寡核苷酸分离和去保护的方法

专利名称：寡核苷酸分离和去保护的方法
技术领域：
本发明涉及寡核苷酸的分离和去保护，并且更特别地，涉及利用可弃型分离柱获得去保护寡核苷酸的方法。
背景基于DNA的分析技术，尤其是基于阵列的分析方法学，已对寡核苷酸生产产业的发展产生了巨大的影响，其已发展了平行合成技术以满足生物技术市场之需。平行合成允许在单个工作日内在单台仪器上合成大量寡核苷酸。该过程已被优化至这样的水平，即多数物质尤其是设计作为PCR引物的较短寡核苷酸，可无需任何纯化而使用。事实上，尽管存在着使用纯化物质可能获得的优势，许多寡核苷酸是以非纯化形式直接使用的。
对于许多分析技术而言，期望使用较长寡核苷酸(如长度为70到100个核苷酸的锁式探针)，因为它们区分不同靶标的特异性优于较短寡核苷酸。该长度的粗合成寡核苷酸严重污染有较短片段，因而需要纯化以避免与非特异性结合相关的问题(Jobs等Ana1.Chem.74(1)199-202(2002))。在合成期间可发生失败的偶联和/或副反应，其可产生非全长或不完整的寡核苷酸。另外，可发生酸催化的脱嘌呤，导致寡核苷酸去保护期间寡核苷酸主链的切割。所以化学合成产生寡核苷酸群，其必须加以纯化以获得期望的寡核苷酸。因而，典型的合成寡核苷酸反应混合物含三种主要成分全长产物、截短片段以及由先前脱嘌呤的寡核苷酸片段的碱基切割产生的寡核苷酸。全长产物可能包括缺失片段(如具有单个(n-1)或两个(n-2)核苷酸缺失的片段)。另外，寡核苷酸反应混合物可能污染有具有不想要的双掺入核苷酸的产物(n+产物)，还有不完全或不正确去保护的片段。不纯的寡核苷酸无论多长，可能导致不清楚的结果，正如见于以质谱为基础的分析或在某些情况下(Villadas等Anal.Biochem.300(1)101-103(2002))，不纯的寡核苷酸可阻止获得任何有意义的结果。
因而，需要有效的纯化操作来处理可合成的大量寡核苷酸。合成期间，在偶联最后一个寡核苷酸之后，三苯甲基部分典型地留在寡核苷酸的5’端，以促进全长寡核苷酸的纯化。所述三苯甲基部分通常为二甲氧基三苯甲基(DMTr)或单甲氧基三苯甲基(MMTr)，是需要最终除去的酸不稳定保护基团。这种去保护或去三苯甲基化通常在溶液中利用80％乙酸水溶液或者在柱(cartridge)上利用2％三氟乙酸(TFA)水溶液进行。在使用柱的寡核苷酸去三苯甲基化期间，释放的具有游离5’OH的寡核苷酸和新形成的三苯甲基阳离子在整个过程中都必须紧密结合在柱上。随后，洗出酸，并用乙腈和水洗脱去三苯甲基化的寡核苷酸。尽管该过程看似非常简单，可是去三苯甲基化反应 是可逆的，且平衡常数取决于酸以及两个去保护产物的浓度。寡核苷酸和三苯甲基阳离子在柱上有限的迁移性导致这两种分子极高的有效浓度。因此，柱上的寡核苷酸去三苯甲基化可导致去三苯甲基化寡核苷酸产率低(50％或更低)，并且可伴随三苯甲基部分的再结合。尽管在酸中延长的去保护可在寡核苷酸中造成额外的无嘌呤位点，未去三苯甲基化的物质可重新去三苯甲基化。因此，需要在柱上对寡核苷酸去三苯甲基化的有效方法。
概述本发明基于这样的发现，即寡核苷酸能够以使得所述寡核苷酸不溶的方式非共价固定到固相支持物上。因此，尽管连接在寡核苷酸一端或两端的疏水分离功能元件(function)可被选择性除去，所述寡核苷酸能够依然紧密结合在所述支持物上。本发明的方法允许寡核苷酸在温和条件下快速去保护(如去三苯甲基化)，同时使得去保护寡核苷酸的产率最大化。另外，非共价固定的寡核苷酸可在非水条件下在柱上衍生化(如通过掺入荧光团)。本发明的方法可用于同时纯化和衍生化多数个寡核苷酸。
在一方面，本发明以用于寡核苷酸去保护的方法为特征。该方法包括提供多数个包括受保护寡核苷酸在内的寡核苷酸，其中(i)每个受保护寡核苷酸的5′端与疏水分离功能元件相连或者(ii)每个受保护寡核苷酸都与一对疏水分离功能元件相连，其中所述疏水分离功能元件对中一员较之于该对中的另一员疏水性较小；利用有机溶剂将所述多数个寡核苷酸沉淀到疏水固相支持物上，以产生非共价固定的寡核苷酸；并利用溶于有机溶剂(如二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮或异丙醇)的试剂通过(i)从所述固定寡核苷酸中选择性除去所述5′分离功能元件或者(ii)从所述固定寡核苷酸中顺序除去所述疏水分离功能元件对来对所述固定寡核苷酸进行去保护。沉淀可包括在所述疏水固相支持物上预干燥所述多数个寡核苷酸，然后用所述有机溶剂洗涤所述疏水固相支持物。所述疏水固相支持物可以柱(cartridge)或含多数个柱的歧管的形式提供。所述疏水固相支持物可以是基于聚苯乙烯、炭、石墨或硅石的。
