-108)或BNP(1-76)或BNP(77-108)或肽YTLRAPRSPKMVQGSG(C13P30)的孔上检测。
图9显示16％丙烯酰胺凝胶的一张照片，其中每种蛋白质都迁移(每道1μg蛋白质)。1道分子量标准；2道proBNP(1-108)-GST；3道GST(阴性对照蛋白质)；4道BNP(1-76)-GST；5道BNP(77-108)。
图10显示使用3D4杂交瘤产生的抗体对下列样品进行的Western印迹测定的结果proBNP(1-108)-GST(2道)、GST(阴性对照蛋白质)(3道)、BNP(1-76)-GST(4道)、BNP(77-108)(5道)，它们加样到凝胶上(每块凝胶1μg蛋白质)，然后转移到硝酸纤维素膜上。
图11显示用于proBNP(1-108)IRMA测定的一条标准曲线。
图12显示对标本中的proBNP(1-108)进行的IRMA测定的结果，单位为cpm(每分钟的放射性计数)，标本来自14名正常个体和15名心力衰竭患者。
图13给出了利用根据本发明的免疫放射测定法测定的proBNP(1-108)浓度(pg/ml)与利用Elecsys自动装置(Hoffmann LaRoche公司的商标)测定的BNP(1-76)浓度(pg/ml)之间的相关性，标本来自14名心力衰竭患者。
图14显示根据本发明的proBNP(1-108)ELISA测定的一条标准曲线。
图15显示兔#046 805的多克隆抗体对于BNP(1-76)和BNP(77-108)的交叉反应的评价，该抗体未经消耗，与生物素偶联，在proBNP(1-108)ELISA测定中与抗BNP(77-108)多克隆抗体一起夹心使用。
图16显示来自兔#046 805的多克隆抗体对于BNP(1-76)和BNP(77-108)的交叉反应的评价，该抗体未经消耗，与生物素偶联，在proBNP(1-108)ELISA测定中与抗-NT-proBNP(1-29)多克隆抗体一起夹心使用。
实施例实施例1用于免疫的肽的合成合成的肽通过本领域技术人员公知的标准技术生产。例如，可以提到Merrifield类型的合成，该方法易于进行，因此是有利的(Merrifield，(1963)；R.C.Sheppard(1971)；Atherton等人.(1989))。自动化合成仪可以使用Millipore″9050 Plus Pep Synthesizer″、″Pioneer″合成仪或ABI″433A″合成仪。这些肽也能够通过均相合成法获得。
下文中的合成使用“Fmoc”(9-芴基甲氧基羰基)化学在Pioneer合成仪上进行每一步都过量加入试剂(即被保护的氨基酸和偶联激活剂(TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-脲 四氟硼酸)/HOBt(N-羟基苯并三唑))(“树脂上试剂摩尔数可取代基摩尔数”之比＝5)。在合成结束时，利用基于三氟乙酸的溶液(试剂K)从树脂上分离肽。然后在冷却的醚溶液中沉淀该肽，然后通过HPLC纯化。
本发明人合成了下列含有铰链区氨基酸序列R76S77的肽SEQ ID No.6 C-G-R-A-P-R-S-PSEQ ID No.7 乙酰基-C-G-R-A-P-R-S-PSEQ ID No.8 C-G-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No.9 乙酰基-C-G-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No.10C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-VSEQ ID No.11C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GSEQ ID No.12R-A-P-R-S-P-G-CSEQ ID No.13乙酰基-R-A-P-R-S-P-G-CSEQ ID No.14乙酰基-C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No.15C-H-R-K-M-V-L-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No.16C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G
(肽C13P30)SEQ ID No.17C-F-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GSEQ ID No.18C-F-S-I-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GSEQ ID No.19C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-βASEQ ID No.20C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-A-T-βASEQ ID No.21C-F-S-I-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-A-T-βASEQ ID No.22C-F-S-I-R-A-P-R-S-P-A-L-A-S-G-T-A以及SEQ ID No.109C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S(肽CN32)SEQ ID No.110C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No.111C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-VSEQ ID No.112C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-QSEQ ID No.113C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-GSEQ ID No.114乙酰基-C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-QSEQ ID No.115C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-GSEQ ID No.116C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-SSEQ ID No.117C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GSEQ ID No.118C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-VSEQ ID No.119C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-QSEQ ID No.120L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-CSEQ ID No.121C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-SSEQ ID No.122C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GNBβA表示β-丙氨酸。
因此本发明的主题也包括选自上述序列的任何一种肽。
实施例2用于免疫的肽与载体蛋白的偶联肽与一种载体蛋白KLH(匙孔 血蓝蛋白)、甲状腺球蛋白、BSA(牛血清白蛋白)通过不同的官能团(硫醇、胺、醛等)偶联，以使该肽更具免疫原性。用于键合肽与蛋白质的偶联剂可以是异双功能剂或同双功能剂。最常用的试剂是BS3、sSMCC、SPDP、戊二醛等。采用的偶联技术之一是利用戊二醛作为化学偶联剂，利用KLH作为载体蛋白。KLH与肽的偶联利用肽的胺官能团(主要由赖氨酸携带的N端基团和胺基团)进行。
序列YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2(SEQ ID No.16)的肽C13P30或序列YTLRAPRSPKMVQGS-NH2(SEQ ID No.109)的肽CN32的5mg/ml溶液用含有0.15M NaCl的pH7.4的Dulbecco PBS缓冲液制备。对于注射制剂，一瓶在PBS缓冲液(Pierce #77600)中冻干的20mg KLH吸收2ml水，获得溶于PBS缓冲液的10mg/ml KLH溶液。
1ml肽溶液(即5mg)与1.25ml KLH溶液(即12.5mg)混合。在抽风罩下，向混合物中加入(由25％戊二醛，Sigma #G-5882)即时制备的2.25ml 2％戊二醛溶液。为了避免形成KLH复合物，逐滴加入2％戊二醛溶液，同时搅拌混合液。偶联反应在室温下进行2小时30分钟。加入100mg/ml硼氢化钠溶液达到10mg/ml的终浓度，终止偶联反应。混合物在4℃下温育过夜。最后，该溶液在4℃下对pH7.4的DulbeccoPBS缓冲液透析过夜。最后等分该溶液，贮存于-80℃。
实施例3用肽免疫为了生产多克隆抗体，兔(雌性，新西兰株)用根据实施例2与KLH偶联的肽Cys-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2免疫。对于第一次注射，制备1.5ml KLH偶联的肽与1.5ml弗氏完全佐剂(Sigma #F-5881)的乳液，对每只兔皮内注射1ml这种乳液(即200μg肽)。通过皮内注射1mlKLH偶联的肽(即200μg肽)与弗氏不完全佐剂(Sigma #F-5506)的乳液，给予两次加强，间隔20天。在第二次加强20天后，以与前几次加强基本相同的方法给予第三次加强，不同之处是采用皮下注射。后一次加强20天后，并且在评价获得的抗体滴度后，对兔采血。更具体而言，剩余的研究使用以下多克隆抗体它们来自用编号#046 805和046 832区别的兔，通过用与KLH偶联的肽C-YTLRAPRSPKMVQGS-NH2(SEQ ID No.16)免疫获得，以及来自用#L01235区别的兔，通过用与KLH偶联的肽C-YTLRAPRSPKMVQGS-NH2(SEQ ID No.109)免疫获得。
实施例4获得及纯化抗体纯化后，兔血清在4℃下以4500转/分离心30分钟。通过沉淀分离后，血清用含有1M NaCl的1.5M甘氨酸缓冲液pH8.0对半稀释。
实施例4.a使用蛋白A-sepharose的IgG纯化多克隆抗体的纯化在蛋白A-sepharose凝胶(Amersham Biosciences#17.1279.02)上通过亲和层析进行。从金黄色葡萄球菌中提取的蛋白A与IgG分子的Fc片段特异结合。然后，在pH3.0下洗脱包括所有亚类的IgG。
为了防止气泡形成，使用的所有缓冲液在上柱之前均在超声波浴中脱气15分钟。
层析柱用12ml蛋白A-sepharose制备。该凝胶柱用蒸馏水和脱气的水平衡40分钟，然后用含有0.5M NaCl的pH7.4的Dulbecco PBS缓冲液平衡40分钟，最后用含有1M NaCl的pH8.0的1.5M甘氨酸缓冲液平衡，直到获得正确的基线。
