专利名称：对大肠杆菌o61的o－抗原特异的核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及大肠杆菌O61(Escherichia coli O61)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O61中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O61并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
背景技术：
位于大肠杆菌表面的脂多糖是大肠杆菌致病的诱因，而O-抗原是脂多糖最外层结构，是免疫系统识别的目标和噬菌体吸附的位点。O-抗原的缺失会造成许多病原体的血清敏感，或者严重削弱病原体的毒力[Frank etal(1987)“The function of antibody and complement in the lysis ofbacteria”.Rev Infect Dis 1771750-1753.Pluschke G et al“Role of thecapsule and the O-antigen in resistance of O18K1 Escherichia coli tocomplement-mediated king”.J Bacteriol 42907-913]。大肠杆菌是一个种，种内的菌株一般通过O-抗原和H-抗原(有时通过K-抗原)来鉴定。其中O-抗原具有高度多样性，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，O-抗原的变化可能是大肠杆菌的起源和维持其多样性的主要原因[Reeves，P.R(1992)“Variation in antigens ，niche specific selection and bacterialpopulations”.FEMS Microbiol.Lett，100509-516]。
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过o-抗原转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)“Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111”.Gene 16417-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。
发明内容
本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于o-抗原转运酶基因、聚合酶基因及糖基转移酶基因的特异的核苷酸。
本发明的另一个目的是提供了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的次一目的是提供了构成大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的基因转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因；糖合成路径基因，包括orf1、orf2、nnaA、nnaB、wckD、orf7、nnaC、orf9。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O61的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的源于编码转运酶的基因和聚合酶的基因的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O61的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O61的O-抗原也是高度特异的。
本发明的还一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定大肠杆菌O61的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O61。
本发明的再一目的是提供了分离大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQID NO1所示的分离的核苷酸，全长15461个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其包括命名为orf1，orf2，nnaA，nnaB，wckD，orf6，orf7，nnaC，orf9，orf10，wzx，orf12，wzy，orf14的14个基因组成，它们都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特异性的基因包括转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。其中所述的转运酶基因是SEQ IDNO1中的9915至11141碱基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO1中的12068至13225碱基的核苷酸；所述的orf6基因是SEQ ID NO1中的5878至6936碱基的核苷酸；orf10基因是SEQ ID NO1中的9368至9922碱基的核苷酸；orf12基因是SEQ ID NO1中的11122至12075碱基的核苷酸；orf14是SEQ ID NO1中的13246至13962碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其还包括源于所述的wzx基因或wzy基因或糖基转移酶基因的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。
前述的对大肠杆菌O61的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的10333至10350碱基的核苷酸和10869至10886碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10020至10037碱基的核苷酸和10980至10997碱基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的12267至12284碱基的核苷酸和12870至12887碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的12536至12553碱基的核苷酸和12874至12891碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O61型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。
前述的对大肠杆菌O61型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O61型的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。
前述的对大肠杆菌O61型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌的应用。
前述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤(1)基因组的提取在培养基中培养大肠杆菌O61型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O61型中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O61型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O61型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；(6)特异基因的筛选针对大肠杆菌O61型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O61型的O-抗原的高度特异性；(7)引物灵敏度的检测培养大肠杆菌O61，细菌计数后分别将5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O61的灵敏度。
前述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤(1)基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O61，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O61中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O61的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAAGAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCGCGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的ExpandLong Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟，然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾，此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证1)对大肠杆菌O61的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到14个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因的筛选针对大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，所有引物都在大肠杆菌O61中得到阳性结果，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O61及其O-抗原都是高度特异的。