该方法可进一步包括，在沉淀前，将所述多数个寡核苷酸吸附到疏水支持物上，并洗脱(i)缺乏所述5′疏水分离功能元件的寡核苷酸或者(ii)缺乏任何保护基团的寡核苷酸以及仅含所述疏水分离功能元件对中疏水性较小的分离功能元件的寡核苷酸。该方法可进一步包括洗脱所述去保护的寡核苷酸。
所述5′疏水分离功能元件可以是三苯甲基部分、疏水缩醛或硫缩醛基团。所述三苯甲基部分可以是二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、甲呱啶(pixyl)或单甲氧基三苯甲基部分。例如，所述三苯甲基部分可以从由4-己氧基甲氧基三苯甲基、4-癸氧基甲氧基三苯甲基、4-十六烷氧基甲氧基三苯甲基、4-十八烷氧基苯呫吨基、4-4′-二-己氧基甲氧基三苯甲基、4-4′-二-癸氧基甲氧基三苯甲基、4-4′-二-十六烷氧基甲氧基三苯甲基、4-十八烷氧基三苯甲基、4-十六烷氧基三苯甲基、4-癸氧基三苯甲基和4-己氧基三苯甲基部分组成的组中选择。所述三苯甲基部分可利用酸的非水溶液(如溶于二氯甲的2％三氯乙酸)选择性除去。
所述疏水分离功能元件对的一员可以是直链烷基、支链烷基、芳基烷基或芳基，其通过接头与寡核苷酸相连，所述接头可在不除去所述疏水分离功能元件对另一员的条件下去除。所述接头可以是甲硅烷氧基或二甲硅烷氧基功能元件。
所述多数个寡核苷酸之内可包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，并且可包括非标准主链(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或磷酰胺(phosphoramido))。寡核苷酸可以是锁核酸(LNA)。寡核苷酸可以含有与官能团(如氨基、硫醇、磷酸、醛、嵌入剂、猝灭剂或荧光团)相连的一个或多个核苷酸。所述官能团可位于所述寡核苷酸的任一端或寡核苷酸的两端。所述官能团在各端可以不同。所述5′分离功能元件或者所述疏水分离功能元件对的一员可连接在所述官能团上。所述疏水分离功能元件对的一员可连接在接头上，并且所述接头可连接在所述官能团上。
该方法可进一步包括使用非水条件衍生化所述固定寡核苷酸。例如，衍生化可包括将荧光团掺入到所述纯化的寡核苷酸中和洗脱所述衍生化寡核苷酸。
除非另行定义，本文所用所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员一般理解的相同的含义。下文描述了合适的方法和材料，尽管可利用与文中所述的那些类似或等同的方法和材料实施本发明。特此将文中提及的所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献全文并入作为参考。如有冲突，将以本说明书包括定义为准。另外，材料、方法及实施例仅用于举例说明而并不旨在限制。
本发明的其它特征和有利之处将会由以下详细描述以及由权利要求而变得显而易见。


图1为于聚苯乙烯支持物上制备的二甲硅烷氧基连接的寡核苷酸基于柱的分离图。
图2为MMTr-NH标记的寡核苷酸基于柱的分离和去保护图示。
图3显示了柱纯化的寡核苷酸选择的毛细管电泳操作。
图4为双标记寡核苷酸(分子信标)的合成策略。
详细描述一般而言，本发明的方法允许多数个化学合成的寡核苷酸如在固相支持物上合成的寡核苷酸基于连接在所述寡核苷酸一端或两端的疏水分离功能元件而被分离。本发明的方法允许从全长寡核苷酸中分离由于寡核苷酸物质脱嘌呤和随后的切割而产生的较短片段。这将色谱可有效并实际分离的物质的长度延长到目前DNA合成的极限。在有些实施方案中，可将寡核苷酸非共价固定到固相支持物上，从而使得所述寡核苷酸不溶，并且可除去5′疏水分离功能元件(如5′保护基)并且所述寡核苷酸可以衍生化。在其它实施方案中，所述寡核苷酸连接于一对疏水分离功能元件，其中该疏水分离功能元件对中的一员较之于该对中的另一员疏水性较小。本发明的方法可在可弃型柱(反相柱)上用于寡核苷酸的高通量多重分离。
寡核苷酸如本文所用，术语“寡核苷酸”包括具有3′-5′磷酸二酯主链的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸寡聚体，以及具有不同于标准3′-5′磷酸二酯键的主链结构(如肽核酸(PNA)、甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或磷酰胺键)的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸寡聚体。术语“寡核苷酸”也包括含非标准碱基成分如肌苷或nubularine、修饰碱基成分、修饰糖成分以及此类成分之组合的寡聚体。例如，可修饰含氮碱基或糖成分以包括反应官能团(如C5丙炔、卤素或生物素)和标记(如放射性、化学发光、场致发光、可见、近红外及荧光)。糖成分的另外修饰包括添加将呋喃糖环2′-O位连接到4′-C位的亚甲基接头。这种修饰被称之为锁核酸(locked nucleic acid)(LNA)；含一个或多个LNA修饰的核酸称之为LNA。
