专利名称：获得氨酯保护的α－氨基酸N－羧酸酐的方法
技术领域：
本发明涉及制备氨酯保护的α-氨基酸N-羧酸酐的新方法。使用这种新方法，可以在催化量的三乙撑二胺的存在下，由α-氨基酸N-羧酸酐合成氨酯保护的α-氨基酸N-羧酸酐，而不加入显著量的叔胺型碱。
任选受保护的α-氨基酸N-羧酸酐(以首字母缩略词NCA表示)是通常用于形成高分子量聚α-氨基酸和用于制备二肽的酰化剂。NCA是化学性质非常活泼的化合物，其不形成任何不希望的副产物，尤其是通过重排作用，其唯一的反应副产物是二氧化碳。只要NCA与氨基酸的自由氨基官能团反应，就会立即释放出二氧化碳并形成二肽，所述二肽本身也含有自由氨基官能团。该氨基将与NCA反应并形成三肽等。因此NCA可以用于形成聚α-氨基酸，但是它们不能容易地用于连续合成多肽，因为难以控制多重缩合次级反应如低聚反应。
文献中已经描述了氨酯基团取代的α-氨基酸N-羧酸酐，它们用于肽的合成。氨酯取代基提供高程度的保护并允许在偶联反应期间使聚合反应最小化。氨酯保护的NCA，下文中简称为UNCA，具有未取代NCA的所有优点而没有未取代NCA的缺点。
UNCA允许可控合成多肽，而不需要对羧基进行任何预活化，也不需要加入任何添加剂如N-羟基苯并三唑。因此，在溶液中制备的肽的提纯得以简化，因为该肽合成反应的唯一副产物是二氧化碳。
UNCA还是激素或抗AIDS药物合成中非常有用的原料。
室温和常压条件下为结晶状态的UNCA在标准的实验室操作和储存条件以及肽合成条件下是稳定的。
由NCA合成UNCA的两条主要路线如下1)可以通过烷基或芳烷基氯甲酸酯如Fmoc-Cl(9-芴基甲氧羰基氯甲酸酯)或氯甲酸苄酯与NCA在至少是化学计量量的叔胺的存在下进行缩合而合成UNCA。所述叔胺传统上是N-甲基吗啉，其通过加入盐酸而除去。由此将NCA加入到惰性溶剂如THF的溶液中，并冷却。一次性加入1.1-1.3倍当量的烷基或芳烷基氯甲酸酯，然后缓慢加入至少1.5倍当量的叔胺，例如N-甲基吗啉。所得悬浮液在-25至-5℃的温度下静置1-2小时。接下来，缓慢加入溶解于二氧六环中的盐酸，直至获得约4-5的pH值。过滤除去由此形成的叔胺盐酸盐，浓缩UNCA并使其结晶。
该方法的所有步骤均在惰性气体(N2)保护下进行，所有溶剂均在使用前用4分子筛进行干燥(William D.Fuller et al.，Urethane-protected-alpha-amino acidN-carboxyanhydrides and peptide synthesis，Biopolymers，1996，40，183-205)。
该合成路线不是非常适用于制备特定保护的α-氨基酸N-羧酸酐，尤其是叔丁氧羰基(t-butoxylcarbonyl)保护的那些，氯甲酸叔丁酯在-20℃以上或在叔胺存在下非常不稳定。
2)还可以通过重碳酸二烷基酯与NCA的缩合来合成UNCA。该反应释放醇分子和二氧化碳分子。该合成必须绝对在大量、至少是相对于所用NCA摩尔量为50％摩尔量的叔胺如N-甲基吗啉以及催化量的DMAP(4-二甲基氨基吡啶)或吡啶的存在下进行(William D.Fuller et al.，Urethane-protected-alpha-amino acidN-carboxyanhydrides and peptide synthesis，Biopolymers，1996，40，183-205)。该合成路线尤其适用于利用重碳酸二叔丁酯合成被叔丁氧羰基保护的α-氨基酸N-羧酸酐。
申请WO89/08643描述了具有氨酯保护的α-氨基酸N-羧酸酐和α-氨基酸N-硫代羧酸酐，其化学式如下 其中，R和R′代表氢原子、烷基、环烷基、由取代烷基所取代的环烷基、芳基或取代芳基，并且至少一个R或R’基团不代表氢原子；R″代表烷基、芳基、取代烷基或取代芳基；Z代表氧或硫原子，n是0、1或2。
这些化合物通过在无水条件下，在过量加入的叔胺型碱的存在下，使NCA与卤甲酸酯在惰性溶剂如甲苯中反应而制备。