(7)引物灵敏度的检测购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O61的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作106和107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μl上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO1中的10333至10350碱基的核苷酸和10869至10886碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10020至10037碱基的核苷酸和10980至10997碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的12267至12284碱基的核苷酸和12870至12887碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的12536至12553碱基的核苷酸和12874至12891碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反应条件为95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×103，5×102，5×101，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O61的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全长15461个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的结构，如表3所述，它其包括命名为orf1，orf2，nnaA，nnaB，wckD，orf6，orf7，nnaC，orf9，orf10，wzx，orf12，wzy，orf14的14个基因组成都位于galF基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括orf1、orf2、nnaA、nnaB、wckD、orf7、nnaC、orf9基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是特异的，而本发明涉及到的o-抗原转运酶基因、聚合酶基因和糖基转移酶基因对大肠杆菌O61的O-抗原是特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因和wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸和糖基转移酶基因包括orf6、orf10、orf12、orf14基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中源于大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸对。在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以大肠杆菌O61为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物。所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O61及它们的O-抗原是高度特异的。
所述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸的分离和鉴定方法包括下述步骤1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O61中的O-抗原基因簇；3)O-抗原基因簇文库的构建；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析，最终获得O-抗原基因簇的结构；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所述，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶的基因、编码聚合酶的基因和编码糖基转移酶基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。尤其是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的9915至11141碱基)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的12068至13225碱基)内的寡核苷酸对大肠杆菌O61都是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于糖基转移酶基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于转运酶基因、源于聚合酶基因和源于糖基转移酶基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O61。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明者考虑到以下情况当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码转运酶基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和编码糖基转移酶基因包括orf2、orf4、orf7、orf9基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O61表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O61。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码转运酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O61。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因及wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因包括orf6、orf10、orf12、orf14基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O61的O-抗原，并成为有用的疫苗。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。
实施例1基因组的提取。
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O61，离心收集细胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例2通过PCR扩增大肠杆菌O61中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O61的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATTGTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。
实施例3构建O-抗原基因簇文库。
首先是连接产物的获得用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃ 250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃ 4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇文库。
实施例4对文库中的克隆测序。
从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再通过反向测序及将有些序列测通得到，最后获得O-抗原基因簇的所有序列。
实施例5核苷酸序列的拼接及分析。
