专利名称：人类细胞中体的蛋白质复合物及其分离方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及人体细胞分离技术。
背景技术：
当前的研究表明，细胞的中体(midbody)是由微管与其他一些蛋白复合物形成的一个致密的复合物。虽然，目前对中体的形成机制还不是十分的清楚，但中体在细胞分裂过程中的重要调控作用已得到世界上许多细胞生物学家的认同。细胞分裂周期是一个受到严格调控，高度有序的过程。有丝分裂期(mitosis)大约只占整个细胞周期的1/20，在这一短暂的过程中，涉及到相当重要的遗传物质(诸如染色体、细胞器等)的均等分配和调控。生命的调控涉及甚广，其中遗传信息包括基因的持有者染色体和胞质遗传的主要单元细胞器是最根本的母代细胞向子代细胞传递生命信息的方式，也是生命调控和延续的基本方式。子代细胞的顺利形成与健康，一方面通过染色体、细胞器等重要的生命调控单元的均等分配来保证遗传信息的忠实继承，而它们都受到动点(kinetochore)、纺锤体检查点(spindle checkpoint)的严格调控；另一方面还很大程度上与末期(telophase)的退出机制有直接的相关性。细胞分裂的有丝分裂期分为早、中、后、末及胞质分裂期，其中各个时期均有特异的事件发生。有丝分裂期是遗传信息分配的重要时期，遗传信息的分配需要许多的调控蛋白的参与，但分配的完成需要调控蛋白的逐步降解，如此来保证有丝分裂期的正确退出。细胞分裂末期是有丝分裂期的最后一个调控环节，有效地清除有丝分裂期中周期特异性产生的调控蛋白是退出机制的关键所在。中体形成于有丝分裂后、末期。所谓末期，即为有丝分裂期的退出期，是子代细胞顺利形成及健康的另一保证期。研究表明中体直接参与有丝分裂期退出的调控，部分的细胞器及胞浆物质的子代分配是在中体的直接参与下完成的。任何调控上的缺陷将导致严重的遗传物质传递的故障，如基因组不稳定性，将会增加肿瘤的易发性并促进癌症的发展。
1982年，美国的研究人员McINTOSH及其助手利用生物化学手段首次从中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中分离提取了中体(美国《细胞生物学》杂志1982年第94卷654-661)。他们的做法是将收集到的中国仓鼠卵巢细胞，利用低渗液重悬后进行膨胀裂解，并通过甘油梯度分离得到中体；然后再利用去污剂Sarkosyl NL-30溶解中体上的蛋白，并在SDS-PAGE胶上展开；最后根据蛋白的分子量大小，推测得到蛋白的所属种类。
各个不同组织或种属的细胞系之间存在着众多的个体参数上的差异。与其它动物相比，人类细胞更具有高通量及特异性。虽然近年来研究人员已经完成人类基因组的测序工作，但现有方法还不能鉴定人类细胞的中体组分。因此至今尚未见到有关研究人类细胞中体组成的报道。人类细胞更能直接地揭示人体本身的生命现象，对人类细胞的研究能更好地为人类的健康服务。近年来，人类细胞中体的个别组分已被揭示有重要的肿瘤调控作用，这就更加激发了人们研究人类细胞中体组成的兴趣。因此，建立多平台联合，利用高通量特异性分离鉴定方法来解析人类细胞的中体组分，从而更多的揭示人体本身的生命秘密是当今生命科学家的重要课题。
发明内容
本发明的目的在于，提出一种能有效分离人类细胞的中体蛋白质分子组成的方法，以此解析人类细胞中体的蛋白质复合物的组成种类及其特征与功能。
本发明的人类细胞中体的蛋白质复合物，其特征在于，它至少由129种蛋白组成，其中有30种细胞骨架蛋白、4种中心体蛋白、6种囊泡转运相关蛋白、6种染色体调节蛋白、2种马达蛋白、3种检测点蛋白、7种降解调控蛋白、9种膜蛋白、12种转录与翻译相关蛋白、28种蛋白激酶、5种线粒体蛋白、9种分子伴侣蛋白和7种未知类蛋白，具体蛋白种类名称及相关的国际数据库(NCBI)编号列于表1中。