合成UNCA的现有方法并不令人满意。实际上，上述最好的方法即相对于所用NCA的量使用至少等于50％摩尔量的叔胺型碱的方法仅仅提供约60％的产率，前提是溶剂用4分子筛干燥，并且在-20至-15℃之间进行操作。令人惊奇地发现，使用非常低催化量即相对于所用NCA的摩尔量为少于5摩尔％的三乙撑二胺(TEDA)，而不加入任何叔胺型碱，得到非常好的结果。在本发明的范围内，首字母缩略词NCA是指α-氨基酸N-羧酸酐，UNCA是指氨酯保护的α-氨基酸N-羧酸酐。在本发明的意义上，催化量是指显著少于化学计量所需量的量，更具体而言是指少于50％的化学计量所需量的量。本发明涉及获得氨酯保护的α-氨基酸N-羧酸酐(UNCA)的方法，所述UNCA具有化学式I， 化学式I其中R1和R2相同或不同，一起或各自独立地代表氢原子或者天然或合成的α-氨基酸侧链，所述侧链任选具有根据需要的保护官能团；R3代表线型或支化的、饱和或不饱和的C1-C10烷基或者具有7-14个碳原子的芳烷基或烷芳基，该方法的特征在于具有化学式II的α-氨基酸N-羧酸酐(NCA)， 化学式II其中R1和R2具有与化学式I中相同的意义，与相对于化学式II的NCA所用摩尔量为至少1倍当量的化学式III的重碳酸盐， 化学式III其中R3具有与化学式I中相同的意义，在相对于化学式II的NCA所用摩尔量而言为催化量的1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷、也称作三乙撑二胺(TEDA)的存在下，在熔点低于约-20℃的惰性有机溶剂中进行反应。
天然或合成α-氨基酸是在链的第一个碳上具有氨基官能团和羧酸官能团的氨基酸。α-氨基酸的其余部分称作α-氨基酸的侧链。
R1和R2根据需要由目前用于氨基酸和肽领域的保护基团所保护(Bodansky，Principle of peptide synthesis，Springer-Verlag，1984；Alpha amino-acidN-carboxyanhydrides and related heterocycles，Hans R.Kricherdorf)。
R1和R2相同或不同，有利地代表氢原子、线型或支化C1-C8烷基，所述烷基任选地包含一个或多个氨基酸和肽领域中常用的取代基。所述取代基具体选自OH、SH、NH2、NHC(NH)NH2、CONH2、O-(C6-C10芳基)、S-(C1-C6烷基)、COO-(C1-C6烷基)、COO-(C5-C8芳烷基)、尤其是苄酯基。
基团R1和R2可以有利地代表C5-C7环烷基，所述环烷基任选地由一个或多个氨基酸和肽领域中常用的基团所取代。所述取代基具体选自卤素、OH、O-(C1-C6烷基)、O-(C6-C10芳基)、C1-C6烷基。
R1和R2基团可以有利地代表苯基、萘基、5或6元杂芳基或吲哚基，其任选地被一个或多个氨基酸和肽领域中常用的基团取代。所述取代基具体选自卤素、OH、O-(C1-C6烷基)、O-(C6-C10芳基)、C1-C6烷基。
由于显而易见的立体位阻原因，R1和R2不能同时代表环状基团。环状基团是指所述C5-C7环烷基以及所述苯基、萘基、5或6元杂芳基或吲哚基。
R1和R2还可以一起形成任选地被一个或多个氨基酸和肽领域中常用的基团取代的C5-C7环烷基。所述基团具体选自卤素、OH、O-(C1-C6烷基)、C1-C6烷基、O-(C6-C10芳基)。
如果R1和R2不一起形成C5-C7环烷基，那么有利的是，R1和R2基团中的至少一个如前所述代表氢原子。
在化学式II的化合物中，官能团有利地被合适的保护基团所保护。
根据本发明的有利替代方案，R3代表甲基、乙基、叔丁基、苯甲基、烯丙基、9-芴基甲基。事实上，尽管有许多氨酯可以用作保护基团，但是这些氨酯中仅有少数广泛用于肽的合成。尤其可以提及的是叔丁氧羰基(Boc)、苯甲氧羰基(Cbz)和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)。因此，由这些取代基所保护的α-氨基酸N-羧酸酐尤其受到关注。
使用根据本发明的方法，可以避免使用相对于所用NCA的摩尔量而言为50-200摩尔％的非常大量的叔胺。现有技术中所用的叔胺即N-甲基吗啉和吡啶，实际上存在许多问题。尤其是，它们的应用涉及高度稀释、额外产物的形成、附加的分离步骤、难以重复利用，而且成本很高。