然后，用含有1M NaCl的pH8.0的1.5M甘氨酸缓冲液对半稀释的10ml兔血清以0.5ml/min的流速通过该柱。在出现白蛋白峰后，利用以0.1M tris-柠檬酸钠缓冲液调节至pH3.0的0.1M柠檬酸溶液洗脱血清IgG。回收IgG洗脱峰，在4℃下在pH7.4的Dulbecco PBS缓冲液中快速透析过夜。对PBS缓冲液透析后通过读取280nm的光密度测定IgG的浓度。
利用蛋白A纯化后，在包被吸附的0.25μg/ml proBNP(1-108)或BNP(1-76)或BNP(77-108)的孔上通过ELISA检测多克隆抗体的反应性。图1列出了来自兔#046 805的多克隆抗体获得的结果。来自兔#046832的多克隆抗体获得相同的结果。来自兔#046 805和#046 832的多克隆抗体对于proBNP(1-108)是相对特异的。然而，我们能够注意到高浓度下弱抗-BNP(77-108)反应性的存在，我们按照实施例4.b所述的方法，通过在BNP-K3-NHS-sepharose树脂上消耗，使来自这些兔的多克隆抗体具有单特异性，能够消除这种反应性。
实施例4.bIgG在BNP-K3-NHS-sepharose树脂上的消耗该操作的目的在于消除观察到的对于BNP(77-108)的交叉反应性。
由于获得的多克隆抗体的交叉反应性位于BNP(77-108)分子的N端位置，因此将BNP(77-108)的该区正确地呈递给将要消除的免疫球蛋白至关重要。为此，利用C末端位置(BNP-K3)中3个赖氨酸残基的延伸合成BNP(77-108)，以促进它通过C末端与NHS-sepharose树脂的偶联。
如以上实施例1所述，利用“Fmoc”(9-芴基甲氧基羰基)化学，在Pioneer合成仪上合成BNP-K3S-P-K-M-V-Q-G-S-G-C-F-G-R-K-M-D-R-I-S-S-S-S-G-L-G-C-K-V-L-R-R-H-K-K-K(SEQ ID No.104)。
5mg BNP-K3用100mM pH8.3的NaHCO3缓冲液溶解，以10mg/ml的浓度加入0.5M NaCl。2ml NHS-sepharose树脂(NHS-活化的Sepharose 4 Fast Flow，Amersham Biosciences #17.0906.01)在4℃下以1000转/分离心30秒钟。树脂用15ml 1mM冷HCl溶液洗涤。离心并除去HCl溶液后，树脂与10mg/ml的BNP-K3配体混合。混合物在室温和缓慢搅拌下温育1小时。离心并除去配体溶液后，树脂的非反应性基团用5ml pH8.0的0.1M甘氨酸缓冲液封闭。该混合物在室温和缓慢搅拌下温育1小时。离心并除去封闭缓冲液后，树脂吸收5ml 100mMNaHCO3缓冲液pH8.3，加入0.5M NaCl。用该缓冲液洗涤4次。最后一次洗涤后，将该混合物上样层析柱上。
在制备层析柱后，将10mg来自兔#046 805或来自兔#046 832的IgG上样到柱上。与该柱相连的蠕动泵使得兔血清IgG能够在4℃下循环过夜。次日，回收IgG溶液(＝滤过物)。用含有5M尿素的20mM Tris缓冲液pH8.0洗脱与BNP-K3结合的IgG级分(＝洗脱物)。然后检测洗脱物与滤过物，以证实消耗的效果。图2和图3分别显示用来自兔#046805和#046 832的多克隆血清的滤过物进行的ELISA检测的结果。图4和图5分别显示用来自兔#046 805和#046 832的多克隆血清的洗脱物进行的ELISA检测的结果。
如预期的一样，来自兔#046 805和#046 832的多克隆血清的滤过物对于proBNP(1-108)是特异的对BNP(1-76)和BNP(77-108)均未见反应性。洗脱物保留相当大的对proBNP(1-108)的反应性，以及对BNP(77-108)的反应性。这些结果证实了在BNP-K3-NHS-sepharose树脂上消耗兔多克隆血清的效果。
BNP(77-108)来自Sigma(#B-5900)，而proBNP(1-108)和BNP(1-76)按照本领域技术人员公知的常规技术，在克隆到载体pGEX-2T(Amersham Pharmacia Biotech)内，并转染大肠杆菌后，以表达的重组蛋白的形式产生。原始载体由Berlex Biosciences公司(Richmond，CA，USA)提供，它的制备如Yan等人(PNAS，2000，vol.97，pp.8525-8529)所述。proBNP(1-108)和BNP(1-76)的浓度通过Bradford法测定，用于蛋白质比色测定(M.Bradford Anal.Biochem.1976；72248-54)。
实施例5来自兔#046 805和#L01235的抗-proBNP(1-108)抗体对于BNP(1-76)和BNP(77-108)的百分交叉反应性的测定材料1)固相平底Maxisorp微孔板，Nunc(丹麦)。
2)BNP(77-108)来自Sigma(# B-5900)，而proBNP(1-108)和BNP(1-76)以重组蛋白的形式产生。这些蛋白质溶液的浓度通过Bradford法测定，用于蛋白质比色测定(M.Bradford Anal.Biochem.1976；72248-54)。
3)使用的偶联物是一种过氧化物酶偶联的抗兔IgG多克隆抗体(Sigma #A-9169)。
4)饱和缓冲液Dulbecco PBS缓冲液，pH7.4，含有1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma #A-7888)。
5)稀释缓冲液Dulbecco PBS缓冲液，pH7.4，含有0.1％ BSA和0.1％ Tween 20。
6)洗涤溶液Dulbecco PBS缓冲液，pH7.4，含有0.1％ Tween 20。
7)显色溶液显色溶液由下列成分组成7a)底物缓冲液0.01M柠檬酸和0.04M柠檬酸三钠的溶液，含有0.33％H2O2，终pH为5.6，和7b)发色团OPD(邻苯二胺)片。1片OPD溶解于10ml底物缓冲液中。
8)终止溶液4N H2SO4。
方案该测定在于评价多克隆抗体直接对固定于微孔板的孔中的不同蛋白质的免疫反应性。
√ 首先用Dulbecco PBS缓冲液pH7.4制备几种包被溶液第一种含有0.25μg/ml BNP(77-108)，第二种含有0.25μg/ml proBNP(1-108)，第三种含有0.25μg/ml BNP(1-76)，第四种含有0.25μg/ml GST(背景噪音控制蛋白)。
√ 分别向微孔板的孔中加入各100μl这些溶液。
√ 微孔板在4℃下温育过夜。
√ 除去包被溶液后，微孔板用含有0.1％Tween 20的300μlDulbecco PBS缓冲液pH7.4洗涤，然后加入含有1％BSA的250μlDulbecco PBS缓冲液pH7.4饱和。
√ 微孔板然后在37℃下温育1小时。
√ 然后用洗涤溶液洗涤微孔板(3次)。
√ 向每孔中加入100μl多克隆抗体溶液，对于来自兔#046 805的多克隆血清，预先稀释为2和1μg/ml，对于来自兔#L01235的多克隆血清，1/2500和1/5000稀释。
√ 反应介质在室温下温育2小时。
√ 微孔板然后用300μl洗涤溶液洗涤3次。
√ 向微孔板的每个孔中加入100μl在稀释缓冲液中1/8000稀释的过氧化物酶偶联的抗兔IgG多克隆抗体偶联物。
√ 反应介质在室温下温育1小时。
√ 微孔板然后用300μl洗涤溶液洗涤(5次)。向每孔中加入100μl显色溶液。反应体系在室温下(18-24℃)在暗处显色20分钟。
√ 然后向每孔中加入50μl终止溶液。
√ 反应终止后，利用分光光度计读取490/620nm的光密度。
表I兔#046 805和#L01235的多克隆抗体对于BNP(1-76)和BNP(77-108)的百分交叉反应的测定结果对于一种指定的抗-proBNP(1-108)抗体，它对吸附的0.25μg/mlBNP(77-108)、对吸附的0.25μg/ml proBNP(1-108)以及对吸附的0.25μg/ml GST检测，该抗体与BNP(77-108)的百分交叉反应用下列公式计算%=OD(BNP77-108)-OD(GST)OD(proBNP1-108)-OD(GST)×100]]>对于一种指定的抗-proBNP(1-108)抗体，它对吸附的0.25μg/mlBNP(1-76)、对吸附的0.25μg/ml proBNP(1-108)以及对吸附的0.25μg/ml GST检测，该抗体与BNP(1-76)的百分交叉反应用下列公式计算%=OD(BNP1-76)-OD(GST)OD(proBNP1-108)-OD(GST)×100]]>
在膜上合成的肽系列包括32种十五肽，这些肽含有一个3氨基酸残基的移位，代表proBNP(1-108)的完整序列。
表II包含32种十五肽的斑点膜，这些肽含有一个3氨基酸残基的移位，代表proBNP(1-108)的完整序列。
在膜用添加0.1％ Tween 20、5％封闭缓冲液(Euromedex #SU-07-250)和5％蔗糖的30ml TBS(Tris缓冲盐溶液)缓冲液pH7.0饱和后，检测稀释为10μg/ml的20ml兔多克隆血清的反应性(在37℃和搅拌下温育1小时30分钟)。用添加0.1％Tween 20的TBS缓冲液pH7.0洗涤后，20ml碱性磷酸酶偶联的抗兔IgG偶联物(Sigma #A-8025)在室温和搅拌下温育1小时。最后，用30ml洗涤缓冲液进行最后一系列洗涤之后，加入30ml底物溶液(30ml CBS(柠檬酸)缓冲液，pH7.0，含有120μl 0.15M BCIP(5-溴-4-氟-3-吲哚基磷酸)，150μl 1M MgCl2和180μl0.1M MTT(溴化噻唑基蓝四唑))，使斑点显色。扫描该膜，之后利用图像加工软件评价膜上斑点的强度(相对强度单位)。背景噪音根据抗血清检测不到的斑点计算。对于消耗之前的来自兔#046 805的多克隆血清，其表位分析结果在图6中给出。多克隆血清检测到5种肽(斑点22-26)，这5种肽共同的序列是R76S77P。然而，当在R76S77P单位的N端位点处添加RAP单位时，反应性显然提高。对于在BNP-K3-NHS-sepharose树脂上消耗之后的，来自兔#046 805的多克隆血清，其表位分析结果在图7中给出。多克隆血清检测到4种肽(斑点22-25)，这4种肽的共同序列是RAPR76S77P。与消耗之前的多克隆血清所见不同，未见对单独的R76S77P单位的反应性(斑点26)。这解释了在BNP-K3-NHS-sepharose树脂上消耗后，多克隆血清不再检测BNP(77-108)[提示S77P单位对应于BNP(77-108)序列的前两个氨基酸]。结论是，可被来自兔#046 805的单特异性多克隆血清识别的表位是RAPR76S77P。
使用来自兔#046 832的多克隆血清获得完全相同的结果可被来自该兔的单特异性多克隆血清识别的表位也是RAPR76S77P。
