专利名称：一种蛋白质分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及小分子蛋白质的分离纯化方法，特别是促肝细胞生长素(pHGF)的分离和纯化。
背景技术：
双水相萃取工艺，是近年来得到迅速发展的一种生物活性物质的萃取方法。其基本原理是利用高聚物、盐等在一定的组成和浓度下，可以在同一个水相中形成两个互不相容的水相，称作双水相，利用这样的双水相，来从细胞匀浆液或者发酵液中萃取目的产物，实现目的产物的提取、分离，其最大的优势在于分离简便、操作成本低、能有效地保持目的产物的生物活性。目前，已经有多种双水相体系得到应用，例如聚乙二醇(PEG)/葡聚糖、PEG/无机盐等。CN 1195028A(“双水相萃取法提取红霉素的方法”)提出用双水相萃取法从含有3000～10000u/mL的发酵液红霉素中提取红霉素，采用环氧乙烷—环氧丙烷无规共聚物与K2HPO4构成双水相体系，萃取后静置或者离心分相，来达到提取的目的。文献(《中国抗生素杂志》，1998，23(2)，144)介绍了采用PEG/磷酸盐组成的双水相系统萃取丙酰螺旋霉素的方法，其研究是在1000μg/mL的丙酰螺旋酶素溶液中进行的。而文献(《贵州工业大学学报(自然科学)》，2000，29(4)，83)也报道了采用PEG/磷酸盐双水相系统，分离α-淀粉酶的研究，酶的浓度达到1.05～5.5ku/mL，最高达到11.2ku/mL。这些方法虽然在保持目的产物活性、提高产物收率方面取得了很大的改进，但其应用的前提是目的物的种类比较单一、目的物的原始浓度很高，且不存在目的物的纯化问题。对于低浓度的目的产物的双水相萃取，目前尚没有相关的报道促肝细胞生长素(pHGF)是从乳猪肝脏中提取的具有较高生物活性的治疗肝炎药物。经典的制备方法是由La Breque于1975年报道的乙醇沉淀法。
pHGF为一类分子量分布较广的多肽，其分子量分布于以下范围大于11万、2～6万以及小于2万。我国空军医院陈光明等人首先在La Breque的传统方法上，进行了改进，开发出负压透析法制备pHGF的工艺(专利89107217，“采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法”)，即在反复多次的组织捣碎后，离心取上清液，用截留分子量12000道尔顿的透析袋进行透析，得到pHGF。该方法的提取工艺虽然简单，但也有较为明显的缺陷pHGF收率低、蛋白浓度低、生产环境要求高、生产周期长。
后来，又有多种改进的pHGF制备工艺出现。
例如，乙醇沉淀结合离子交换过滤法(CN 1068036A，“一种乳猪肝脏刺激生长因子的制备工艺”)，针对原有的乙醇沉淀法中pHGF粗制品不能直接用于临床、而精制又需要复杂的工艺流程和昂贵的化学试剂的缺陷，改进、简化了原有工艺，在经过95℃水浴加热、95％乙醇沉淀、静置过滤之后，用0.02M pH 7.2的磷酸盐缓冲液溶解乙醇沉淀物，进行DEAE离子交换过滤，再用不同浓度的氯化钠液进行两次洗脱，即得到pHGF的精制品。
又如二步超滤法(CN 1038512C，“促肝细胞生长素生产方法”)，在经过95℃的水浴加热、冰盐冷却、离心、用0.3微米的滤膜过滤澄清后，经过两次超滤，截留分子量在8000～10000道尔顿的蛋白组分，即为pHGF产品。
这些改进的方法，在工艺上进行了简化，产品的收率、纯度都有所提高。但是它们都有一个共同的特点，就是先将细胞匀浆液置于水浴中加热至95℃，然后用离心或者过滤的办法分离出清液，再进一步用沉淀、超滤以及离子交换过滤等工艺进行处理。这样就带来一个问题，即加热后的细胞匀浆液的过滤及离心十分困难。过滤中，过滤膜极易被堵塞，导致过滤压力增大，功耗增加，过滤膜也容易损坏。而离心中，也存在着难以将清液和浊液完全分开，给后面的工艺带来麻烦，而增加离心力或者离心转速，也带来功耗增大的问题。由于过滤或者离心困难，使得上述工艺在产品收率、产品活性以及产品质量方面比较容易出现问题，不可避免地出现内毒素或者抗原超标等现象。
pHGF在18000～24000的分子量范围内，其活性度较高、临床效果好(文献《临床肝胆病学杂志》“肝脏刺激生长因子的抽提和实验研究”，1990，6(3)，41)。而要进行不同分子量的目的物的分离，依靠上述的双水相萃取方法均难以做到。
研究同时也表明了(文献《东北师大学报自然科学版》“双水相萃取技术的研究进展”，2000，32(3)，34)，虽然双水相萃取法最早被发现可以进行蛋白质的分离提取，近年来，也发现该方法还能用来提取抗生素，但是，还没有发现该方法同时还能提取包括内毒素在内的其他杂质。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种从杂蛋白含量较高的细胞浆液中分离纯化具有一定分子量范围的活性蛋白的方法，该方法可以同时除去大量杂质和细胞碎片，具有维系蛋白质活性、分相时间短、无有机溶剂残留、易于工程放大和连续操作的特点，同时可除去影响产品质量的内毒素。