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证1)对大肠杆菌O61的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到14个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1与Vibrio vulnificus CMCP6的变位酶在396个氨基酸中有86％的相同性，91％的相似性；高度的相同性表明orf1也是一个编码变位酶的基因，暂命名为orf1。Orf2与Vibrio parahaemolyticus的氨基转移酶在380个氨基酸中有73％的相同性，86％的相似性，高度的相同性表明orf2也是一个编码氨基转移酶的基因，暂命名为orf2。orf3与Vibrio parahaemolyticus的NeuC在386个氨基酸中有77％的相同性，88％的相似性，高度的相同性表明orf3也一个编码NeuC的基因，它是变位酶，将orf3命名为nnaA。Orf4与Vibrio parahaemolyticus的NeuB在357个氨基酸中有77％的相同性，84％的相似性，高度的相同性表明orf4也是一个编码NeuB的基因，将orf4命名为nnaB。Orf5与Vibrio parahaemolyticus的NeuD在195个氨基酸中有45％的相同性，67％的相似性，较高的相同性表明orf5也编码一个NeuD，因此将orf5命名为wckD。orf6与Vibrioparahaemolyticus的dNTP-转移酶在351个氨基酸中有68％的相同性，84％的相似性，较高的相同性表明orf6也编码一个dNTP-转移酶，在genbank中寻找保守的功能域，发现orf6与核苷酸转移酶PF00483的E值为3.3×e-30，因此将orf6暂命名为orf6。Orf7与Pseudomona saeruginosa的氧化还原酶在336个氨基酸中有35％的相同性，59％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现Orf7与氧化还原酶家族PF01408的E值为4×e-05，因此将orf7暂命名为orf7。orf8与Pseudomonas aeruginosa的NeuA在223个氨基酸中有55％的相同性，70％的相似性，较高的相同性表明orf8也是一个编码NeuA的基因，命名为nnaC。Orf9与Vibrio parahaemolyticus的脱氢酶在253个氨基酸中有64％的相同性，80％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现Orf9与脱氢酶家族PF00106的E值为2.8×e-08，将orf9暂命名为orf9。Orf10与Methanosarcina acetivorans C2A的乙酰基转移酶在174个氨基酸中有32％的相同性，54％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现Orf10与细菌的己肽转移酶PF00132的E值为6.3×e-11，将orf10暂命名为orf10。Orf11与Yersinia enterocolitica type O8的O-抗原转运酶在398个氨基酸的序列中有24％的相同性，44％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.et al(1984).Analysis ofmembrane and surface protein sequences with the hydrophobic momentplot.J.Mol.Biol.179125-142]发现orf11有12个潜在的穿膜区，它与许多Wzx蛋白相似，而且在Wzx蛋白的氨基端有一个大约40个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf11是wzx基因，命名为wzx。Orf12与Bacillussubtilis的糖磷酸转移酶在206个氨基酸中有26％的相同性，43％的相似性，将Orf12暂命名为Orf12。blast比较表明orf13与许多Wzy蛋白相似，例如，和Escherichia coli O157H7在304个氨基酸中有26％的相同性，44％相似性。另外通过Eisenberg算法得知orf13有10个潜在的穿膜区，与其他的O-抗原聚合酶有相似的二级结构，有一个大的loop，具有典型的O-抗原聚合酶的特征，所以确定orf13是wzy基因，命名为wzy。在genbank中寻找保守的功能域，发现orf14与糖基转移酶家族PF00535的糖基转移酶相似，E值为1.3×e-39，通过进行blast比较发现，orf14与Escherichia coli的糖基转移酶在242个氨基酸中分别有48％的相同性，69％的相似性，说明它们之间有较高的同源性，因此推测orf14也是一个糖基转移酶基因，暂命名为orf14。
实施例6特异基因的筛选针对大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
在表1中列出了大肠杆菌O61的O抗原基因簇的转运酶基因、聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后从166种血清型的大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166种血清型的大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共13组。它们的来源都列于表中。
在第3组中含有大肠杆菌O61的基因组DNA作为阳性对照。第13组中是不含有大肠杆菌O61的基因组DNA，作为阴性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR在95℃预变性2分钟后，95℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第3组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带。所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O61及其O-抗原都是高度特异的。
最后，通过PCR从大肠杆菌O61中筛选到对大肠杆菌O61的O-抗原高度特异的基因wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O61的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O61是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O61，并能鉴定它们的O-抗原。
实施例7引物灵敏度的检测。
购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O61的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作106和107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO1中的10333至10350碱基的核苷酸和10869至10886碱基的核苷酸，SEQ IDNO1中的10020至10037碱基的核苷酸和10980至10997碱基的核苷酸，SEQID NO1中的12267至12284碱基的核苷酸和12870至12887碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的12536至12553碱基的核苷酸和12874至12891碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反应条件为95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×103，5×102，5×101，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O61的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology1993，7239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，2755-59)。所以本发明O61的O抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。
根据本发明的对大肠杆菌O61型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ ID NO1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。
表3是大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的结构，共由14个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅读框的起始密码子有两个ATG和GTG。
SEQ ID NO1序列(SEQUENCE LISTING)<110>天津生物芯片技术有限责任公司<120>对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>15461