使用根据本发明的方法，还可以显著缩短反应时间，从而少于24小时，并且有利地为约1-4个小时，而对于现有技术的方法来说，反应时间为30小时-5天。
使用根据本发明的方法，可以获得UNCA，其纯度利用GPC(气相色谱法)测得为大于90％，有利的是大于95％，并且具有大于60质量％的非常令人满意的产率。
根据本发明的有利替代方案，溶剂选自环状或线型C4-C10醚和氯代C1-C5烷烃。有利的是，溶剂为THF(四氢呋喃)。
当反应溶剂为THF时，对于所用1摩尔化学式II的NCA，所加入的溶剂量通常包含500g-2kg溶剂。
根据本发明方法的有利替代方案，TEDA的加入量为0.1-5摩尔％的TEDA，相对于化学式II的NCA所用摩尔量。更有利的是，TEDA的加入量为0.2-1摩尔％，相对于化学式II的NCA所用摩尔量。
化学式II的NCA有利地与1.1-1.5倍当量的化学式III的重碳酸盐在TEDA的存在下、尤其是在相对于化学式II的NCA所用摩尔量为0.2-1摩尔％的TEDA的存在下反应。
化学式III的重碳酸盐有利的是加入到部分溶剂中，有利的是相对于所用重碳酸盐的总重量为0.5-2.0重量份数的溶剂中形成溶液，再加入到反应介质中，所述反应介质包含溶剂的其它所需部分、通常是待转化的化学式II的NCA和TEDA。加入重碳酸盐时，反应介质的温度保持在-20至5℃之间，有利的是在-15至5℃之间，甚至更有利的是在-10至0℃之间。根据本发明的有利替代方案，反应在惰性气氛中进行。
TEDA的催化作用使得向反应介质中逐渐加入重碳酸盐的技术成为可能，利用这种技术可以通过停止加入来控制放热，从而避免任何危险反应失控的风险。
使用该方法，可以在浓度高得多的介质中进行反应，这与缩短的反应时间相结合，提供生产率的显著提高，并且极大地限制聚合风险。
化学式III的重碳酸盐加入完成时，有利的是在-5至10℃的温度下继续搅拌反应介质至少30分钟。
化学式III的重碳酸盐加入完成时，任选地使反应介质处于搅拌状态中的同时，过滤反应介质，然后通过减压蒸发除去至少80％、有利的是约90％的溶剂。接下来，如果需要则在除去所述合适的保护基团后，优选加入等于通过蒸发除去的反应溶剂量的非溶剂化合物，以使得化学式I的UNCA沉淀，随后通过过滤回收。
根据本发明的一个替代方案，在15至30℃、有利的是在室温温度下通过减压蒸发除去溶剂。
UNCA的非溶剂化合物有利的是C5-C10线型或支化烷烃，尤其是庚烷B。
根据本发明的替代方案，随后在低于30℃的温度下真空干燥沉淀物。
下列实施例说明本发明并且是非限制性的。
实施例1制备Boc-Val-NCA首字母缩略词Val代表α-氨基酸缬氨酸。因此Val-NCA代表具有下列化学式的化合物 在装配有低温恒温器、漏斗、氮气流系统、机械搅拌和温度计探头的1升双层夹套反应器中，在用氮气惰性化并冷却至-5±2℃之后加入-204g THF，-37.5g(0.26mol)Val-NCA，-0.15g(1.3mmol)TEDA。
将反应介质搅拌1/2小时，然后通过滴液漏斗用2个小时向其中缓慢加入69g(0.316mol)(Boc)2O在50g THF中的溶液，同时将温度控制在-5℃±2℃。产生少量气体。
完成(Boc)2O的滴加后继续搅拌反应介质1小时。
于0℃，在惰性预滤层(inert pre-layer)上用THF过滤反应介质，并用50ml THF清洗反应器和惰性预滤层。
将滤出液再次在氮气下加入到双层夹套反应器中，在140-160mbar的压力下，在18-26℃的反应介质温度下，蒸馏出300ml THF。
在25℃的温度下，加入300ml(215g)庚烷B。缬氨酸UNCA产物沉淀。然后在25℃和900-100mbar的条件下蒸馏出300ml THF/庚烷B混合物，直至反应介质的体积达到约100ml。随后在约25℃的温度下加入200ml庚烷B。将反应介质冷却到-10℃，再保温1小时。在氮气气氛下，于-10℃，在烧结的N°3过滤器上进行过滤。在25±5℃的温度下，在真空烘箱中干燥产物。