本发明公开的蛋白质纯化方法采用由高聚物/盐组成的双水相系统萃取，经过两次双水相萃取，结合阴离子交换树脂层析分离，提取出分子量为10000～30000的蛋白质。
本发明所述的高聚物选自分子量分别为400、1000、2000、4000、6000或20000的聚乙二醇(PEG)中的一种或者几种。
本发明所述的盐选自硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或磷酸钾中的一种或者几种。
本发明采用两次双水相萃取分离蛋白质的方法具体包括下列步骤(1)以高聚物/盐＝4～18％/6～20％(w/v)的比例组成双水相系统，对细胞匀浆液进行萃取，通过静置或者离心的方法，分离出富含目的蛋白质的上相，得到第一次粗提液；(2)以高聚物/盐＝4～18％/6～20％(w/v)的比例组成双水相系统，并加入0.1％～1.0％(w/v)的NaCL溶液，对第一次粗提液进行萃取，通过静置或者离心的方法，分离出富含目的蛋白质的下相，做为蛋白粗提液；(3)蛋白粗提液再装入用DEAE-葡聚糖或者纤维素做为阴离子交换树脂的层析柱中，用含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或氯化钠中的2种或者2种以上混合物的水溶液进行层析柱的洗脱，收集0.42％～0.86％(w/v)浓度下的洗脱液，即为所需要的分子量为10000～30000的蛋白质。
本发明双水相萃取分离蛋白质的方法中，第一次双水相萃取的盐优选硫酸铵。
当双水相萃取系统选用两种高聚物时，两高聚物的重量比优选(1.0～3.0)∶(1.0～4.0)。
当双水相萃取系统选用两种盐时，两种盐的重量比优选(1.0～8.5)∶(1.0～8.5)。
本发明两次双水相萃取分离方法适用于小分子蛋白质的分离纯化，特别适用于促肝细胞生长素的制备。
本发明两次双水相萃取分离方法亦适用于抗生素的提取。
采用双水相萃取工艺，避免了传统工艺中加热后的细胞匀浆液的过滤及离心十分困难的问题。由于在双水相系统的组成中采用了不同分子量的PEG的组合，并先后与两类盐构成双水相系统，通过第一次的粗提，将含有细胞内的蛋白质与其他杂质分离开，再通过第二次粗提，并加入NaCL溶液，可将目的类蛋白质萃取出来，具有萃取目的蛋白质的选择性。得到目的蛋白相粗提液后，再采用阴离子交换树脂进行层析，可以分离出所需要的分子量为10000～30000的蛋白质。整个工艺操作简便，没有复杂的过滤设备，仅仅通过容易实现的液—液相离心分离即可达到粗分离的目的，减少了设备的投入和运行成本。同时，由于整个操作在常温下的水相中进行，可以有效地保持目的蛋白的生物活性。
具体实施例实施例1用PEG400和PEG6000的混合物及PEG2000与硫酸铵和磷酸盐组成双水相，结合DEAE-葡聚糖层析，制备pHGF。
取新鲜的乳猪肝脏，经过剪除外膜、绞碎后加入纯化水，进行高压匀浆后待用。取PEG400与PEG6000，按照质量组成比为1.0∶2.8(w/w)，用少许纯化水溶解后与细胞匀浆液混合，再加入硫酸铵，使得混合后包括细胞匀浆液在内的PEG与硫酸铵比例为9％/11％(w/v)，用纯化水进行浓度的调节，进行振荡以使其充分混合均匀后，静置1.2h。此时分离出上相，弃去下相，得到第一次粗提液。
取PEG2000，用少许纯化水溶解后，加入第一次粗提液中，充分混合后，再加入用纯化水配制的、由磷酸氢二钠和磷酸二氢钾质量比为1.0∶3.8混合而成的磷酸盐溶液，再加入0.76％(w/v)的NaCL溶液，最后使得PEG2000与磷酸盐在总系统内的组成比例达到8.5％/11.2％，组成双水相系统，对第一次粗提液进行萃取，用4000rpm以下的离心方法，分离出富含目的蛋白质的下相，即为蛋白粗提液。
再将蛋白粗提液装入用以DEAE-葡聚糖做为阴离子交换树脂的层析柱中，用含有磷酸二氢钾和氯化钠(质量组成(w/w)为1.0∶2.3)的水溶液进行层析柱的洗脱，洗脱液总浓度为0.8％～1.2％(w/v)，再用含有磷酸氢二钠和氯化钠(质量组成(w/w)为1.0∶1.5)的水溶液进行层析柱的洗脱，洗脱液总浓度为0.42％～0.86％(w/v)，收集该浓度下的洗脱液，即可得到所需要的分子量为18000～24000的促肝细胞生长素，纯度为78.0％～84.0％(W/W)(18000～24000的分子量占总蛋白含量的百分比)，得率为0.24％～0.82％(W/W)(蛋白总量占细胞匀浆液的百分比)。