<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1attcagctga ctgatgctat tgccgaactg gcgaaaaaac agtccgttga cgccatgctg 60atgaccggcg acagctacga ctgcggtaaa aaaatgggct atatgcaggc gttcgtgaag 120tatggactac gcaacctcaa agaaggggcg aagttccgta aaggtattga gaagctgtta 180agcgaataat gaaaatctga ccgaatgtaa cggttgataa gaaaattata acggcggtga 240agattcgtgg cgaaagtaat ttgttgcgaa tattcctgcc gttattttat ataaacaatc 300agaataacaa cgagttagca ataggatttt agtcaaagtt ttccaggatt ttccttgttt 360ccatagctga ttggtaagac aattagtgtt tgaatttttc aggtttagcg cgagtgtgta 420acgctcgtca catcgtaggc atgtacgcag tgctctggta gctataaagc caggggcggt 480agcgtgtgca aatctgagtt aaggcagcga ttgtgggggc tataggtatg tatagctgct 540cgttctgtag atatgcttga accagagcag cttctgactc aggcatgtcg tcgcaataat 600atttaatcaa cgggatcgta aaatgggtaa tattctccaa cttattggac gcaataaagc 660attattcggt gatgatgtat ctgaaaatga agaagaatta caaagaattg tcgctacatc 720ccgttttttg gttctgggcg gtgcaggctc tatcgggcag gctgttacaa aagagatatt 780taaacgtaat cctcaaaagc tccatgttgt cgatattagt gaaaataata tggttgagct 840ggtacgagat atacgtagct ctttcggtta tattgatggg gatttccaaa cctttgctct 900ggatattggt tcggttgagt atgacgcatt tatcaaagct gatggaaaat acgattatgt 960cctgaatttg tcagcgctta agcatgttcg cagtgaaaaa gatccgttta ctttaatgcg1020tatgattgaa gtaaacatcc ttaatacaga gaaaactatt caacaatcta ttgcagccgg1080tgttaagaaa tttttctgtg tttctaccga taaagccgca aaccctgtga atatgatggg1140ggcttccaag cgtattatgg aaatgttcct gatgcgcaag agcgaagaga tcgctatttc1200tactgctcgt tttgcaaatg tagcattttc agatggctca ctgcttcatg gttttaatca1260gcgactgcag aaacaacagc caattgtggc tcctcacgat atcaagcgct attttgtgac1320tccacaggaa tctggtgagt tgtgtttgat gtcctgtatc ttcggcgaga atcgtgacat1380ctttttcccc aaattaaatg aggcactgca tcttatctcc tttgccgata tcgcagtttt1440gtatttgaaa cagcgtggct acgaacctca tctctgtgag acggaagatg aggctcgtgt1500gttggcgaaa actttgccag cgcagggaaa gtggccatgc cttttcacat ccagcgacac1560cactggtgaa aaagatttcg aggaattttt taccgacaaa gaggtgcttg atatgaagcg1620ctttattaat ctcggcatta tcaagaatga tccactttac gatcccatgc ttttagacca1680ttttaaagaa aaaattgagc acatgagggc gtcgctggag tggagtaaaa aagacattgt1740aaaactgttt tttgaaatga ttccagattt tgggcataaa gaaacaggta aatatcttga1800cagtaaaatg taagtaggcc tcctcgtatg aatatcaatt caattatcga atttgtccga1860gacgtataca aaacgaatga gtttattcct ttgcatgcgc cagtttttga tggcaatgaa1920aaaaaatatg tattagatac acttgaaagc accttcgttt caagcgtagg caaatatgtc1980gatgactttg ggcgcaagat ggaggcttat actggaacgg cgagagctgt tgcgacagta2040aatggtactg cggcattaag tgctgcgctg tatctggctg gggtgaagcg cggcgactta2100gtggttaccc aagcgctgac ttttgttgca acctgtaatg ccctttatca tttgggggct2160gaacctgtat ttatagatgt ctcgcctgtc agtctcggtc tttgccctgt tgcgctggat2220agctggcttt ctgaaaatac cgagctgact gagcatgggt gccagcatcg tacaacacat2280cagattgttc gcgctgtggt gccaatgcac acttttggtc atcctgttga aatggatgaa2340cttattgcgg tctgcaagaa gtggcgaatt gttctggtag aagatgcggc agaaagcttg2400ggttcctttt ataaggggct gcatactggt acgcttggtg agtatggggc tctgagtttt2460aatggaaata agattatcac tactggtggt ggtggtatgg ttttttgtcg cgcgtctgag2520gaaggtgtgc gagcgaagca tgtcaccaca accgccaagg ttccacatcc atatgagttt2580
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1、野生型大肠杆菌O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，IMVSaO19ab，O20，O21，O22，O23，O242、野生型大肠杆菌O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，IMVSaO36，O37，O38，O40，O41，O42，O433、野生型大肠杆菌O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，IMVSaO57，O58，O60，O61，O62，O534、野生型大肠杆菌O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，IMVSaO79，O80，O81，O82，O83，O685、野生型大肠杆菌O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，IMVSaO101，O102，O103，O104，O105，O106，O97，6、野生型大肠杆菌O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113， IMVSaO115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O1177、野生型大肠杆菌O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137， IMVSaO138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O1408、野生型大肠杆菌O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158， IMVSaO159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153 b9、野生型大肠杆菌O168，O169，O170，O171，O172，O173， c痢疾志贺氏菌 D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13 d10、鲍氏志贺氏菌 B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， dB16，B17，B1811、福氏志贺氏菌 F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v4)，F5(v7)，F6， dDS，DR12、野生型大肠杆菌 O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，IMVSaO124，O167，O162，O121，O127，O149，O11913、野生型大肠杆菌 去除大肠杆菌O61的第3组菌为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为阴性对照a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australiab.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVSd.中国预防医学科学院流行病学研究所表3是大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的结构表 orf1 orf2nnaAnnaB wckD orf6 orf7 nnaC orf9orf10 wzx orfl2 wzy orf141kb表4是大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的基因的位置表ATTCAGCTGA CTGATGCTAT TGCCGAACTG GCGAAAAAAC AGTCCGTTGA CGCCATGCTG 60ATGACCGGCG ACAGCTACGA CTGCGGTAAA AAAATGGGCT ATATGCAGGC GTTCGTGAAG120TATGGACTAC GCAACCTCAA AGAAGGGGCG AAGTTCCGTA AAGGTATTGA GAAGCTGTTA180AGCGAATAAT GAAAATCTGA CCGAATGTAA CGGTTGATAA GAAAATTATA ACGGCGGTGA240