实施例7通过Ala-扫描法，消耗之前及之后，来自兔#046 805和#046 832的多克隆血清的最小表位的鉴定在BNP-K3-NHS-sepharose树脂上消耗之前和之后，来自兔#046805和#046 832的多克隆血清用斑点法检测(如实施例6所述)，以鉴定铰链区中的最小表位，该表位使得多克隆血清只能特异地识别proBNP(1-108)。合成一张膜，其含有16种十五肽，它们重复铰链肽的序列YTLRAPRSPKMVQGS，并且含有一个氨基酸被丙氨酸残基(丙氨酸-扫描或“Ala-扫描”)或甘氨酸残基的邻居-邻居置换，该置换每次向右移位一个氨基酸残基(表III)。在BNP-K3-NHS-sepharose树脂上消耗之前和之后，来自兔#046 805和#046 832的多克隆血清的Ala-扫描分析结果在表III中列出。
表III含有16种十五肽YTLRAPRSPKMVQGS的斑点膜，这些肽含有每种氨基酸被丙氨酸或甘氨酸残基的邻居-邻居置换。在BNP-K3-NHS-sepharose树脂上消耗之前和之后，来自兔#046 805和#046 832的多克隆血清的反应性
NB置换初始氨基酸的丙氨酸或甘氨酸残基用下划线标出(A和G)。
在消耗之前的来自兔#046 805的多克隆血清对表位的识别中必需的氨基酸是R76S77P，而来自兔#046 805的多克隆血清在BNP-K3-NHS-sepharose树脂上消耗之后，除了R76S77P单位之外，RA单位也有贡献。对于消耗前的来自兔#046 832的多克隆血清，只有脯氨酸P78有贡献，而来自兔#046 832的多克隆血清在BNP-K3-NHS-sepharose树脂上消耗之后，有贡献的单位是R-PR76S77P。因此这些结果表明，在来自兔#046 805和#046 832的多克隆抗体对proBNP(1-108)的特异识别中，必需的最小表位是RAPR76S77P。
实施例8通过Ala-扫描法，来自兔#L01235的多克隆血清的最小表位的鉴定从开始(不需要消耗)即对proBNP(1-108)特异的来自兔#L01235的多克隆血清用斑点法检测(如实施例6所述)，以鉴定铰链肽中的最小表位，该表位使多克隆血清只特异地识别proBNP(1-108)。使用的膜如实施例7所述。来自兔#L01235的多克隆血清的Ala-扫描分析结果在表IV中给出。
表IV含有16种十五肽YTLRPRSPKMVQGS的斑点膜，这些肽含有每种氨基酸被丙氨酸或甘氨酸残基的邻居-邻居置换。来自兔#L01235的多克隆血清的反应性。
NB置换初始氨基酸的丙氨酸或甘氨酸残基用下划线标出(A和G)。
对于来自兔#046 805和#046 832的多克隆血清(实施例7)，这些结果表明，在来自兔#L01235的多克隆抗体对proBNP(1-108)的特异识别中，必需的最小表位是RAPR76S77P。
实施例9用proBNP(1-108)重组蛋白对小鼠的免疫利用本领域技术人员公知的常规技术，用实施例4.b所述的重组proBNP(1-108)免疫BALB/c小鼠(6周龄，雌性)。在第一次注射时，制备1ml proBNP(1-108)与1ml弗氏完全佐剂(Sigma #F-5881)的乳液，对每只小鼠皮下注射300μl这种乳液(即100μg蛋白质)。间隔15天，通过腹膜内注射300μl proBNP(1-108)(即100μg蛋白质)与弗氏不完全佐剂(Sigma #F-5506)的乳液，给予两次加强。第二次加强15天后，与以前相同地给予第三次加强，但是采用皮下注射。最后，在最后一次加强15天后，采集小鼠的血样，通过斑点技术分析免疫应答。小鼠12的免疫应答证明特别有利于进行剩余的研究。
实施例10proBNP(1-108)序列上可被来自小鼠12的多克隆抗体识别的表位的鉴定用来鉴定proBNP(1-108)序列上可被来自小鼠12的多克隆抗体识别的表位的斑点法在实施例6中描述。
在膜上合成的肽系列包括94种十五肽，每一种均改变一个氨基酸残基，代表proBNP(1-108)的完整序列。如实施例6所述，在该膜上检测1/500稀释的来自小鼠12的多克隆血清的反应性。在扫描该膜后，利用图像加工软件评价膜上斑点的强度(相对强度单位)。背景噪音根据抗血清不能检测到的斑点计算，为30个相对强度单位。
位于proBNP(1-108)序列N端位置的三个区因此可被来自小鼠12的抗血清的抗体特别好地检测序列H1PLGSPGSASDLETS15(SEQ IDNo.23)(斑点1-12)，序列L17QEQRNHLQGK27(SEQ ID No.123)(斑点17-27)和序列L38EPLQESPRPTG49(SEQ ID No.124)(斑点38-49)。
令人吃惊的是，来自小鼠12的抗血清也含有能够识别其中肽序列
实施例11特异识别proBNP(1-108)，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)的单克隆抗体的产生为了生产单克隆抗体而选择的小鼠(5周龄BALB/c，雌性)按照下列方案用与KLH(匙孔 血蓝蛋白)偶联的肽SEQ ID No.16C-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2(C13P30)免疫皮下注射用弗氏完全佐剂体积-体积稀释的100μg KLH偶联的肽。以三周的间隔，通过皮下注射用弗氏不完全佐剂体积-体积稀释的100μg KLH-偶联的肽，给予四次加强。
在进行淋巴细胞融合三天前，按照下列方案对小鼠进行超免疫免疫原的总剂量，在此情况下，为100μg与KLH偶联的肽C-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2，在无菌PBS缓冲液中，分成四次注射。第一次和第二次注射均相当于总剂量的1/10。以45分钟的间隔，在不同部位皮下注射。第三次注射相当于总剂量的2/10，在第二次注射45分钟后皮下进行。在第三次注射30分钟后，腹膜内注射100μl 1mg/ml异丙嗪在无菌PBS中的溶液(2.5％非那根，Laboratoires MedevaParma)，以预防任何过敏性休克。最后，在15分钟后，腹膜内给予最后一次注射，相当于总剂量的6/10。
淋巴细胞杂交按照Khler和Milstein(Nature，1975；256495-97)所述的方法进行。其中使用从小鼠脾脏中提取的淋巴细胞，和预先置于RPMI 1640培养基(Bio-Whittaker #BE12-167F)中培养的骨髓瘤细胞(P3-X63-Ag8.653)，该培养基中补充了L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的混合物(Sigma # G-6784)，添加了预先去补体的10％胎牛血清(Bio-Whittaker #BE02701 E)和8-氮杂鸟嘌呤(Sigma #A-8526)。预先置于RPMI-1640培养基(Bio-Whittaker #BE12-167F)中的淋巴细胞和骨髓瘤细胞以每个骨髓瘤细胞5个淋巴细胞的比例混合，该培养基中添加L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的混合物(Sigma # G-6784)，而不添加胎牛血清。该混合物在室温下以900转/分离心7分钟后，加入细胞沉淀的重悬液，1ml Hybri-Max聚乙二醇(Sigma #P-7777)。在37℃水浴中温育1分钟后，细胞在室温下以1000转/分离心1分30秒。最后，在37℃水浴中温育2分钟后，重悬浮沉淀，以每5秒钟100μl的速度加入6ml预先置于37℃的添加了L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的混合物(Sigma #G-6784)的RPMI 1640培养基(Bio-Whittaker #BE12-167F)，同时加入9ml相同的培养基。在室温下以900转/分离心10分钟，并除去上清液后，沉淀吸收RPMI 1640培养基(Bio-Whittaker #BE12-167F)，其中添加L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的混合物(Sigma #G-6784)，添加15％预先去补体的胎牛血清(Bio-Whittaker #BE02701E)，以及HAT(次黄嘌呤，氨基喋呤，胸苷，Sigma #H-0262)，以便每孔分配100μl，120 000个细胞。在向预先加入鼠巨噬细胞的96孔培养板的孔中各分配100μl溶液。然后将培养板置于CO2孵箱中。在淋巴细胞杂交15天后，估计融合板中存在的克隆数，表示为杂交瘤发展的百分数。
通过ELISA，在proBNP(1-108)、BNP(1-76)、BNP(77-108)和含有序列RAPR76S77P的一种肽(C13P30)上进行杂交瘤的筛选。只选择分泌能够检测proBNP(1-108)和含有序列RAPR76S77P的C13P30肽而基本上不识别BNP(1-76)或BNP(77-108)的抗体的杂交瘤。选择的杂交瘤保持培养，通过有限稀释克隆。这样克隆的杂交瘤然后能够用来在腹水中生产单克隆抗体。
这样，本发明人生产了一种鼠杂交瘤，克隆3D4，它分泌一种同型IgG1κ免疫球蛋白，它具有根据本发明的抗体的特征。该杂交瘤在2003年7月31日保藏于CNCM(Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes[国立微生物保藏中心]，巴斯德研究所，25rue duDocteur Roux，75 724 Paris，Cedex 15，法国)，注册号为CNCM I-3073。
因此，本发明的主题也包括保藏于CNCM的保藏号为CNCMI-3073的杂交瘤3D4，以及它分泌的单克隆抗体。
实施例12通过ELISA证实杂交瘤3D4产生的抗体的特异性材料1)固相平底Maxisorp微孔板，Nunc(丹麦)。
2)BNP(77-108)来自Sigma(# B-5900)，而proBNP(1-108)和BNP(1-76)以重组蛋白的形式产生。这些蛋白质溶液的浓度通过Bradford法测定，用于蛋白质比色测定(M.Bradford Anal.Biochem.1976；72248-54)。
3)使用的偶联物是一种过氧化物酶偶联的驴抗小鼠IgG多克隆抗体(Jackson Immunoresearch #715-035-150)。
4)饱和缓冲液Dulbecco PBS缓冲液，pH7.4，含有1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma #A-7888)。
5)稀释缓冲液Dulbecco PBS缓冲液，pH7.4，含有0.1％BSA和0.1％Tween 20。
6)洗涤溶液Dulbecco PBS缓冲液，pH7.4，含有0.1％Tween 20。
7)显色溶液显色溶液由下列成分组成7a)底物缓冲液0.01M柠檬酸和0.04M柠檬酸三钠的溶液，含有0.33％H2O2，终pH为5.6，和7b)发色团OPD(邻苯二胺)片。1片OPD溶解于10ml底物缓冲液中。
8)终止溶液4N H2SO4。
方案该测定在于评价杂交瘤3D4的培养上清液直接对固定于微量滴定板的孔中的不同蛋白质的免疫反应性。
√ 首先用Dulbecco PBS缓冲液pH7.4制备几种包被溶液第一种含有1μg/ml BNP(77-108)，第二种含有1μg/ml proBNP(1-108)，第三种含有1μg/ml BNP(1-76)。
√ 分别向微孔板的孔中加入各100μl这些溶液。
√ 微孔板在4℃下温育过夜。
√ 除去包被溶液后，微孔板用含有0.1％Tween 20的DulbeccoPBS缓冲液pH7.4洗涤，然后加入含有1％BSA的250μl Dulbecco PBS缓冲液pH7.4饱和。