本发明的人类细胞的中体蛋白质复合物的分离方法，包括将人体细胞培养同步化及收集、加入低渗液重悬并孵育使收集细胞膨胀、破碎重悬的膨胀细胞后取出上清、通过密度梯度进行离心分离并利用去污剂抽提纯化得到中体蛋白质复合物、分离鉴定中体蛋白种类，其特征在于，所述人体细胞培养同步化及收集过程中，所同步化培养、收集的细胞是有丝分裂末期的人体细胞，其步骤为(1)将人体培养细胞置于2.5-10mM胸腺嘧啶脱氧核苷(Thymidine)的培养液中培养16小时后，使细胞同步于G1/S期；(2)洗去药物，用新鲜培养基(5-8％胎牛血清，DMEM)培养8小时，使细胞同步通过S期；(3)加入10-100ng/ml洛可达唑(Nocodazole)培养4小时，使细胞同步在有丝分裂前中期；(4)洗去药物后置于新鲜培养基(5-8％胎牛血清，DMEM)内，在37℃摇床中轻晃培养75分钟，使细胞高度同步在有丝分裂末期；(5)用常规方法收集处于有丝分裂末期的细胞。
本发明的人类细胞中体的蛋白质复合物的用途，其特征在于，为筛选抗肿瘤药物提供了模式系统和靶标蛋白ezrin及靶位。这是基于以下理由通过突变研究发现，本蛋白质复合物中的膜蛋白连接蛋白ezrin通过对胞质分裂的调控来参与肿瘤的形成及迁移，在横纹肌肉瘤及骨肉瘤中对这些肿瘤细胞的转移潜能有正面的促进作用；与此同时，在部分的肿瘤中(诸如横纹肌肉瘤)，ezrin较正常组织有较高的表达。这就是说，由于ezrin是中体的重要组成成分，因此所述的细胞中体蛋白质复合物在肿瘤的发生及转移上有重要的调控作用。通过对这一靶标蛋白ezrin来进行操控，就有可能进行相应的肿瘤治疗。例如如果通过检测点来有效地监测细胞周期，使用药物或通过高效的修复机制，将可能保证细胞的正常行进，从而阻止肿瘤的形成及迁移。
本发明的分离方法，采用高效的培养途径，并采用梯度离心手段在世界范围内首次分离出了高纯度的人细胞的中体，并鉴定出所得到的中体的组分，为研究中体功能为高效的筛选抗肿瘤药物提供了模式系统，同时也为阐明中体蛋白组分在疾病形成和发展过程中的分子机理和疾病诊断提供高效方法，以及为高效的筛选抗肿瘤药物提供了新的模式系统和靶位。
具体实施例方式
下面通过具体实施方式
对本发明作进一步描述。
1.收集有丝分裂末期的人体细胞(1)将人体培养细胞置于5mM胸腺嘧啶脱氧核苷(Thymidine)的培养液中培养16小时后，使细胞同步于G1/S期；(2)洗去药物，用新鲜培养基(含有5-8％胎牛血清的DMEM液)培养8小时，使细胞同步通过S期。
(3)加入50ng/ml洛可达唑(Nocodazole)培养4小时，使细胞同步在有丝分裂前中期；(4)洗去药物，用新鲜培养基(含有5-8％胎牛血清的DMEM液)在37℃摇床中轻晃培养75分钟，使细胞高度同步在有丝分裂末期；(5)用常规方法收集处于有丝分裂末期的细胞；2.收集末期人体细胞中的中体复合物(6)加入25倍细胞体积的低渗液(该低渗液包含如下组分1M hexylene glycol，20μM MgCl2和2mM PIPES)，重悬细胞，使细胞膨胀；(7)迅速离心收集膨胀的细胞；(8)加入50倍细胞体积的裂解液(1M hexylene glycol，1mM EGTA，1％NP-40和2mM PIPES，37℃)，震荡30秒后放在冰上冷却；(9)加入0.3倍裂解液体积的预冷的MES溶液(1M hexylene glycol，50mM MES，pH 6.3)；(10)离心，分理出未破碎的细胞和细胞核，取出上清；(11)将上清置于15ml 40％甘油层上，2800g离心20分钟；(12)弃去上清和甘油，用50mM MES溶液重悬沉淀下来的中体，并洗涤2-4次；(13)利用强去污剂(0.4％Sarkosyl NL-30溶于50mM MES溶液中，pH 6.3)抽提中体上的蛋白，在冰上静置1小时；(14)离心去除不溶的骨架成分，得到人体细胞的中体复合物3.分离鉴定蛋白质种类(15)用丙酮沉淀上清中的蛋白，并用等电聚焦缓冲液溶解沉淀下来的蛋白；(16)加样并进行等电聚焦电泳；(17)将完成等电聚焦的胶条取出，平衡后置于十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上，作SDS-PAGE电泳；(18)取出两向电泳胶，考马斯亮蓝染色；(19)从SDS-PAGE胶上切出分离的蛋白，脱色，修饰后用胰酶(Trypsin)进行胶内酶解；(20)抽提出酶解后的肽段，利用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)测定肽指纹谱；(21)利用软件分析得到的肽指纹谱，进入NCBI数据库检索鉴定。对于已知的蛋白作进一步的功能评估，对于未知的蛋白可以从基因库中克隆出cDNA，再以此为基础来研究该功能未知的蛋白。