AGATTCGTGG CGAAAGTAAT TTGTTGCGAA TATTCCTGCC GTTATTTTAT ATAAACAATC 300AGAATAACAA CGAGTTAGCA ATAGGATTTT AGTCAAAGTT TTCCAGGATT TTCCTTGTTT 360CCATAGCTGA TTGGTAAGAC AATTAGTGTT TGAATTTTTC AGGTTTAGCG CGAGTGTGTA 420ACGCTCGTCA CATCGTAGGC ATGTACGCAG TGCTCTGGTA GCTATAAAGC CAGGGGCGGT 480AGCGTGTGCA AATCTGAGTT AAGGCAGCGA TTGTGGGGGC TATAGGTATG TATAGCTGCT 540CGTTCTGTAG ATATGCTTGA ACCAGAGCAG CTTCTGACTC AGGCATGTCG TCGCAATAAT 600Orf1的起始ATTTAATCAA CGGGATCGTA AAATGGGTAA TATTCTCCAA CTTATTGGAC GCAATAAAGC 660ATTATTCGGT GATGATGTAT CTGAAAATGA AGAAGAATTA CAAAGAATTG TCGCTACATC 720CCGTTTTTTG GTTCTGGGCG GTGCAGGCTC TATCGGGCAG GCTGTTACAA AAGAGATATT 780TAAACGTAAT CCTCAAAAGC TCCATGTTGT CGATATTAGT GAAAATAATA TGGTTGAGCT 840GGTACGAGAT ATACGTAGCT CTTTCGGTTA TATTGATGGG GATTTCCAAA CCTTTGCTCT 900GGATATTGGT TCGGTTGAGT ATGACGCATT TATCAAAGCT GATGGAAAAT ACGATTATGT 960CCTGAATTTG TCAGCGCTTA AGCATGTTCG CAGTGAAAAA GATCCGTTTA CTTTAATGCG1020TATGATTGAA GTAAACATCC TTAATACAGA GAAAACTATT CAACAATCTA TTGCAGCCGG1080TGTTAAGAAA TTTTTCTGTG TTTCTACCGA TAAAGCCGCA AACCCTGTGA ATATGATGGG1140GGCTTCCAAG CGTATTATGG AAATGTTCCT GATGCGCAAG AGCGAAGAGA TCGCTATTTC1200TACTGCTCGT TTTGCAAATG TAGCATTTTC AGATGGCTCA CTGCTTCATG GTTTTAATCA1260GCGACTGCAG AAACAACAGC CAATTGTGGC TCCTCACGAT ATCAAGCGCT ATTTTGTGAC1320TCCACAGGAA TCTGGTGAGT TGTGTTTGAT GTCCTGTATC TTCGGCGAGA ATCGTGACAT1380CTTTTTCCCC AAATTAAATG AGGCACTGCA TCTTATCTCC TTTGCCGATA TCGCAGTTTT1440GTATTTGAAA CAGCGTGGCT ACGAACCTCA TCTCTGTGAG ACGGAAGATG AGGCTCGTGT1500GTTGGCGAAA ACTTTGCCAG CGCAGGGAAA GTGGCCATGC CTTTTCACAT CCAGCGACAC1560CACTGGTGAA AAAGATTTCG AGGAATTTTT TACCGACAAA GAGGTGCTTG ATATGAAGCG1620CTTTATTAAT CTCGGCATTA TCAAGAATGA TCCACTTTAC GATCCCATGC TTTTAGACCA1680TTTTAAAGAA AAAATTGAGC ACATGAGGGC GTCGCTGGAG TGGAGTAAAA AAGACATTGT1740AAAACTGTTT TTTGAAATGA TTCCAGATTT TGGGCATAAA GAAACAGGTA AATATCTTGA1800Orf1的终止 Orf2的起始CAGTAAAATGTAAGTAGGCC TCCTCGTATGAATATCAATT CAATTATCGA ATTTGTCCGA 1860GACGTATACA AAACGAATGA GTTTATTCCT TTGCATGCGC CAGTTTTTGA TGGCAATGAA1920AAAAAATATG TATTAGATAC ACTTGAAAGC ACCTTCGTTT CAAGCGTAGG CAAATATGTC1980GATGACTTTG GGCGCAAGAT GGAGGCTTAT ACTGGAACGG CGAGAGCTGT TGCGACAGTA2040AATGGTACTG CGGCATTAAG TGCTGCGCTG TATCTGGCTG GGGTGAAGCG CGGCGACTTA2100GTGGTTACCC AAGCGCTGAC TTTTGTTGCA ACCTGTAATG CCCTTTATCA TTTGGGGGCT2160GAACCTGTAT TTATAGATGT CTCGCCTGTC AGTCTCGGTC TTTGCCCTGT TGCGCTGGAT2220AGCTGGCTTT CTGAAAATAC CGAGCTGACT GAGCATGGGT GCCAGCATCG TACAACACAT2280CAGATTGTTC GCGCTGTGGT GCCAATGCAC ACTTTTGGTC ATCCTGTTGA AATGGATGAA2340CTTATTGCGG TCTGCAAGAA GTGGCGAATT GTTCTGGTAG AAGATGCGGC AGAAAGCTTG2400GGTTCCTTTT ATAAGGGGCT GCATACTGGT ACGCTTGGTG AGTATGGGGC TCTGAGTTTT2460AATGGAAATA AGATTATCAC TACTGGTGGT GGTGGTATGG TTTTTTGTCG CGCGTCTGAG2520GAAGGTGTGC GAGCGAAGCA TGTCACCACA ACCGCCAAGG TTCCACATCC ATATGAGTTT2580TACCACGATG AGCCTGGTTT TAACTACCGT ATGCCCAACC TGAATGCTGC TCTGGGATGT2640GGACAAATGG AACGATTGGA TATGTTTTTA AAGCAAAAAC GCACGCTTGC CCAGCGTTAT2700CAAACATTCT TCGAAGGGTC TGAGTTTAAA TTCGTTAAAG AACCTCAATA TGCTCAGTCT2760AATTACTGGC TTAATGCCGT AATCTGTGAA AACTTGGATT CACGTGACGC TATTTTGGCA2820CAAATGAATG AAGCAAAAGT GATGACACGC CCGATATGGA AACTGATGCA CCGCTTACCA2880
ATGTTTGAGC ACGCAATGCG GGATGATCTT AAAAACTCTG AGCAAATTGA GGCTCGCTTG2940Orf2的终止 Orf3的起始GTCAACTTGC CTAGCTCTCC TGTGGAATAAGTGCGATGAC AACAACAACA CGCAAGGTCG3000CAGTTTTTAC CGGAACTCGA GCAGAATATG GATTACTCTA TTGGTTAATG AAGGACATCC3060AGAGCGACGA GGAGCTGCAA CTGCAACTGC TCGTCAGTGG TATGCACCTT TCCCCTGAAT3120TTGGCAGTAC ATGGCAACAG ATCGAGCAGG ATGGTTTTTC AATTGATGAG AAAATTGAAA3180TTTTGCTCTC CTCTGATTCT CCGGTCGGTA TAGCAAAAAG CATGGGGTTG GGGGTTCTGG3240GGTTTGCTGA TGCATTATCC CGGCTGAAAC CTGATGTTTT GGTCATTCTT GGCGATCGTT3300TTGAAGCTCT TGCGGCGGCG CAAACCGCGA TGATTCTTCG TATTCCTGTT TTCCATCTAC3360ATGGCGGTGA AATTACTGAA GGTGCCTACG ATGATGCTAT TAGGCACGCC ATCACGAAAT3420TGAGTTATTT ACACGGTACT TCCACGGAAG