用于合成寡核苷酸(包括含非标准碱基的寡核苷酸)的方法是本领域公知的。例如，寡核苷酸可通过β-氰基乙基亚磷酰胺法组装。例如有关寡核苷酸合成方法，参见″Oligonucleotide SynthesisAPractical Approach，″编辑M.J.Gait，IRL Press，1984、WO92/09615以及WO98/08857。可利用自动化寡核苷酸合成仪机器生产寡核苷酸。此类合成仪是公知的，并且可由包括Applied Biosystems和AmershamPharmacia Biotech在内的许多公司获得。
寡核苷酸合成典型地使用固相支持物，其上经由连至核苷酸3′-O的接头连接了一个或多个受保护核苷酸。接头是指含有原子链如碳、氮、氧等的任何分子，其在水解方面稳定，并起着将待于支持物上合成的分子与所述支持物相连接的作用。在支持物上的合成起始之前，接头通常经由共价键连接在支持物上，并提供一个或多个供待合成分子前体连接的位点。应当理解，有时，接头包括一个或多个核苷酸如polyT，它们并非最终完成的全长寡核苷酸的一部分。为接头的一部分，但并非最终完成的全长寡核苷酸的一部分的核苷酸并不视为寡核苷酸的3′-端。含二甲硅烷氧基的接头(如直接连接于寡核苷酸3′羟基的四异丙基二甲硅烷氧基功能元件)尤为有用，并且可利用在Kwiatkowski等，Nucleic Acids Res.，244632-4638(1996)、Kwiatkowski等，Nucleic Acids Res.，27(24)4710-14(1999)或WO 98/08857中提供的方法产生。需要指出的是官能团(如氨基、硫醇、磷酸、醛、嵌入剂、猝灭剂或荧光团)可连接在接头上。
随着另外核苷酸单体的相继加入，所得寡核苷酸以3′到5′端的方向延伸。一旦寡核苷酸达到了期望的长度，可利用上述出版物中描述的技术对所述寡核苷酸进行部分去保护、切割无嘌呤位点、并除去由所述切割得到的任何较短片段。然后可以从支持物上取下依然与合成支持物相结合的寡核苷酸。在二甲硅烷氧基接头的情况下，可利用破坏所述硅-氧键的试剂从支持物上切下所述寡核苷酸。
分离功能元件典型地，本发明的方法中使用包含受保护寡核苷酸的多数个寡核苷酸。如本文所用，受保护核苷酸是指这样的寡核苷酸，即其5′端连接有疏水分离功能元件，或者该寡核苷酸连接有一对疏水分离功能元件，其中该对中一员连接在5′端，而另一员连接在所述寡核苷酸的3′端。如果有一对疏水分离功能元件连接在寡核苷酸上，则该疏水分离功能元件对中的一员较之于另一员疏水性较小。在一个实施方案中，3′分离功能元件可比5′分离功能元件具有实质上更高的疏水性。在其它实施方案中，5′分离功能元件可具有实质上更高的疏水性。
连接在寡核苷酸3′端的分离功能元件可以是固相支持物与第一核苷酸即寡核苷酸3′端之间的接头的组成成分。寡核苷酸3′端的分离功能元件典型地在氨水处理下是稳定的，从而当寡核苷酸从固体支持物上释放的时候，所述分离功能元件将不会从寡核苷酸上切割。例如，合适的3′分离功能元件包括直链烷基、支链烷基、芳基烷基或芳基。直链或支链二醇如1，10-癸二醇或其它疏水二醇是尤为有用的疏水分离功能元件。
5′分离功能元件可与5′末端核苷酸构件一起引入，在合成期间向该寡聚体添加末端的适当衍生化的亚磷酰胺。术语“构件”既包括末端核苷酸，也包括用以引入末端官能团象磷酸、胺、硫醇、亚肼基、醛基或氨基氧基的化学部分。用于寡核苷酸5′端的合适的分离功能元件不限于标准的二甲氧基三苯甲基(DMTr)、甲呱啶(Px)或单甲氧基三苯甲基(MMTr)基团，而包括所有类型的酸不稳定保护基团。尤为重要的有三苯甲基(Tr)、三甲氧基三苯甲基(TMTr)、甲氧基甲呱啶(MPx)以及向寡核苷酸引入附加疏水性的其它基团。后者可选自4-己氧基甲氧基三苯甲基(C6MTr)、4-癸氧基甲氧基三苯甲基(C10MTr)、4-十六烷氧基甲氧基三苯甲基(C16MTr)、4-十八烷氧基苯呫吨基(C18Px)、4-4′-二-己氧基甲氧基三苯甲基(bisC6Tr)、4-4′-二-癸氧基甲氧基三苯甲基(bisC10MTr)和4-4′-二-十六烷氧基甲氧基三苯甲基(bisC16MT)、4-十八烷氧基三苯甲基(C18Tr)、4-十六烷氧基三苯甲基(C16Tr)、4-癸氧基三苯甲基(C10Tr)和4-己氧基三苯甲基(C6Tr)。有关其它高度疏水的三苯甲基基团的实例，也见美国专利No.5,892,007。这些极为疏水的功能元件对于分离相对长的寡核苷酸具有价值，此处常见二甲氧基三苯甲基基团的作用可以不足以定量并无损失地将三苯甲基化的分子锚定到支持物上。如美国专利No.5,319,079所述，在三苯甲基交换过程中，也可以在合成寡核苷酸的5′位引入不同类型的取代的三苯甲基基团。疏水的缩醛或硫缩醛基团也是有用的5′功能元件。