√ 微孔板然后在37℃下温育1小时。
√ 然后用300μl洗涤溶液洗涤微孔板(3次)。
√ 向每孔中加入100μl预先1/2稀释的杂交瘤3D4上清液。
√ 反应介质在室温下温育2小时。
√ 微孔板然后用300μl洗涤溶液洗涤3次。
√ 向微孔板的每个孔中加入100μl偶联物，用稀释缓冲液1/2000稀释的过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG多克隆抗体√ 反应介质在室温下温育1小时。
√ 微孔板然后用300μl洗涤溶液洗涤(5次)。向每孔中加入100μl显色溶液。反应体系在室温下(18-24℃)在暗处显色20分钟。
√ 然后向每孔中加入50μl终止溶液。
√ 反应终止后，用分光光度计读取490/620nm的光密度。
图8显示该测定的结果杂交瘤3D4上清液产生的抗体只能够检测proBNP(1-108)和C13P30免疫肽，未获得对BNP(1-76)或者对BNP(77-108)的反应性。这些结果证实了杂交瘤3D4产生的抗体对proBNP(1-108)的特异性，不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)。
因此，来源于杂交瘤3D4的根据本发明的抗体显然是一种特异地识别proBNP(1-108)的抗体，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)。
实施例13通过Western印迹证实杂交瘤3D4产生的抗体的特异性材料1)常规SDS-PAGE电泳装置2)积层胶5％丙烯酰胺3)分离胶16％丙烯酰胺4)阳极缓冲液0.2M Tris，pH8.95)阴极缓冲液0.1M Tris-tricine；0.1％SDS6)样品缓冲液0.5M Tris，pH6.8；25％甘油；2％SDS；14.4mMβ-巯基乙醇；0.1％溴酚蓝。
7)电泳转移装置。
8)转移缓冲液25mM Tris碱；190mM甘氨酸；20％甲醇；0.05％SDS。
9)BNP(77-108)来自Sigma(# B-5900)，而proBNP(1-108)-GST、BNP(1-76)-GST和GST(作为阴性对照)以重组蛋白的形式产生。这些蛋白质溶液的浓度通过Bradford法测定，用于蛋白质比色测定(M.Bradford Anal.Biochem.1976；72248-54)。
10)使用的偶联物是一种过氧化物酶-偶联的驴抗小鼠IgG多克隆抗体(Jackson Immunoresearch #715-035-150)。
11)ECL试剂盒用于通过Western-blotting检测(AmershamBiosciences #RPN2106)。
方案该测定的实施包括三个主要步骤不同蛋白质在16％丙烯酰胺凝胶中电泳迁移，然后这些蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，最后Western印迹。
√ 用样品缓冲液制备多种溶液，终体积为35μl第一种含有1μgproBNP(1-108)-GST，第二种含有1μg GST，第三种含有1μgBNP(1-76)-GST，第四种含有1μg BNP(77-108)。
√ 每种溶液都在100℃水浴中温育5分钟，然后加到凝胶的孔中。在120V恒定电压下通过丙烯酰胺凝胶迁移1小时30分。图9是获得的丙烯酰胺凝胶的一张照片。加样的蛋白质用考马斯蓝染色。
√ 迁移后，在120mA下将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上1小时。
√ 硝酸纤维素膜然后用PBS+0.1％Tween洗涤，在室温下在PBS缓冲液+0.1％Tween+2％脱脂奶中饱和30分钟。
√ 用PBS缓冲液+0.1％Tween洗涤3次后，在搅拌下，膜与5ml杂交瘤3D4上清液37℃温育1小时。
√ 用PBS缓冲液+0.1％Tween洗涤3次后，在搅拌下，膜与10ml用PBS缓冲液+0.1％Tween+2％脱脂奶1/2000稀释的过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG偶联物室温温育1小时。
√ 用PBS缓冲液+0.1％Tween洗涤3次后，膜浸泡于ECL显色试剂中，之后暴露于胶片4分钟。
图10是获得的照片的扫描图像，如该图所示，杂交瘤3D4上清液产生的抗体只能够检测对应于proBNP(1-108)的带。杂交瘤3D4的抗体不能检测BNP(1-76)、BNP(77-108)以及GST。这些结果也证实了杂交瘤3D4产生的抗体对proBNP(1-108)的特异性。
因此，来源于杂交瘤3D4的根据本发明的抗体显然是一种特异地识别proBNP(1-108)的抗体，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)。
实施例14通过斑点法，可被杂交瘤3D4产生的抗体识别的表位的鉴定为了鉴定可被杂交瘤3D4抗体识别的表位，通过斑点法(如实施例6所述)检测杂交瘤3D4的上清液。获得的结果表明，3D4抗体可有效识别含有RAPR76S77P单位的肽序列。
这些结果与ELISA(实施例12)和Western印迹(实施例13)获得的结果一致，证实了3D4抗体对于proBNP(1-108)的特异性。
实施例15proBNP(1-108)的免疫放射测定材料1)固相可拆孔的平底Maxisorp微孔板，Nunc(丹麦)。
2)使用的捕获抗体是从未消耗的兔#046 805血清中获得的多克隆抗体。
3)使用的偶联物是用I125标记的一种抗BNP(77-108)抗体(抗-BN-I125)。它是Shionogi公司所售的Shionoria BNP试剂盒的一种示踪抗体。
4)饱和缓冲液Dulbecco PBS缓冲液，pH7.4，含有1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma #A-7888)。
5)稀释缓冲液Dulbecco PBS缓冲液，pH7.4，含有0.1％BSA和0.1％Tween 20(Sigma，#P-1379)，6)洗涤缓冲液Dulbecco PBS缓冲液，pH7.4，含有0.1％Tween20。
7)proBNP(1-108)标准形式为重组蛋白的产物。
方案采用的测定的原理基于夹心放射免疫测定法，在可拆孔的平底微孔板中进行。这是一种一步测定法，其中依次加入样品(或proBNP(1-108)标准溶液)和示踪剂，中间不必洗涤。
√ 来自兔#046 805的多克隆抗体用Dulbecco PBS pH7.4缓冲液稀释为40μg/ml，首先用该抗体制备一种包被溶液。向微孔板的每个孔中加入300μl该溶液。
√ 微孔板在4℃下温育过夜。
√ 除去包被溶液后，微孔板用300μl含有0.1％Tween 20的Dulbecco PBS缓冲液pH7.4洗涤，然后加入300μl含有1％BSA的Dulbecco PBS缓冲液pH7.4饱和。
√ 微孔板然后在37℃下温育1小时。
√ 微孔板然后用300μl洗涤溶液(Dulbecco PBS缓冲液，pH7.4，添加0.1％Tween 20)洗涤(3次)。
√ 向每孔中加入100μl标准proBNP(1-108)溶液、血清或血浆。如果存在proBNP(1-108)，它将结合固相上保留的捕获抗体。
√ 向每孔中加入200μl即用的抗-BNP-I125示踪溶液(来自Shionogi Shionoria BNP试剂盒)。
√ 反应介质在4℃下温育过夜(18-22小时)。
√ 次日，微孔板用300μl洗涤溶液洗涤(3次)。在最后一次洗涤时，并且在吸出洗涤溶液后，将每个孔的内容物转移到一个预先确定的试管中。
√ 用γ计数器测量每孔中存在的放射性，该放射性与结合的示踪剂的含量成比例，因此与标本中存在的proBNP(1-108)的含量成比例。
图11显示使用proBNP(1-108)标准范围获得的结果。
实施例16人标本的测定结果14个来自正常个体的标本和15个来自心力衰竭患者的标本利用实施例15所述的根据本发明的proBNP(1-108)IRMA测定法和Roche公司所售的BNP(1-76)测定法检测，并且在Elecsys自动化装置上进行。血样均采集到含有EDTA的试管中。图12显示利用根据本发明的proBNP(1-108)IRMA测定法对这些标本进行的检测的结果，单位为cpm(每分钟的计数)。对心力衰竭患者的标本获得的结果显著高于正常个体标本的结果。这些结果证明心力衰竭患者的标本中存在循环proBNP(1-108)，并且第一次证明了血清proBNP(1-108)是预测心力衰竭的一种标志物。图13显示对来自14名心力衰竭患者的标本利用根据本发明的proBNP(1-108)IRMA测定法测定的proBNP(1-108)浓度(pg/ml)与在Elecsys自动装置上通过Roche测定获得的BNP(1-76)浓度(pg/ml)之间的相关性。观察到的相关性是显著的，系数R2＝0.85。
实施例17来自兔#046 805的多克隆抗体与生物素的偶联该偶联方法使用生物素的一种N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)衍生物，它可以与IgG的伯胺反应，形成一个酰胺键。
通过将生物素溶解于二甲基甲酰胺中制备(+)-生物素N-琥珀酰亚胺酯(Fluka #14405)的100mM溶液。生物素化在玻璃摇瓶中进行。预先纯化但是未消耗的500μg来自兔#046 805的多克隆抗体置于含有17μl100mM生物素溶液的摇瓶中(生物素/抗体摩尔比为500)。反应在Dulbecco PBS缓冲液pH7.4中进行。反应混合物在缓慢搅拌下室温温育1小时30分钟。偶联后，加入一定体积的2M甘氨酸缓冲液灭活生物素。混合物在缓慢搅拌下室温温育10分钟。最后，混合物在4℃下对Dulbecco PBS缓冲液pH7.4透析过夜。次日，以0.02％的终浓度加入叠氮钠溶液。将偶联物贮存于4℃下。
实施例18proBNP(1-108)的免疫酶测定也建立一种根据本发明的免疫酶测定。
材料1)固相平底Maxisorp微孔板，Nunc(丹麦)。
2)使用的捕获抗体是Strategic Biosolution公司所售的一种多克隆抗BNP(77-108)抗体(#B9105RA00-A0)。
3)使用的偶联物是按照实施例17所述的方法与生物素偶联的未消耗的来自兔#046 805的多克隆抗体。
4)链霉抗生物素-过氧化物酶偶联物(Amersham PharmaciaBiotech#RPN1231V)。
5)饱和缓冲液Dulbecco PBS缓冲液，pH7.4，含有1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma #A-7888)。
6)稀释缓冲液Dulbecco PBS缓冲液，pH7.4，含有0.1％ BSA和0.1％Tween 20。
7)洗涤溶液Dulbecco PBS缓冲液，pH7.4，含有0.1％ Tween 20。
8)proBNP(1-108)标准重组蛋白。
9)显色溶液显色溶液由下列成分组成9a)底物缓冲液0.01M柠檬酸和0.04M柠檬酸三钠的溶液，含有0.33％H2O2，终pH为5.6，和9b)发色团OPD(邻苯二胺)片。1片OPD溶解于10ml底物缓冲液中。
10)终止溶液4N H2SO4。