AATATAAAAA CCGTGTCGTT CAGTTGGGTG3480AAAATCCGGC TCGTGTTACT AATGTGGGTG CTATTGGGTT AGAGCATCTG AAGCGTAGCA3540AGTTTATGAC GGTCGAAGAG TTATCAACAT CATTGAATTT TTCGCTAAAA AAGCCGTATG3600TAGTTGTCAC ATATCATCCG GTTACTTTAG GTGATGAGCC TGCTGAGGCG AGCTTTACAG3660CATTGCTGGA CGCGCTTGAT AAATTTCCCG AGCTTCAGGT TATCCTGACC TACCCGAATG3720CGGATGATGG CGGCAGAAAA ATTATTCCTT TACTTGAAGC TTATGCTGCT AAATCACCTG3780AACGCGTCAA AGCTATCCCG TCACTTGGAC AGATGCGTTA TCTAAGTGCG GTTAAATATG3840CTTCAGCGGT GGTGGGAAAC TCTTCCAGCG GCATAATTGA GGTGCCTGCT CTCGACGTTC3900CTACGGTAAA TATTGGCGTG CGTCAAAAAG GGCGTATTGC CGCGCAAAGC GTACTCAATT3960GTGATGCTAC AACGGAATCT ATCACTGCTG CACTAACGAG TGCGATTTCG CGAAGTTACA4020TAAGGGAAGG AGAAAAAATA TCCAATCCTT ATGGGCAAGG GAATGCGAGT GCTAAGATCA4080Orf3的终止TTGAGATGAT CAAATCCATG AATTTTGTAC CGAGCAAGAC ATTCTACGAC ATTAAGTGAA 4140Orf4的起始ATTGTATGAC GCTTATTATT GCTGAAGCCG GTGTTAACCA CAACGGCGAC GAAAAACTGG 4200CTTTTAAACT TGTTGATGCT GCTCATAAAG CAGGTGCTGA TATCGTCAAA TTTCAGACGT4260TCAAGGCGAA AAACTTGGTA ACAGCTGAAG CAGTACAGGC GGACTATCAG GTTGCGAACA4320CTAAGAAGCA AGAATCACAG TTAGAAATGC TAAGTCGGTT GGAGCTTTCA TGGGAAGCTC4380ACCACAAGCT GGTTAGTTAT TGTAATAAAC TTGGTATCGA ATTCCTTTCA ACCGCCTTTG4440ATTCCGAGAG CTTGGATTTT CTTGTTAATG AGCTTGGCGT CAAAAGGCTA AAGTTACCTT4500CAGGTGAATT GACTAACGCG CCTTTGGTAC TTGAGCATGC GCGCACTGGT TGCGACATTA4560TTGTCTCAAC GGGAATGGCG ACATTGGCTG AGATTGAGGC CGCGTTGGGT GTTATTGCTT4620TCGGATATAC AGCGCCTGAA GAGGCAGTGC CGAGTATTGA AGCTTTTCAG CGTGCGTACT4680CGTCTGAGGT TGGTCAAAAA GCGCTTAAGG AAAAGGTTAT CGTTCTTCAT TGCACTACGG4740AATATCCTGC GCCAGTGGAA GAGATTAATC TACGTGCTAT GGATACGTTG CGTCAGGCGT4800TTGGATTACC TGTGGGGTAT TCCGATCACA GTGAAGGGAT AATGATTCCT GTGGCCGCTG4860TTGCACGTGG TGCGGTTGTG ATCGAAAAAC ACTTCACACT TGATAAAAAC ATGGAAGGAC4920CGGACCACAA AGCATCGCTG GAGCCCGTTG AACTGGAGGC AATGATTGCC GCTATTCATC4980AGATAGAAAA AGCGCTAGGG AATAGCATTA AAGCGCCTAC TGTGTCAGAA ATCAAAAACA5040AGAGTGTTGC GCGAAAAAGC CTAGTTGCTG CAAAAACTAT TATAGCGGGG GAAAGCTTCA5100CATCCGATAA TCTGGCAATA AAGCGCCCTG GTACAGGTAT GTCTCCTTAT TTATATTGGA5160Orf5的起始 Orf4的终止ATTTAATAAA TGAAGTTTCT GAAAATGATT ATTTACCGGG GGAGTTGATT AGTGAATGAT5220AATCTTCAGA GAAAACCACT TGTTATTATT GGTGGGGGAG GGCACGCTAG CGTAATTGTT5280GATATTTTGA AAAGACAGAA GCGAGAGATT GTTGCTATTA TTAGCCCTGA TGATATCACT5340CAGCGAAAGG TATATTCAGG AATTGATGTT TTTTCGAATG ATAATGAAAT CTTTCGTTTC5400
CAACCAAAGG ATATTCGCTT AATTAATGGA ATTGGTGCCT TACCAGACTC GGAAGTTAGG5460TATAAAGTTA ATTTGTACTT TGAAAAAATG GGCTATTGTT TTGAAACAAT TGTAGCTGAT5520AACGCATATG TGTCACCCTT TGCCTTTTTG GAAGAAGGAG TACAGATATT TCCTGGTGCC5580ATAATTCAAC CAGGGACACA TATTGGTGCC CATACTATTA TTAATACCCG TGTAGTCATT5640GAGCATGATG TATCTCTCGG TGCATATAAC GCAATCTCTC CTGGGGCTAT AATATGTGGG5700CAGTGTAAAA CTGAAGAGCG TGTATTCATT GGTGCAGGTG CAATTGTTAT TCAGAATATT5760GAAATCGGAT CAAGAGCCAC AATCATGGCG AACGCACTGG TAGCAGAAAA TATACATCCC5820Orf5的终止Orf6的起始CAACAAAAAG TTTATGCTTC ACGCGGTATA GTCAGATAAT GTTTCAGAAG GTATATAATG5880AATCAGCAAT GGAAAAATGT ATTAATCTCA CCAGATAGCT CGATACTTGA AGCACTCGAA5940ATTATCAATA ACGAAGCATT AAGAGTTGCG CTGGTAGTTA ATGAGAATAA CACGTTATTA6000GGAGTCATTA CCGATGGTGA TATTCGAAGA GGAATTTTGA AAAACCTGCC TCTGACTGCA6060GAAGTACACC AGGTTATGAA TAAAAAACCC GTAACGGCAA GTCCAGTTCT TTCCAAAAAA6120GAACTCAATA ATCTGATGTC ATCGCATGGG ATACTGTCTA TACCAATAGT CGATAAGGGT6180ATCATTGTGG GGCTGGAGAC TATTACAAGC ATCGCTGCAA CGGAAAAATA TGATAATCCT6240GTTTTTATTA TGGCCGGAGG GTTTGGTACT CGTTTGAGAC CACTCACTGA TAATTGCCCT6300AAACCAATGC TTAAAGTAGG TGATAAACCT ATTTTAGAGA CAGTGGTAAG AAGCTTTGTT6360AAAGCAGGGT TTAGTAATTT ATATATATCA ACCCATTTTC TGCCAGATAT GATTCATCAG6420CACTTCGGTG ATGGTGATGC GTTTAATGCA AAAATCACCT ATATACATGA AGAAACTCCC6480TTAGGTACGG GAGGAGCGCT GGGATTGCTT CCTGACTCCT TATCAGATTC TTTGCCACTC6540ATTATGATCA ATGGTGATGT GCTTACCAAT ATTGATTTTG AGCGGTTACT ATCATTTCAT6600AATAATAACA ATGCGGATGC TACAATCTGC GTAAGAAAAT ATGACTACCA GATCCCATAT6660GGTGTTATAA CAGGTAATGG TAATAAAATA GTCAGTATGG TTGAAAAGCC AGTACATCAT6720TTCTTTGTTA ATGCAGGAAT CTATGTTGTT TCTCCCGATA TTTTTAAATC AGTACCCAAA6780AACCATCGAA TTGATATGCC GACGTTACTC GAACAATTTA TGAGTAAGAA TAAAGAGATA6840CTAATGTTCC CGATTCATGA GTATTGGCTT GATATAGGGC GAATAGATGA TTTTAATCGG6900Orf6的终止 Orf7的起始GCACAGGCCG ATATTCATTC TTTAGGGCTG GATTAAAAAT GAAAAAGGTC GCTGTAATCG6960GGTTGGGAAA TATCGCAACA AGACATCGCC ACAATCTTAA AAAACTTTTT CCAGGAATTA7020TTGTTTTTTC TATGTCTTCA AGTGAGCGAG TGCTATCCGA GTTAGTGAGT