具有强疏水性的分离功能元件可用于合成和纯化双标记的寡核苷酸(如taqman探针和分子信标)，其在所述寡核苷酸的每一端由不同的染料标记。此类探针必需极纯，以有效猝灭染料荧光。为获得满意的纯度，这类探针通常以多步操作制备，每一步都紧跟着进行广泛的层析纯化。对此种冗长操作的需要反映在商业上双标记探针的高价上。制备双标记探针所用的典型染料具有相当的疏水性能；因而，使用标准DMTr基团作为5′分离功能元件将会产生极难在HPLC中分离并且不可能在柱上分辨开来的混合物。不过，用比DMTr更为疏水的C18Px或C18Tr功能元件替换DMTr基团，则使得来自两种染料的疏水作用无效，并允许根据本发明的方法分离双标记探针。
吸附到疏水支持物上在寡核苷酸已从它在其上合成的支持物上释放之后，可将所述寡核苷酸吸附到疏水支持物上。典型地，所述疏水支持物由与支持材料如基于硅石、炭、石墨或聚苯乙烯的颗粒化学键合的、长度在从4到24碳(如8到18碳)范围内变化的烃链组成。烃链可以是分枝的，并且可具有一个或多个芳族取代。例如，C18链可键合到基于硅石的颗粒上，以形成可用的疏水支持物。苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物是相对便宜且对许多试剂和溶剂而言为惰性的通用支持材料。对碱性氨溶液和对TBAF的抗性使得该材料尤为有用。尽管基于硅石的材料对试剂和溶剂的抗性不如基于苯乙烯的支持物，任何有害试剂和基于硅石的支持物之间短的接触时间以及有些试剂因水稀释而致的可能的失活，使得该支持物可用。事实上，与未处理的柱相比，填充RP18硅石并由10％氨水或0.1M TBAF水溶液预处理的小HPLC柱，在模型寡核苷酸反应混合物的分离中并不表现出任何实质性差异。
另外可用的支持物包括基于氧化锆的材料，其对碱降解具有低敏感性，或者以活性炭为基础的支持物，其完全抗碱降解。
典型地，疏水支持物以柱或含多数个柱的歧管(如柱板)的形式提供。可弃型柱可靠且不贵，并允许按比例增加同时进行的分离的数目或者分离物质的数量。可配制含多种元件(如阀、泵、注射单元和分段收集器)和柱的系统，以自动化寡核苷酸的分离。柱可以相继或并行的方式运行，取决于特定寡核苷酸优选的分离顺序。分离寡核苷酸的操作可自动化(如利用机器人系统处理所有样品和溶剂)。为避免与柱性能差异相关的问题并降低处理时间，歧管或其它平台可与真空系统偶联并由其驱动，这允许在添加每种试剂或洗脱剂之后干燥所有柱。
当将寡核苷酸吸附到疏水支持物上时，为避免产物的大量损失，可预处理寡核苷酸，以达到与固相相互作用的最佳形式。这可通过使用含有使得寡核苷酸更为疏水的疏水反离子的缓冲液实现。引入到寡核苷酸的疏水性程度可通过从三-或四-甲基、乙基、丙基、丁基和戊基铵盐的组中选择物质加以控制。叔铵盐和季铵盐尤为有用。实践中，使用易于挥发的盐如碳酸盐或乙酸盐是有利的。另一种考虑是拥有强疏水分离功能元件的寡核苷酸聚集成不渗透到支持物细孔中、而是直接流过柱的结构的倾向。为破坏这些聚集物，可将盐浓度升至相对高的水平，并且可使用有机溶剂象乙醇、乙腈或二甲基甲酰胺(DMF)使该疏水结构溶剂化。
一旦寡核苷酸吸附到疏水支持物上，就可洗脱缺乏5′疏水分离功能元件的寡核苷酸。在寡核苷酸连接于一对疏水分离功能元件的情况下，则洗脱缺乏任何保护基的寡核苷酸或者仅含较小疏水性分离功能元件的寡核苷酸。例如，当3′分离功能元件具有较高疏水性时，可洗脱缺乏任何分离功能元件的寡核苷酸以及仅具有5′分离功能元件的寡核苷酸。如果5′分离功能元件具有更高疏水性，则可洗脱缺乏任何分离功能元件的寡核苷酸以及仅具有3′分离功能元件的寡核苷酸。
为消除缺乏5′疏水分离功能元件(如三苯甲基功能元件)的寡核苷酸，可利用由三乙基醋酸铵和10-20％乙腈组成的洗脱溶剂有效洗出较小疏水性的寡核苷酸。尽管作为脱嘌呤和随后切割脱嘌呤链的结果出现的寡核苷酸片段比全长物质更为疏水，且难于分级分离，本发明使得这些片段在实际的柱分离之前被有效洗掉，或者在柱上利用由两种分离功能元件操纵的系统选择性排除。
将寡核苷酸沉淀到疏水固相支持物上在消除全部较短片段后，余下的产物可从柱上简单地洗脱，然后在挥发性物质蒸发后去三苯甲基化。然而，该操作需要额外的酸蒸发，并且通常需要脱盐阶段。在本发明中，可除去寡核苷酸5′端的分离功能元件或者寡核苷酸上的疏水分离功能元件对，而同时寡核苷酸仍连接在柱上。