方案该测定的原理基于在平底微孔板中进行的夹心型免疫酶测定法。这是一种两步测定法，其中标本(或标准溶液)首先与捕获抗体温育，然后在温育和洗涤后加入检测抗体。
√ 首先用在Dulbecco PBS pH7.4缓冲液中稀释为10μg/ml的抗BNP(77-108)多克隆抗体制备一种包被溶液。向微孔板的每个孔中加入100μl该溶液。
√ 微孔板在4℃下温育过夜。
√ 除去包被溶液后，微孔板用300μl含有0.1％Tween 20的Dulbecco PBS缓冲液pH7.4洗涤，然后加入250μl含有1％BSA的Dulbecco PBS缓冲液pH7.4饱和。
√ 微孔板然后在37℃下温育1小时。
√ 微孔板然后用洗涤溶液洗涤(3次)。
√ 向每孔中加入100μl标准proBNP(1-108)溶液、血清或血浆。如果存在proBNP(1-108)，它将结合固相上保留的捕获抗体。
√ 反应介质在室温下温育2小时。
√ 微孔板然后用300μl洗涤溶液洗涤(5次)。
√ 向微孔板的每孔中加入100μl生物素化的来自兔#046 805的多克隆抗体(浓缩为6μg/ml)。
√ 反应介质在室温下温育2小时。
√ 微孔板然后用300μl洗涤溶液洗涤(5次)。
√ 最后，向微孔板的每孔中加入1/1000稀释的100μl链霉抗生物素-POD偶联物。
√ 反应介质在室温下温育1小时30分钟。
√ 微孔板然后用300μl洗涤溶液洗涤(5次)。向每孔中加入100μl显色溶液。反应体系在室温下(18-24℃)在暗处显色20分钟。
√ 然后向每孔中加入50μl终止溶液。
√ 反应终止后，用分光光度计读取490/620nm的光密度。
图14显示使用标准proBNP(1-108)范围获得的结果。
实施例19未消耗的、生物素偶联的、来自#046 805的多克隆抗体对于BNP(1-76)和BNP(77-108)的交叉反应的评价，该抗体在proBNP(1-108)ELISA测定中与抗BNP(77-108)多克隆抗体一起夹心使用。
未消耗的、生物素化的根据本发明的抗-proBNP(1-108)抗体(兔#046 805)对于BNP(1-76)和BNP(77-108)的交叉反应，通过实施例18所述的proBNP(1-108)ELISA测定评价。5ng/ml-100ng/ml的浓度范围用proBNP(1-108)、BNP(1-76)和BNP(77-108)制备，通过实施例18所述的proBNP(1-108)ELISA测定法测定。图15给出了每种蛋白质随浓度变化的490nm光密度变化的结果。未见对于BNP(1-76)或BNP(77-108)的交叉反应获得的信号相当于背景噪音，无论测定的浓度如何。在患者中常见的BNP(1-76)和BNP(77-108)浓度下(最高浓度的数量级为1ng/ml)，来自兔#046 805的多克隆抗体能够以未消耗的形式使用，而不导致产生交叉反应。
实施例20未消耗的、生物素偶联的、来自兔#046 805的多克隆抗体对于BNP(1-76)和BNP(77-108)的交叉反应的评价，该抗体在proBNP(1-108)ELISA测定中与抗NT-proBNP(1-29)多克隆抗体一起夹心使用。
未消耗的、生物素化的、来自兔#046 805的多克隆抗体对于BNP(1-76)和BNP(77-108)的交叉反应，通过一种proBNP(1-108)ELISA测定评价，该测定使用实施例18所述的方案和试剂，不同之处是在这种情况下，用一种抗-NT-proBNP(1-29)多克隆抗体代替抗BNP(77-108)多克隆抗体。
抗-NT-proBNP(1-29)多克隆抗体根据实施例3所述的方案生产，不同之处在于用作免疫原的肽是与KLH偶联的肽NT-proBNP(1-29)。5ng/ml-100ng/ml的浓度范围用proBNP(1-108)、BNP(1-76)和BNP(77-108)制备，通过proBNP(1-108)ELISA测定法测定。图16给出了每种蛋白质随浓度变化的490nm光密度变化的结果。根据本发明的来自兔#046 805的多克隆抗体未见对于BNP(1-76)或BNP(77-108)的交叉反应；获得的信号相当于背景噪音，无论测定的浓度如何。在患者中常见的BNP(1-76)和BNP(77-108)浓度下(数量级为1ng/ml)，来自兔#046 805的多克隆抗体能够以未消耗的形式使用，而不会产生交叉反应。
总之，根据以上公开的整个公开内容显然获知，本发明能够发现一种位于人proBNP(108)铰链区的新型表位RAPR76S77P，由它能够产生含有它的免疫原性肽，并且能够获得proBNP(108)特异性抗体，这些抗体基本上不识别BNP(1-76)或BNP(77-108)，其中一些能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)。
显然，本发明也能够发展一种对循环proBNP(1-108)的测定法，从而能够简单、常规、可靠地诊断心力衰竭。
序列表<110>BIO-RAD PASTEURCNRSUniversity of Monpellier<120>用于诊断心力衰竭的特异性抗体<130>BET 03P0750<150>FR 0210063<151>2002-08-07<160>124<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>108<212>PRT<213>人 proBNP(1-108)<400>1His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly1 5 10 15Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln20 25 30Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr35 40 45Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His50 55 60
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65 70 75<210>4<211>16<212>PRT<213>人工序列proBNP(70-85)<400>4Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly1 5 10 15<210>5<211>6<212>PRT<213>人工序列proBNP(73-78)<400>5Arg Ala Pro Arg Ser Pro1 5<210>6<211>8<212>PRT<213>人工序列肽<400>6Cys Gly Arg Ala Pro Arg Ser Pro1 5<210>7<211>8<212>PRT<213>人工序列肽
<220>
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<220>
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Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu1 5 10 15<210>32<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>32Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln1 5 10 15<210>33<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>33Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro1 5 10 15<210>34<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>34Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr1 5 10 15<210>35<211>15<212>PRT<213>人工序列肽
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1 5 10 15<210>51<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>51Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly1 5 10 15<210>52<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>52Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys1 5 10 15<210>53<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>53Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu1 5 10 15<210>54<211>15<212>PRT<213>人工序列肽
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<210>70<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>70Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly1 5 10 15<210>71<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>71Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu1 5 10 15<210>72<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>72Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu1 5 10 15<210>73<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>73
Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln1 5 10 15<210>74<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>74Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn1 5 10 15<210>75<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>75Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His1 5 10 15<210>76<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>76Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu1 5 10 15<210>77<211>15<212>PRT<213>人工序列肽