GACTGTGATG7080GTTACTTAGC TAATGTAGAT GCTATCATAC AAGAGCAAGT CGATTTTGTA ATTGTAGCAT7140CACCAGCAAC TTACCATTTA CGGCATAGTG AAAAACTTTT GGCAGCAGGA ATTCCCTACT7200TTTTATTGAA AAACCCTGTT ACAGCTTCGT TTGATGACGC TAAGAAGTTA CATGAAATAG7260CTGAAAGACA CGCAACTCCG GTGGCTATAG GATATTGTTT ACGCTATTTG CCTTCTGCAA7320AAATAATTAA AAAAATAATT GAGGATAAAT TTATTGGCAG TATTTACAAT GTCAATATTG7380AGATTGGTCA ATATCTGCCG GATTGGAGAC CGTCAAAATC ATATCGTGAA AGTGTATCAG7440CAAGTAAAGT TTTGGGTGGC GGAGCGCTAC TCGAATTAAG TCATGAGCTG GATTATGCGC7500AATGGCTATT TGGTGAACTG AAACTTGTGA ATTCAGTGCT ACGGACTTCG TCAGAACTTG7560AAATGGATGT CGAATCTTTA GCTGATATTA TAGTGATAAA TTCCGCCGGT TCGCTTATTA7620ATATCCATCT TGATTTCCTT CAAAAGAAAC CATGGCGACA ATGTCATATT ATTGGCAGTA7680AGGGACGAAT TGTCTGGGAT CTTATCCGCA ATGAAATCAT TCATCATACT CGACAGAGTA7740CCGATATTAT CTTTAGTGAT CCTGGCTGGG ATAAAAATGG TATGTATACA GATATGCTGC7800TCGACTTCAT TGCGGAAATA TCCGGGAGTG ATAACAACTG TGTGACATTG GAGTCATCAA7860Orf8的起始TAAATATTGT TAGCTTAATT GATAAGATAA AAGAAACAAG TCAATGCCTT GGAGAAGTTC 7920Orf7的终止
AATGAAAATA AACGCTTTTA TATTTGCACG TGGGGGATCA AAAGGATTAC CTGGTAAAAA 7980TATTAAACCT CTAGCAGGCA AACCTCTCCT GCAATACTCT ATTGAGACTG CCAAACAGAG8040TCCTTCGATT TCCTCTATAT ATGTTTCAAC CGACGATGAT GATATTGCTC TCGTTGCAGA8100AAATTGTGGT GCTACTGTTA TTCGTAGACC GGCGGAGCTT GCCGGAGATA CTAGTCCAGA8160ATGGTTGGCA TGGCGTCACG CAATTGAGTG GGTTCAGAAG GAAGTGGGGG ATTTCGATGG8220CTTTGTAAGT TTACCGACTA CAAGCCCTTT GCGAAGTGTC GATGATGTCG AATGTGCTAT8280TGCTAAAAGA GTCGAGTCTG GTGCTGACAT ATGCATTTCA GTCACTCCGG CGAGCAGAAG8340TCCTTATTTT AATATGGTAA AATTTCACGA AAGTGGTTAT GTGAGGCTTG TCAATGAACC8400GGAAGGGAAA GTGCTCAGAC GGCAGGATTC ACCAGACGTA TTTGATATTA CTACTGTTGT8460GTACGCGACA ACGCCAAAAT TTGTTTTGAA TAATTATGGG CTATTCTCAG GCAAAGTTGC8520AAGCATTATT GTTCCTAAAG AACGTGCCGT TGATATAGAT GATATTTTTG ATTTTTACAT8580Orf9的起始Orf8的终止GGCGGAAATT TTACTTAAGG AATTGAATCG TGGCTAATAT ACTTAAAGGG AAAAAAATCC8640TTATTGCTGG TGCCGGTGGA TTGCTAGGCA CTCATCTTGT TAAAAAAGTC ATAGATGAAG8700GTGGTTATGT TATTGCCGGT GATTTTGACT TAGTGTCAAC ACAGAACAAA TTAAATGAGC8760TGGGTATCAC AACTGGATAT GAATTACATC AACTTGATGT AACAAGTCTT GAATCTGTTC8820AGGAAATACT AGCCATTGCA CCTGATCTGG ATGGTGCTAT TAATACGACT TATCCTCGAA8880ATAAAACTTA TGGTGCCCAC TTTTACGATG TAACGCTGGA AAGTTTCAAC GAAAATCTTT8940CGTTGCATCT TGGAAGTTCA TTTCTTTTCT CACAACAGTG TGCAGCATAT TTCAAAAAAA9000ATCAGCGTTC ATTTTCACTT GTAAATATTT CTTCTATTTA TGGTGTCGTG GCACCAAAAT9060TCGAAATATA CGAAAATACT AAAATGACGA TGCCTGTTGA ATATGCGGCA ATAAAATCGG9120CATTGTTACA TTTAAACAAA TATATTGTAG CTTATGTTAG AGATAGTCGA TTTAGAGTTA9180ATGCTGTAAG CCCTGGCGGT ATTTTTGATC ATCAACCAGA TGCTTTTTTA GAAGCATATA9240AAAAAGAAAC TAATGGTGCA GGGATGCTTG GTGTTACAGA AATGCTTGGA AGTATTGTAT9300TTTTGCTTTC TGATGCGTCA AAATATGTAA CGGGACAAAA TATTATTGTT GATGACGGCT9360Orf10的起始Orf9的终止TTTCATTATG ATTTCTTTTA TAAAAAAAAT AAAATTTTGG ATTGTGTGCA ACAGGTTAGG 9420ACCTGATATA CCACTTAGTC ACTTATTATT ATATTCACGT CGCTTGGGGC GTATGATTTG9480TAAACGGAAA TTCAAAAGTT TTGGCAATAA CTCTTCTTTT CGGCCTTTTG CATATGCTAT9540TGAAACACAA AAGATTGCTA TCGGTGATAA TGTTGTTATC AGGCCTGGTA CAATGTTATT9600TGCTTCACCA TATGGTGAAG AAAAAAAACT TCATATCCTT ATTGAAGATG ATGTTTTAAT9660TGGTTCTTCT GTACATATTT ATGTATCCAA CCATAAGTTT TTTGATATAA CATTACCTAT9720CTCTAAGCAA GGTCATTCAG TGGTGAAACC TGTTATTCTG AAAAAAGGTT GTTGGATTGG9780TGCTAATGTA ACCATTTTAC CTGGAGTGGT AGTCGGTGAA AATTCGGTTG TTGGTGCAAA9840TAGTGTAGTT ACGAAAAGTA TCTCTCCTTT TACAGTTGTT GCAGGAAACC CAGCCAAAAT9900Orf11的起始Orf10的终止TATAAAGAAA TTAAATGAGT GAATATAAAA GAATTTTTCA GTATTTAGCA TTTGACCTTA9960CAAATAAGGT TTTACCATTC GTAGTTCCAT ACTTTATTGC TTCCTATTTG AGTTCAGTAG 10020AGTTAGGGTA TTATACAACT AAACAGCTTT TATTTTTACT GTTCTTTAAT ATCATAAGTA 10080TGGGGGGAGG CGCAAAATTA CTAGTCTCTA TCTCAAAGAA AGATGGAGAG GAGAAAAAAA 10140TCTCATCCAT TTTATTAAAA ATGTTTTGTT TTAATGCCTG TGTTATTTTA TTTTTTTATG 10200TATTACTTCC TTTTTTCATT GTTAGTGAAA ATGTAATTAA AGATTATATA CCATTGGTAA 10260TATGCTCTTT ATTTTATTCT ATTATACAGC TGCAATTGTC GATTTATAGA GGATATAATA 10320GAATAAATGC TTACGGGATG TTAAATCTAA GCCTCTCAGT TTGTGTTTGT ATCGTGATAT 10380TCAGTTATAT ATTATATTTC AAAACGCAAC TAGGGTTATG GTATTGGCTA ATTATACCAT 10440ATGCACTTTT TTCTATTAAA TTTTTGAAAT ATTATCTGAC AGAGCGAGTA TTATCATCTG 10500
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权利要求