如本文所述，可在有机溶剂中将寡核苷酸沉淀到柱上，并且随后可除去分离功能元件。寡核苷酸可依然紧密结合在支持物上，而可选择性除去5′分离功能元件(如三苯甲基部分)，或者相继除去5′和3′分离功能元件。因而，寡核苷酸可在温和条件下快速去保护(如去三苯甲基化)，同时最大化去保护寡核苷酸的产率。如本文所用，术语“沉淀”是指支持物表面上不溶脱水物质的形成。例如，寡核苷酸可通过风干然后用乙腈冲洗而沉淀在柱上。以这种方式处理的寡核苷酸依然紧密结合在柱上，并且未观察到寡核苷酸损失，即使是在乙腈前级分中。见实施例1。寡核苷酸可由有机溶剂如乙腈或其它有机溶剂如二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮或异丙醇沉淀。需要指出所述有机溶剂可包含小百分比的水而仍然适用于本发明。
一旦寡核苷酸非共价固定在固相支持物上，则可利用酸的非水溶液(如溶于二氯甲烷的2％三氯乙酸(TCA))除去5′分离标签。例如，当将2％TCA的二氯甲烷溶液施加到含有以DMTr成分保护的寡核苷酸的柱上时，迅速形成肉眼可见的DMTr阳离子橙色条带，并且易于从柱上洗出。如本文所述，可在C18-硅柱板上在少于30分钟内分离96条寡核苷酸，这比其它商业上可得到的可需要多达4小时分离所述寡核苷酸的系统更快。因而，在本发明的方法中，三苯甲基部分从柱中消除，这推进了去三苯甲基化反应完成。过量的酸可通过用有机溶剂(如乙腈)洗涤除去，而终产物可通过包含乙腈或其它有机溶剂的洗脱剂从柱中洗脱。含40％乙腈的组合物能够洗脱所有含寡核苷酸的物质。如果期望，可在另外单独的分析HPLC操作中检测任何残余的未去保护的寡核苷酸。如本文所述，仅观察到痕量三苯甲基化的起始材料(通常比5％少得多)，表明本发明的去三苯甲基化操作基本上是定量的。
当受MMTr基团保护的5′-氨基烷基寡核苷酸如上文所述吸附、沉淀并去三苯甲基化时，立即形成MMTr阳离子黄色条带，并且很容易从柱上洗出。整个去三苯甲基化操作在少于195秒内以定量产率完成。在该同一期限内，2％TFA仅导致8.4％转化为去三苯甲基化物质。通过应用一级动力学，估计对于99％的去三苯甲基化，2％TFA将需要140分钟。2％v/v TFA的实际酸浓度相当于0.26M而2％w/v TCA仅为0.12M。因而，令人惊讶的是，尽管存在TFA溶液比TCA酸性高大约20倍的事实，2％TCA在反应性上具有120倍的差异。
在寡核苷酸连接于一对分离功能元件、其中3′分离功能元件比5′分离功能元件具有更高的疏水性的情况下，可切割接头，并洗脱缺乏任何疏水功能元件的寡核苷酸。余下的物质可利用有机溶剂再沉淀到柱上，并且可除去5′分离功能元件，而纯的去保护产物可如上文所讨论的那样洗脱。当5′分离功能元件比3′分离功能元件具有更高的疏水性时，可如上文所讨论的那样除去5′分离功能元件，并洗脱缺乏任何疏水功能元件的片段。余下的物质可用有机溶剂再沉淀到柱上，接头可被切割，而纯的去保护产物可得以洗脱。
衍生化寡核苷酸一旦拥有反应性官能团的寡核苷酸被非共价固定到固相支持物上，则所述寡核苷酸可在选择的有机溶剂中并与否则与水反应的试剂进行衍生化。可用的非水溶剂的非限制性实例包括吡啶、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、三乙胺、丙酮、乙腈和二氯甲烷。与水反应的试剂的非限制性实例包括酰氯、酸酐、混合酸酐、以及与不同激活剂一起使用的酸。另外，许多官能团作为活性酯递送，其中许多昂贵，因而需要以最大的效率使用。因而，在本发明的方法中，活性酯可用于衍生化寡核苷酸而无需经受水解。寡核苷酸的一个或多个核苷酸可通过掺入官能团如氨基、硫醇、磷酸、醛、嵌入剂、猝灭剂、荧光团或允许寡核苷酸穿透细胞膜的成分而衍生化。在有些实施方案中，官能团置于寡核苷酸的任一端。在其它实施方案中，官能团置于寡核苷酸的两端。官能团在寡核苷酸的各端可以不同。
本发明将在下列实施例中进一步描述，这并不限制权利要求书描述的本发明的范围。
实施例实施例中所用试剂和分析及制备方法除非另行指出，在本方法部分之后的实施例中使用如下试剂和方法。
根据WO98/08857制备5′-O-(4，4′-二甲氧基)三苯甲基胸苷基3′-O-(1，1，3，3-四异丙基-二甲硅烷氧基-3)-(1-O-3，6，9-三氧杂)十一-11-醇及其亚磷酰胺衍生物。商业上可获得的CPG(1000；CPGInc.，Fairfield；或Applied Biosystems，Foster City，CA)用类似于Pon，RT，″Chapter19 Solid-phase Supports forOligonucleotide Synthesis，″Methods in Molecular Biology Vol.20 Protocols for Oligonucleotides and Analogs，465-497，编辑S.Agrawal，Humana Press Inc.，Towata，NJ(1993)描述的方法胺化。羟基CPG通过氨基衍生化的CPG与γ-丁内脂在吡啶中反应获得。所有商业化学制品为合成级质量，并无需进一步纯化而使用。