<400>77Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln1 5 10 15<210>78<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>78Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly1 5 10 15<210>79<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>79Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu1 5 10 15<210>80<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>80Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln15 10 15<210>81<211>15<212>PRT
<213>人工序列肽<400>81Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu1 5 10 15<210>82<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>82Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln1 5 10 15<210>83<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>83His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser1 5 10 15<210>84<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>84Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu1 5 10 15<210>85
<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>85Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu1 5 10 15<210>86<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>86Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro1 5 10 15<210>87<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>87Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu1 5 10 15<210>88<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>88Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys1 5 10 15
<210>89<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>89Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser1 5 10 15<210>90<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>90Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg1 5 10 15<210>91<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>91Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu1 5 10 15<210>92<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>92
Glu Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val1 5 10 15<210>93<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>93Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala1 5 10 15<210>94<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>94Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr1 5 10 15<210>95<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>95Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu1 5 10 15<210>96<211>15<212>PRT<213>人工序列肽
<400>96Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile1 5 10 15<210>97<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>97Thr Gly Va1 Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg1 5 10 15<210>98<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>98Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro1 5 10 15<210>99<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>99Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg15 10 15<210>100<211>15<212>PRT
<213>人工序列肽<400>100Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser1 5 10 15<210>101<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>101Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys1 5 10 15<210>102<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>102Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met1 5 10 15<210>103<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>103Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln1 5 10 15<210>104<211>35
<212>PRT<213>人工序列肽<400>104Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp1 5 10 15Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His20 25 30Lys Lys Lys35<210>105<211>10<212>PRT<213>人工序列肽<400>105Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys1 5 10<210>106<211>12<212>PRT<213>人工序列肽<400>106Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg1 5 10<210>107<211>13<212>PRT<213>人工序列肽
<400>107His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg1 5 10<210>108<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>108Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>109<211>16<212>PRT<213>人工序列肽<400>109Cys Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>110<211>11<212>PRT<213>人工序列肽<400>110Cys Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys1 5 10<210>111<211>13<212>PRT
<213>人工序列肽<400>111Cys Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val1 5 10<210>112<211>14<212>PRT<213>人工序列肽<400>112Cys Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln1 5 10<210>113<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>113Cys Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly1 5 10 15<210>114<211>13<212>PRT<213>人工序列肽<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>乙酰化