1.一种对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长15461个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照权利要求1所述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其包括命名为orf1，orf2，nnaA，nnaB，wckD，orf6，orf7，nnaC，orf9，orf10，wzx，orf12，wzy，orf14的14个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
3.按照权利要求2所述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特异性的基因包括转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。其中所述的转运酶基因是SEQ ID NO1中的9915至11141碱基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO1中的12068至13225碱基的核苷酸；所述的orf6基因是SEQ ID NO1中的5878至6936碱基的核苷酸；orf10基因是SEQ ID NO1中的9368至9922碱基的核苷酸；orf12基因是SEQ ID NO1中的11122至12075碱基的核苷酸；orf14是SEQ ID NO1中的13246至13962碱基的核苷酸。
4.按照权利要求1或2所述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其还包括源于所述的wzx基因或wzy基因中的寡核苷酸或糖基转移酶基因；以及它们的混合或它们的重组。
5.按照权利要求4所述的对大肠杆菌O61的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的10333至10350碱基的核苷酸和10869至10886碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10020至10037碱基的核苷酸和10980至10997碱基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的12267至12284碱基的核苷酸和12870至12887碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的12536至12553碱基的核苷酸和12874至12891碱基的核苷酸。
6.权利要求1所述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
7.权利要求1所述的时大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O61的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。
8.权利要求1所述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌。
9.权利要求1所述的对大肠杆菌O61型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤(1)基因组的提取在培养基中培养大肠杆菌O61型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O61型中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O61型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O61型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；(6)特异基因的筛选针对大肠杆菌O61型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O61型的O-抗原的高度特异性；(7)引物灵敏度的检测培养大肠杆菌O61，细菌计数后分别将5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O61的灵敏度。
10.权利要求9所述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸的分离和鉴定方法，其特征在于，包括下述步骤(1)基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O61，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O61中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O61的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAAGAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCGCGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的ExpandLong Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟，然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库；反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1MMnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证1)对大肠杆菌O61的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到14个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因筛选针对大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中wzx和wzy基因设计引物；在每个基因内各设计两对引物，每对引物分布在相应基因内不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌基因组为模板进行PCR，所有引物在大肠杆菌O61中得到阳性结果，在其他组中没有扩增到任何大小正确的带，也就是，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O61及其O-抗原都是高度特异的。(7)引物灵敏度的检测将大肠杆菌O61的冻存菌液接种到有LB培养基的三角瓶中，30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时至饱和，取培养好的菌液稀释，取稀释菌液涂布LB琼脂平板，30℃至40℃，培养数小时计数，计算原液中活菌浓度；在5份重量均为20g的生猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入LB培养基，过滤，过滤液于30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时；从培养好的菌液中取数ml于6,000g离心数分钟，去上清，加MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100℃沸水中煮数分钟，裂解液于12,000g离心数分钟，取上清做为PCR模板；用寡核苷酸进行PCR反应，PCR反应体系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反应条件为95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30个循环；反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性；参入了5×103，5×102，5×101，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果；参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果；说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O61的检测灵敏度均为0.25个菌/g。。
全文摘要
本发明提供一种对大肠杆菌O61(Escherichia coliO61)的O－抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O61中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长15461个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O61的O－抗原基因簇中的寡糖单位处理基因(包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因)的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O61的O－抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O61的方法。
文档编号C07H21/00GK1563047SQ20041001903
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月19日 优先权日2004年4月19日
发明者王磊, 杨静华, 冯露 申请人:天津生物芯片技术有限责任公司