寡核苷酸合成在ABI 394 DNA合成仪上或者在由台湾台北中华科学院生物医学科学研究所开发的1536通道寡核苷酸合成仪MultiSyn(Cheng等Nucleic Acids Res.待出版(2002))上实施。所有偶联利用由苯甲酰(dA、dC)和/或异丁酰(dG)基团在环外胺功能元件上保护的amidite、在推荐用于0.2μmol或更小规模合成的条件下进行。如果需要，最后一个核苷亚磷酰胺替换为由另一个5′保护基衍生化的核苷亚磷酰胺，或者最终的二甲氧基三苯甲基(DMTr)基团根据三苯甲基交换法交换为其它三苯甲基衍生物(见美国专利No.5,319,079)。
氨去保护的寡核苷酸的分析性液体层析在配备有LiChrosorb RP18(5μm)柱、二极管阵列检波器的Hitachi-Merck La Chrom HPLC系统中进行，使用40分钟线性梯度的溶剂A溶于0.1M醋酸三乙铵(″TEAA″)的5％v/v乙腈(″MeCN″)，pH7.0和溶剂B溶于0.1M TEAA的80％v/v乙腈，pH7.0。毛细管电泳(CE)分析在Beckman系统中使用ssDNA100-R毛细管单元(毛细管长度30cm)进行。
实施例1-在聚苯乙烯支持物上制备的二甲硅烷氧基连接的寡核苷酸基于柱的分离根据如下操作在氨基甲基聚苯乙烯支持物(ABI)上合成寡核苷酸(26mer)(也见图1)将含0.2mmol氨基甲基聚苯乙烯(19mmol/g)的盒子置于ABI 394 DNA合成仪上，并进行3次连续的T amidite偶联。继这些偶联之后单次添加二甲硅烷氧基dG amidite以获得接头和寡核苷酸合成的起点。序列的其余部分根据标准操作合成。在固相支持物上合成的产物由浓氨水用三苯甲基-存在(trityl-on)的方法处理，但在这种情况下，将固相进行进一步操作而不是氨水洗涤。
将支持物转移到Soersted管中，并由浓氨水于55℃处理12小时。离心之后，将氨水上清与以前的氨水洗涤物合并，并在反相HPLC上分析，以显示所有由无嘌呤位点的碱基切割产生的较短含三苯甲基片段的存在。残留支持物通过用乙腈洗涤干燥，并由氟化四丁铵(0.2ml，1M溶于THF中)于室温下处理2小时。挥发性物质在真空中蒸发，并向残留悬液中添加结合缓冲液(1M NaCl+溶于水的5％DMF)(1.0ml)。将清亮上清施加到由130mg疏水聚苯乙烯基支持物制备的柱上，并用由20％乙腈和0.1M醋酸三乙铵(TEAA)组成的缓冲液洗脱缺乏三苯甲基功能元件的残留片段，以产生保留在柱上的单一全长产物，如通过HPLC分析所指示的那样。向柱中通入空气，以除去痕量的水，之后继之以纯乙腈(2×1.0ml)以沉淀柱上存在的物质。过量乙腈通过气流除去，并添加由溶于二氯甲烷的2％三氯乙酸(TCA)组成的去三苯甲基化混合物，导致柱上立即形成橙色条带。这种切割的DMTr阳离子条带从柱上迅速洗脱出，从而全部的切割和去除操作在少于2分钟之内结束。含残留酸的柱用纯乙腈洗涤，干燥，并利用含0.1M TEAA的40％乙腈洗脱出最终的纯产物。或者，干柱可由纯水洗涤，然后用溶于水的50％乙腈洗脱。后一种方法产生不含过量盐的寡核苷酸。
实施例2-MMTr基团自5′-氨基衍生化的寡核苷酸的去除根据合成寡核苷酸的标准操作制备含MMTr-NH-C5功能元件的寡核苷酸。基本上如实施例1中所述对去保护的物质进行柱纯化和在柱(on-cartridge)三苯甲基去除，但使用稍微更长的时间进行三苯甲基去除(也见图2)。黄色MMTr阳离子在4分钟内从柱上除去，这对于产物的定量去三苯甲基化是足够的时间，就如从另外单独的HPLC分析中所看到的那样。
在类似实验中，但使用的是2％三氟乙酸水溶液(TFA)，发现在相同时间下少于10％的产物能够被去三苯甲基化。
实施例3-用于纯化具有两个分离功能元件的分子的双在柱寡核苷酸去保护在含有经由简单的酯键而连接于支持物的胸苷残基的标准CPG支持物上构建寡核苷酸。对该起始残基进行3次连续的疏水构件偶联以及二甲硅烷氧基dG amidite的单次偶联。本实验中所用的疏水构件为1，12-十二烷二醇的亚磷酰胺衍生物(商业上可由Glen Research获得)。寡核苷酸的其余部分含标准核苷酸，获得30-mer(AG)15、71-mer(AG)35T、91-mer(AG)45T或111-mer(AG)55T。所述三苯甲基-存在合成的物质用氨处理，并且部分去保护的寡核苷酸在其自支持物上切割后收集在氨中。