<400>114Cys Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Va1 Gln1 5 10<210>115<211>14<212>PRT<213>人工序列肽<400>115Cys Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly1 5 10<210>116<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>116Cys Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>117<211>16<212>PRT<213>人工序列肽<400>117Cys Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly1 5 10 15<210>118<211>11<212>PRT
<213>人工序列肽<400>118Cys Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val1 5 10<210>119<211>12<212>PRT<213>人工序列肽<400>119Cys Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln1 5 10<210>120<211>12<212>PRT<213>人工序列肽<400>120Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Cys1 5 10<210>121<211>14<212>PRT<213>人工序列肽<400>121Cys Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10<210>122
<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>122Cys Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly1 5 10 15<210>123<211>11<212>PRT<213>人工序列肽<400>123Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys1 5 10<210>124<211>12<212>PRT<213>人工序列肽<400>124Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly1 5 10
权利要求
1.一种抗proBNP(1-108)抗体，其特征在于首先，它特异地识别proBNP(1-108)的序列RAPR76S77P(SEQ ID No.5)，基本上不识别肽BNP(1-76)或BNP(77-108)，其次，它能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)。
2.如权利要求1所述的抗proBNP(1-108)抗体，它特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85(SEQ ID No.4)。
3.如权利要求1所述的抗proBNP(1-108)抗体，它特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84(SEQ ID No.108)。
4.获得如权利要求1、2和3之一所述的抗proBNP(1-108)抗体的方法，其中用完整的proBNP(1-108)分子免疫动物，然后用BNP(77-108)肽和/或BNP(1-76)肽消耗所获得的抗血清。
5.获得如权利要求1、2和3之一所述的抗proBNP(1-108)抗体的方法，其中用肽免疫动物，所述肽选自-下列通式的肽a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)其中，a1可以是H，或者可以代表如下官能团或化学基团，其选自硫醇、醇、氨氧基、伯胺或仲胺官能团、氨基羧基、生物素基和乙酰基，X1代表一种0-3个氨基酸的肽序列，它可能来源于或者可能不来源于proBNP(1-108)的天然序列，X2代表一种0-7个氨基酸的肽序列，它可能来源于或者可能不来源于proBNP(1-108)的天然序列，a2可以代表OH基、NH2基或烷氧基；-下列通式的肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)其中X可以是H，或者可以代表乙酰基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸；-下列通式的肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)其中X可以是H，或者可以代表乙酰基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸；-一种肽，其含有通过氨基酸Y70、T71、L72、K79、M80、V81、Q82、G83、S84和G85中的一个或多个的置换衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)或者衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)的序列，X可以是或者代表乙酰基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，且其中Z可以是OH基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸；-具有序列C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G(C13P30SEQ IDNo.16)的肽；-具有序列C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S(CN32SEQ ID No.109)的肽；且任选地，用BNP(77-108)肽和/或BNP(1-76)肽消耗所获得的抗血清。
6.获得如下杂交瘤的方法，所述杂交瘤分泌如权利要求1、2和3之一所述的抗proBNP(1-108)抗体，其中用选自如下的肽免疫动物，所述肽选自-下列通式的肽a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)其中，a1可以是H，或者可以代表如下官能团或化学基团，其选自硫醇、醇、氨氧基、伯胺或仲胺官能团、氨基羧基、生物素基和乙酰基，X1代表一种0-3个氨基酸的肽序列，它可能来源于或者可能不来源于proBNP(1-108)的天然序列，X2代表一种0-7个氨基酸的肽序列，它可能来源于或者可能不来源于proBNP(1-108)的天然序列，a2可以代表OH基、NH2基或烷氧基；-下列通式的肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)其中X可以是H，或者可以代表乙酰基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸；-下列通式的肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)其中X可以是H，或者可以代表乙酰基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸；-一种肽，其含有通过氨基酸Y70、T71、L72、K79、M80、V81、Q82、G83、S84和G85中的一个或多个的置换衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)或者衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)的一种序列，X可以是或者代表乙酰基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，其中Z可以是OH基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸；-具有序列C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G(C13P30SEQ IDNo.16)的肽；-具有序列C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S(CN32SEQ ID No.109)的肽；从该动物中采集分泌免疫球蛋白的淋巴细胞，将该淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，获得至少一种分泌免疫球蛋白的杂交瘤。
7.如权利要求5和6任一项所述的方法，其中通式(II)的肽具有序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85(SEQ ID No.4)。
8.如权利要求5和6任一项所述的方法，其中通式(III)的肽具有序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84(SEQ ID No.108)。
9.能够利用如权利要求6、7和8之一所述的方法生产的杂交瘤。
10.由如权利要求9所述的杂交瘤分泌的抗proBNP(1-108)单克隆抗体。
11.一种体外诊断人类心力衰竭的方法，包括使生物标本与如权利要求1、2、3和10之一所述的抗proBNP(1-108)抗体接触，并检测标本中的proBNP(1-108)。
12.一种体外诊断人类心力衰竭的方法，包括a)使生物标本与如权利要求1、2、3和10之一所述的抗proBNP(1-108)抗体接触，b)在允许形成抗原-抗体复合物的条件下温育该混合物，和c)任选地使用能够与初级复合物中存在的proBNP(1-108)特异结合的经标记的检测抗体，或者使用能够与针对初级复合物中存在的proBNP(1-108)的抗体结合的经标记的检测抗原，显示形成的抗原-抗体复合物。
13.如权利要求12所述的诊断方法，它还包括步骤d)将显示的抗原-抗体复合物的量与个体的临床状况相关联。
14.一种检测生物标本中proBNP(1-108)的试剂盒，其含有至少一种如权利要求1、2、3和10之一所述的抗体。