实施例2用PEG20000和PEG1000的混合物以及PEG4000与硫酸铵和磷酸盐组成双水相，结合DEAE-葡聚糖层析，制备pHGF。
取新鲜的乳猪肝脏，剪除外膜、绞碎、高压匀浆后待用。取PEG20000和PEG1000，按照质量组成比为2.7∶1.3(w/w)，溶解后与匀浆液混合，加入硫酸铵，使PEG与硫酸铵在匀浆液内达到比例为8.2％/12.3％(w/v)，用水进行浓度的调节，经过充分混合后，静置1.3h后，分离出上相，得到第一次粗提液。
再取PEG4000，溶解后，加入第一次粗提液中，再加入0.76％(w/v)的NaCL溶液，此后，加入磷酸二氢钠，组成双水相系统，使得PEG4000与磷酸盐在总系统内的组成比例达到10.3％/12.7％，充分混合后，离心(≤4000rpm)，将分离出的下相引入层析柱中，阴离子交换树脂为DEAE-葡聚糖，先用磷酸氢二钾和氯化钠(质量组成(w/w)为1.0∶2.8)的水溶液进行洗脱，洗脱液总浓度为0.8％～1.2％(w/v)，再用磷酸氢二钠和氯化钠(质量组成(w/w)为1.0∶1.5)的水溶液进行洗脱，洗脱液总浓度为0.42％～0.86％(w/v)，收集该浓度下的洗脱液，即可得到所需要的产物，纯度为81.0％～86.0％(W/W)(18000～24000的分子量占总蛋白含量的百分比)，得率为0.16％～0.67％(W/W)(蛋白总量占细胞匀浆液的百分比)。
权利要求
1.一种小分子蛋白质的分离纯化方法，其特征在于该方法采用由高聚物/盐组成的双水相系统萃取，经过两次双水相萃取，结合阴离子交换树脂层析分离，提取出分子量为10000～30000的蛋白质或抗生素。
2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于其中所述的蛋白质是促肝细胞生长素。
3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于其中所述的高聚物选自分子量为400、1000、2000、4000、6000或20000的聚乙二醇中的一种或者几种。
4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于其中所述的盐选自硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或磷酸钾中的一种或者几种。
5.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于该方法具体包括下列步骤(1)以高聚物/盐＝4～18％/6～20％(w/v)的比例组成双水相系统，对细胞匀浆液进行萃取，通过静置或者离心的方法，分离出富含目的蛋白质的上相，得到第一次粗提液；(2)以高聚物/盐＝4～18％/6～20％(w/v)的比例组成双水相系统，并加入0.1％～1.0％(w/v)的NaCL溶液，对第一次粗提液进行萃取，通过静置或者离心的方法，分离出富含目的蛋白质的下相，作为蛋白粗提液；(3)蛋白粗提液再装入用DEAE-葡聚糖或者纤维素做为阴离子交换树脂的层析柱中，用含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或氯化钠中的2种或者2种以上混合物的水溶液进行层析柱的洗脱，收集0.42％～0.86％(w/v)浓度下的洗脱液，即为所需要的分子量为10000～30000的蛋白质。
6.根据权利要求4所述的分离纯化方法，其特征在于其中所述的步骤(1)第一次双水相萃取的盐是硫酸铵。
7.根据权利要求2所述的分离纯化方法，其特征在于其中所述的高聚物选用两种时，重量比为(1.0～3.0)∶(1.0～4.0)。
8.根据权利要求3所述的分离纯化方法，其特征在于其中所述的盐选用两种时，重量比为(1.0～8.5)∶(1.0～8.5)。
全文摘要
本发明涉及小分子蛋白质的分离纯化方法。本发明公开的蛋白质纯化方法采用由高聚物/盐组成的双水相系统萃取，经过两次双水相萃取，结合阴离子交换树脂层析分离，提取出分子量为10000～30000的蛋白质。本发明方法可以同时除去大量杂质和细胞碎片，具有维系蛋白质活性、分相时间短、无有机溶剂残留、易于工程放大和连续操作的特点，同时可除去影响产品质量的内毒素。本发明方法特别适用于促肝细胞生长素的分离、纯化。
文档编号C07K1/36GK1749267SQ20041005147
公开日2006年3月22日 申请日期2004年9月15日 优先权日2004年9月15日
发明者王玉亭 申请人:王玉亭