于55℃加热12小时，这除去所有碱不稳定保护基，产生含四大组化合物的混合物1)含5′DMTr和3′-疏水功能元件两者的全长寡核苷酸，2)截短片段和具有3′-疏水成分的脱嘌呤寡核苷酸的3′-部分，3)脱嘌呤和切割的寡核苷酸的去三苯甲基化片段，和4)作为合成物质双脱嘌呤/切割的结果形成的缺乏任何疏水功能元件的片段。将上述混合物施加到聚苯乙烯柱上，并用35％乙腈+0.1M TEAA洗出属于组3和组4的物质，然后用水洗涤柱，风干，并用乙腈沉淀吸附的寡核苷酸，继之以纯四氢呋喃(THF)的单次洗涤。然后使用溶于THF(0.4ml)的1M TBAF，通过于室温下进行2小时的二甲硅烷氧基功能元件的在柱切割，释放疏水性3′分离功能元件。柱随后用如下步骤处理a)THF、b)乙腈、c)风干、d)水、e)20％乙腈+0.1M TEAA、f)水、g)风干和h)纯乙腈。在此阶段，柱上仅含沉淀的三苯甲基化的全长组分，其由2％TAC去三苯甲基化，并最终如实施例1所述洗脱。分离和蒸发的物质通过反相HPLC和CE分析。图3提供了柱纯化的寡核苷酸的代表性CE分析。
实施例4-双标记分子探针的合成和分离1)由DABCYL-NHS酯(琥珀酰亚胺酯)(Molecular Probes)和2-氨基-1，3-丙二醇(Aldrich)起始制备含DABCYL(猝灭剂)成分、DMTr-O可延伸部件和亚磷酰胺功能元件的三功能构件(图4)。分离的酰氨基1，3-二醇根据标准文献操作三苯甲基化和亚磷酸化(phosphitylated)。功能上相同的构件可购自例如Chem Genes公司。
2a)十八烷氧基苯基溴由十八烷基溴和4-溴苯酚根据公开的操作获得。该化合物通过在高真空下蒸馏纯化。
2b)十八烷氧基三苯基甲烷(C18 Tr-OH)在Grignard操作中由十八烷氧基苯基溴和在无水THF中的镁起始制备。向该金属有机化合物中添加二苯甲酮，并且产物用2M HCl水解。对经过处理的反应混合物干燥、蒸发，并从甲苯中结晶纯产物。通过用过量乙酰氯处理将三苯甲基醇转化为三苯甲基氯化物。
2c)1-氨基-戊醇-5用三甲基氯硅烷在吡啶中硅烷化，并用获得的C18 Tr氯化物三苯甲基化以形成C18 Tr-NH-C5-OH。分离物随后亚磷酸化以形成构件(图4)，用于引入具有增强的疏水性的分离功能元件。上述操作类似于商业上可获得的MMTr-NH-衍生物的合成进行。
3)氨基甲基聚苯乙烯支持物与三个标准胸苷残基、接着与一个二甲硅烷氧基修饰的胸苷构件反应。分子信标的合成通过猝灭剂amidite的单次偶联起始，接着是在每端具有彼此互补的6个碱基的38-mer DNA探针的合成。合成通过添加荧光团单元(CY3，AmershamBiosciences)和作为分离功能元件的C18 Tr衍生物完成。合成的物质通过氨水去保护，并且固相支持物用1∶1的乙腈/水洗涤若干次，以除去所有脱嘌呤和切割的分子。残留的物质如上文所述从支持物上切割，并施加到分离柱上。利用40％乙腈+0.1M TEAA的彻底洗涤除去所有痕量的截短序列和脱嘌呤序列的3′-端部分。残留的物质如实施例1所述在柱上沉淀并去三苯甲基化。最终洗脱的物质的纯度在HPLC和CE两者上测试，其仅仅显示双标记全长分子信标的存在。
实施例5-在柱寡核苷酸衍生化在5′-端由MMTr-NH-C5-基团标记的26-mer寡核苷酸如实施例2所述在柱上合成、纯化并去三苯甲基化。不过，并不洗脱产物，取而代之，所述乙腈洗涤过的、沉淀有5′氨基寡核苷酸的柱用过量溶于由乙腈∶DMF∶吡啶7∶2∶1组成的混合物中的异硫氰酸荧光素于室温下处理6小时。未反应的试剂利用相同组成的溶剂洗掉，之后用乙腈洗涤并风干。最终洗脱的产物通过HPLC分析，以证明起始物质向5′荧光素标记产物的转化。
其它实施方案应当理解尽管本发明已结合其详细内容进行了说明，前述说明旨在举例说明，而并非限制本发明的范围，它是由所附权利要求的范围限定的。其它方面、有利之处以及修饰落在如下权利要求的范围之内。
固相上的寡核苷酸↓在机器上氨水处理→↓溶于THF的TBAF处理60分钟↓氨水55摄氏度12小时↓将全部稀释混合物施加到RP 18柱上→↓洗出截短的寡核苷酸片段→↓残留物的固相去三苯甲基化↓纯全长寡核苷酸的洗脱→ 1)将粗反应混合物施加到RP C18柱上2)用20％乙腈洗涤3)用水洗涤4)用空气冲洗5)用100％丙酮洗涤6)溶于二氯甲烷的TCA(2％)→洗脱MMTr阳离于7)用100％乙腈洗涤8)用空气冲洗9)用40％乙腈洗脱全长寡核苷酸
权利要求
1.用于寡核苷酸去保护的方法，所述方法包括a)提供多数个寡核苷酸，所述多数个寡核苷酸包含受保护寡核苷酸，其中(i)所述受保护寡核苷酸的5′端与疏水分离功能元件相连或者(ii)每个所述受保护寡核苷酸都与一对疏水分离功能元件相连，其中所述疏水分离功能元件对中一员较之于该对中的另一员疏水性较小；b)利用有机溶剂将所述多数个寡核苷酸沉淀到疏水固相支持物上，以产生非共价固定的寡核苷酸；和c)利用溶于有机溶剂的试剂，通过(i)从所述固定寡核苷酸中选择性除去所述5′分离功能元件或者(ii)从所述固定寡核苷酸中顺序除去所述疏水分离功能元件对，来对所述固定寡核苷酸进行去保护。