15.如权利要求14所述的检测生物标本中proBNP(1-108)的试剂盒，其(i)在一个容器中含有至少一种如权利要求1、2、3和10之一所述的抗体；(ii)在另外一个容器中含有至少一种选自下列的肽-下列通式的肽a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)其中，a1可以是H，或者可以代表如下官能团或化学基团，其选自硫醇、醇、氨氧基、伯胺或仲胺官能团、氨基羧基、生物素基和乙酰基，X1代表一种0-3个氨基酸的肽序列，它可能来源于或者可能不来源于proBNP(1-108)的天然序列，X2代表一种0-7个氨基酸的肽序列，它可能来源于或者可能不来源于proBNP(1-108)的天然序列，a2可以代表OH基、NH2基或烷氧基；-下列通式的肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)其中X可以是H，或者可以代表乙酰基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸；-下列通式的肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)其中X可以是H，或者可以代表乙酰基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸；-一种肽，其含有通过氨基酸Y70、T71、L72、K79、M80、V81、Q82、G83、S84和G85中的一个或多个的置换，衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)或者衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)的一种序列，X可以是或者代表乙酰基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，Z可以是一个OH基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸；-具有序列Y70TLRAP R76S77PKMVQGSG85(SEQ ID No.4)的肽；-具有序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84(SEQ ID No.109)的肽；-具有序列C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G(C13P30SEQ IDNo.16)的肽；-具有序列C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S(CN32SEQ ID No.108)的肽。
16.下列通式的肽a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)，其中，a1可以是H，或者可以代表如下官能团或化学基团，其选自硫醇、醇、氨氧基、伯胺或仲胺官能团、氨基羧基、生物素基和乙酰基，X1代表一种0-3个氨基酸的肽序列，其可能来源于或者可能不来源于proBNP(1-108)的天然序列，X2代表一种0-7个氨基酸的肽序列，其可能来源于或者可能不来源于proBNP(1-108)的天然序列，a2可以代表OH基、NH2基或烷氧基。
17.下列通式的肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II)其中X可以是H，或者可以代表乙酰基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸。
18.如权利要求17所述的肽，其具有序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85(SEQ ID No.4)。
19.下列通式的肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)其中X可以是H，或者可以代表乙酰基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸。
20.如权利要求19所述的肽，其具有序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84(SEQ ID No.108)。
21.一种肽，其含有通过氨基酸Y70、T71、L72、K79、M80、V81、Q82、G83、S84和G85中的一个或多个的置换，衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)或者衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)的序列，X可以是或者代表乙酰基，或者不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸，Z可以是OH基，或者是不属于proBNP(1-108)的序列的1-3个氨基酸。
22.如权利要求16所述的肽，其具有选自下列序列的序列SEQ ID No.16C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G(肽C13P30)SEQ ID No.109C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S(肽CN32)SEQ ID No.6C-G-R-A-P-R-S-PSEQ ID No.7乙酰基-C-G-R-A-P-R-S-PSEQ ID No.8C-G-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No.9乙酰基-C-G-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No.10C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-VSEQ ID No.11C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GSEQ ID No.12R-A-P-R-S-P-G-CSEQ ID No.13乙酰基-R-A-P-R-S-P-G-CSEQ ID No.110C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No.111C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-VSEQ ID No.112C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-QSEQ ID No.113C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-GSEQ ID No.19C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-βASEQ ID No.20C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-A-T-βASEQ ID No.114乙酰基-C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-QSEQ ID No.115C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-GSEQ ID No.116C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-SSEQ ID No.117C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GSEQ ID No.118C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-VSEQ ID No.119C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-QSEQ ID No.120L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-CSEQ ID No.121C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-SSEQ ID No.122C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G。
23.一种获得抗proBNP(1-108)抗体的方法，该抗体特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)肽，并且能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)，在该方法中，用如权利要求16-22之一所述的肽免疫动物，且任选地，用BNP(77-108)肽和/或BNP(1-76)肽消耗所获得的抗血清。
24.获得如下杂交瘤的方法，该杂交瘤分泌抗proBNP(1-108)抗体，该抗体特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不识别BNP(1-76)和BNP(77-108)肽，并且能够特异地识别人血清或血浆标本中的循环proBNP(1-108)，在该方法中，用如权利要求16-22之一所述的肽免疫动物，从该动物中提取分泌免疫球蛋白的淋巴细胞，将该淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，获得至少一种分泌免疫球蛋白的杂交瘤。
25.一种抗proBNP(1-108)抗体，其特征在于它是通过如权利要求23所述的方法获得的。
26.如权利要求25所述的抗proBNP(1-108)抗体，它特异地识别proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85或序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84。
27.能够利用如权利要求24所述的方法产生的一种杂交瘤。
28.由如权利要求27所述的杂交瘤分泌的一种抗proBNP(1-108)单克隆抗体。
29.如权利要求28所述的抗proBNP(1-108)单克隆抗体，它由保藏于CNCM保藏号为CNCM I-3073的杂交瘤3D4分泌。
30.一种体外诊断人类心力衰竭的方法，包括使生物标本与如权利要求25、26、28和29任一项所述的抗proBNP(1-108)抗体接触，并检测标本中的proBNP(1-108)。
31.一种体外诊断人类心力衰竭的方法，包括a)使生物标本与如权利要求25、26、28和29任一项所述的抗proBNP(1-108)抗体接触，b)在允许形成抗原-抗体复合物的条件下温育该混合物，和c)任选地使用能够与初级复合物中存在的proBNP(1-108)特异结合的经标记的检测抗体，或者使用能够与针对初级复合物中存在的proBNP(1-108)的抗体结合的经标记的检测抗原，显示形成的抗原-抗体复合物。
32.如权利要求31所述的诊断方法，它还包括步骤d)将显示的抗原-抗体复合物的量与个体的临床状况相关联。
33.一种检测生物标本中的proBNP(1-108)的试剂盒，其含有至少一种如权利要求25、26、28和29之一所述的抗体。
34.一种检测生物标本中的proBNP(1-108)的试剂盒，它含有至少一种如权利要求16-22之一所述的肽作为标准和/或对照。
35.一种检测生物标本中的proBNP(1-108)的试剂盒，其-在一个容器中含有至少一种如权利要求25、26、28和29之一所述的抗体；-在另外一个容器中含有至少一种如权利要求16-22之一所述的肽。
全文摘要
本发明涉及心力衰竭的体外诊断。更具体而言，本发明涉及一种肽结构域的特异性抗体，该结构域位于proBNP(1－108)的铰链区R
文档编号C07K16/18GK1678635SQ03820838
公开日2005年10月5日 申请日期2003年8月7日 优先权日2002年8月7日
发明者B·波, I·朱利亚尼, F·里尼尔 申请人:比奥-拉德巴斯德公司, 国家科研中心, 蒙彼利埃第一大学