对本实施方式中得到的中体蛋白进行双向电泳实验证实，其分离效果较好。如果将两次实验得到的中体蛋白样品分别标记上不同的荧光染料(如cy3，cy5)，并在同一块两向胶上展开，使用软件对比荧光信号的重叠性，可以验证出分离的重复性好。利用蛋白酶(如胰酶)消化本发明的中体蛋白得到蛋白多肽，然后通过质谱测定这些蛋白多肽可得到非常精确的肽指纹谱。
本实施方式中所用的人细胞，取自于美国ATCC(American Type Culture Collection)公司提供的HeLa细胞。
本实施方式中所用到的试剂均由市场购得，其中配制低渗液的主要试剂HexyleneGlycerol为日本东京化成工业株式会社产品；培养液中的洛可达唑(Nocodazole)和胸腺嘧啶脱氧核苷(Thymidine)、裂解液中的PIPES和NP-40、去污剂Sarkosyl NL-30、甘油(Glycerol)均为美国Sigma公司产品；Trypsin为美国Roche公司产品；新鲜培养基(含有5-8％胎牛血清的DMEM液)为美国Gibco公司产品，其余试剂在国内市场购得。
表1
权利要求
1.人类细胞中体的蛋白质复合物，其特征在于，它至少由129种蛋白组成，其具体蛋白种类名称及相关的国际数据库(NCBI)编号为
2.人类细胞的中体蛋白质复合物的分离方法，包括将人体细胞培养同步化及收集、加入低渗液重悬并孵育使收集细胞膨胀、破碎重悬的膨胀细胞后取出上清、通过密度梯度进行离心分离并利用去污剂抽提纯化得到中体蛋白质复合物、分离鉴定中体蛋白种类，其特征在于，所述人体细胞培养同步化及收集过程中，所同步化培养、收集的细胞是有丝分裂末期的人体细胞，其步骤为(1)使细胞同步于G1/S期；(2)使细胞同步通过S期；(3)使细胞同步在有丝分裂前中期；(4)使细胞高度同步在有丝分裂末期；(5)用常规方法收集处于有丝分裂末期的细胞。
3.如权利要求2的分离方法，其特征在于，步骤(1)中的使细胞同步于G1/S期的具体方法是将人体培养细胞置于2.5-10mM胸腺嘧啶脱氧核苷(Thymidine)的培养液中培养16小时。
4.如权利要求2的分离方法，其特征在于，步骤(2)中的使细胞同步通过S期的具体方法是洗去药物，用新鲜培养基(5-8％胎牛血清，DMEM)培养8小时。
5.如权利要求2的分离方法，其特征在于，步骤(3)中的使细胞同步在有丝分裂前中期的具体方法是加入10-100ng/ml洛可达唑(Nocodazole)培养4小时。
6.如权利要求2的分离方法，其特征在于，步骤(4)中的使细胞高度同步在有丝分裂末期的具体方法是洗去药物后置于新鲜培养基(5-8％胎牛血清，DMEM)内，在37℃摇床中轻晃培养75分钟。
7.人类细胞中体的蛋白质复合物的用途，其特征在于，为筛选抗肿瘤药物提供了模式系统和靶标蛋白ezrin及靶位。
全文摘要
本发明涉及人体细胞分离技术。所述的人类细胞中体的蛋白质复合物，它至少由129种蛋白组成，其中有30种细胞骨架蛋白、4种中心体蛋白、6种囊泡转运相关蛋白、6种染色体调节蛋白、2种马达蛋白、3种检测点蛋白、7种降解调控蛋白、9种膜蛋白、12种转录与翻译相关蛋白、28种蛋白激酶、5种线粒体蛋白、9种分子伴侣蛋白和7种未知类蛋白。在分离方法中，包括将人体细胞培养同步化及收集、加入低渗液重悬并孵育使收集细胞膨胀、破碎重悬的膨胀细胞后取出上清、通过密度梯度进行离心分离并利用去污剂抽提纯化蛋白质复合物、分离鉴定中体蛋白种类。人类细胞中体的蛋白质复合物组成的揭示为筛选抗肿瘤药物提供了模式系统和靶标蛋白ezrin及靶位。
文档编号C07K1/14GK1712412SQ20041004109
公开日2005年12月28日 申请日期2004年6月23日 优先权日2004年6月23日
发明者姚雪彪, 符传孩, 缪勇, 薛宇 申请人:中国科学技术大学