2.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括，在步骤b)之前，将所述多数个寡核苷酸吸附到疏水支持物上；并洗脱(i)缺乏所述5′疏水分离功能元件的寡核苷酸或者(ii)缺乏任何保护基团的寡核苷酸以及仅含所述疏水分离功能元件对中疏水性较小的分离功能元件的寡核苷酸。
3.权利要求1的方法，所述方法进一步包括洗脱所述去保护的寡核苷酸。
4.权利要求1的方法，其中所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮或异丙醇。
5.权利要求1的方法，其中所述沉淀步骤包括预干燥位于所述疏水固相支持物上的所述多数个寡核苷酸，然后用所述有机溶剂洗涤所述疏水固相支持物。
6.权利要求1的方法，其中所述5′疏水分离功能元件为三苯甲基部分、疏水缩醛或硫缩醛基团。
7.权利要求6的方法，其中所述三苯甲基部分利用酸的非水溶液选择性除去。
8.权利要求7的方法，其中所述酸的非水溶液为溶于二氯甲烷的2％三氯乙酸。
9.权利要求1的方法，其中所述疏水固相支持物以柱或歧管的形式提供，所述歧管含多数个柱。
10.权利要求1的方法，其中所述疏水固相支持物是基于聚苯乙烯、炭、石墨或硅石的。
11.权利要求6的方法，其中所述三苯甲基部分为二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、甲呱啶或单甲氧基三苯甲基部分。
12.权利要求6的方法，其中所述三苯甲基部分从由4-己氧基甲氧基三苯甲基、4-癸氧基甲氧基三苯甲基、4-十六烷氧基甲氧基三苯甲基、4-十八烷氧基苯呫吨基、4-4′-二-己氧基甲氧基三苯甲基、4-4′-二-癸氧基甲氧基三苯甲基、4-4′-二-十六烷氧基甲氧基三苯甲基、4-十八烷氧基三苯甲基、4-十六烷氧基三苯甲基、4-癸氧基三苯甲基和4-己氧基三苯甲基部分组成的组中选择。
13.权利要求1的方法，其中所述疏水分离功能元件对的一员为直链烷基、支链烷基、芳基烷基或芳基，其通过接头与寡核苷酸相连，所述接头可在不除去所述疏水分离功能元件对中另一员的条件下去除。
14.权利要求13的方法，其中所述接头为甲硅烷氧基或二甲硅烷氧基功能元件。
15.权利要求1的方法，其中所述多数个寡核苷酸之内包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
16.权利要求15的方法，其中寡核苷酸包含非标准主链。
17.权利要求16的方法，其中所述非标准主链为硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或磷酰胺。
18.权利要求15的方法，其中所述寡核苷酸为锁核酸(LNA)。
19.权利要求15的方法，其中寡核苷酸含有与官能团相连的一个或多个核苷酸。
20.权利要求19的方法，其中所述官能团为氨基、硫醇、磷酸、醛、嵌入剂、猝灭剂或荧光团。
21.权利要求19的方法，其中所述官能团位于所述寡核苷酸的任一端。
22.权利要求19的方法，其中所述官能团位于所述寡核苷酸的两端。
23.权利要求19的方法，其中所述官能团在各端是不同的。
24.权利要求19的方法，其中所述5′分离功能元件或者所述疏水分离功能元件对的一员连接在所述官能团上。
25.权利要求19的方法，其中所述疏水分离功能元件对的一员连接在接头上，而所述接头连接在所述官能团上。
26.权利要求1的方法，所述方法进一步包括使用非水条件衍生化所述固定寡核苷酸。
27.权利要求26的方法，其中所述衍生化步骤包括将荧光团掺入到所述纯化的寡核苷酸中。
28.权利要求26的方法，所述方法进一步包括洗脱所述衍生化寡核苷酸。
全文摘要
本发明提供了用于寡核苷酸去保护的方法，包括(a)提供受保护寡核苷酸，其中(i)5′端与疏水分离功能元件(如二甲氧基三苯甲基)相连或者(ii)两端与一对疏水分离功能元件相连，该对中一员较之于另一个疏水性较小(如为烷基、芳基烷基或芳基甲硅烷氧基)；(b)利用有机溶剂将寡核苷酸沉淀(如通过干燥)到疏水支持物(如疏水聚苯乙烯基支持物)上，从而非共价固定所述寡核苷酸并使其不溶；和(c)利用溶于有机溶剂的试剂(如溶于二氯甲烷的2％三氯乙酸)对寡核苷酸进行去保护(即除去疏水分离功能元件)。
文档编号C07H21/00GK1678618SQ03820591
公开日2005年10月5日 申请日期2003年8月28日 优先权日2002年8月28日
发明者M·科维亚特科斯基 申请人:Quia技术股份有限公司