由此得到51.6g(产率80.8％)白色粉末，旋光度为59.1°(C＝1，THF)，经GPC测得纯度为100％。
实施例2制备Boc-Ile-NCA首字母缩略词Ile代表α-氨基酸异亮氨酸。因此Ile-NCA代表具有下列化学式的化合物 利用-200.9g THF，-40.0g(0.255mol)Ile-NCA，-0.14g(1.3mmol)TEDA和66g(0.302mol)(Boc)2O在66g THF中的溶液进行如实施例1中的反应。
过滤并干燥之后，回收51.5g(产率78.6％)期望产物，熔点为107.6℃，旋光度为60.3°(C＝1，THF)。经GPC测得纯度为99.3％。
实施例3制备Boc-D-Phe-NCA首字母缩略词Phe代表α-氨基酸苯丙氨酸。因此Phe-NCA代表具有下列化学式的化合物 利用-427g THF，-25g(0.131mol)D-Phe-NCA，-0.07g(0.65mmol)TEDA和34.2g(0.157mol)(Boc)2O在21.5g THF中的溶液进行如实施例1中的反应，但是温度设定在-17±1℃。
过滤并干燥之后，回收24.1g(产率63％)与期望的1H NMR结构一致的产物，经GPC测得纯度为95.2％。
实施例4制备N-乙氧羰基-缬氨酸-N-羧酸酐(EtOC-Val-NCA)在装配有低温恒温器、滴液漏斗、氮气流系统、机械搅拌和温度计探头的1升双层夹套反应器中，在用氮气惰性化并冷却至-5±2℃之后加入-204g THF，-20.0g(0.141mol)Val-NCA，-0.078g(0.7mmol)TEDA。
将反应介质搅拌30分钟，然后通过滴液漏斗用1个小时向其中缓慢加入27.1g(0.167mol)重碳酸二乙酯[(EtOC)2O]，同时将温度控制在-5°±2℃。产生少量气体。
(EtOC)2O滴加完成后继续搅拌反应介质1小时。
在140-160mbar的压力下，在18-26℃的反应介质温度下，浓缩THF。
在25℃的温度下，加入220ml庚烷B，并倒入大量冰水中。产物沉淀。在氮气气氛下，在烧结的N°3过滤器上进行过滤。在25±5℃的温度下，在真空烘箱中干燥产物。
由此得到20.1g(产率67％)白色粉末，其1H NMR和13C NMR谱与期望结构一致。
权利要求
1.获得由氨酯保护的α-氨基酸N-羧酸酐(UNCA)的方法，所述氨酯保护的α-氨基酸N-羧酸酐(UNCA)具有化学式I， 化学式I其中R1和R2相同或不同，一起或各自独立地代表氢原子或者天然或合成的α-氨基酸侧链，所述侧链任选具有根据需要的保护官能团；R3代表饱和或不饱和的、线型或支化的C1-C10烷基或者具有7-14个碳原子的芳烷基或烷芳基，该方法的特征在于具有化学式II的α-氨基酸N-羧酸酐(NCA)， 化学式II其中R1和R2具有与化学式I中相同的意义，与相对于化学式II的NCA所用摩尔量为至少1倍当量的化学式III的重碳酸盐， 化学式III其中R3具有与化学式I中相同的意义，在相对于化学式II的NCA所用摩尔量为催化量的1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷、也称作三乙撑二胺(TEDA)的存在下，在熔点低于约-20℃的有机溶剂中进行反应。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于R1和R2相同或不同，代表氢原子、任选被取代的C1-C8线型或支化烷基、任选被取代的C5-C7环烷基、任选被取代的苯基、萘基、5或6元杂芳基或吲哚基，前提是R1和R2不同时代表环状基团；或者R1或R2一起形成任选被取代的C5-C7环烷基，所述任选的取代基是氨基酸和肽领域中常用的取代基。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于所述任选的取代基选自OH、SH、NH2、NHC(NH)NH2、CONH2、O-(C1-C6芳基)、S-(C1-C6烷基)、COO-(C1-C6烷基)、COO-(C5-C8芳烷基)。
4.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于R3代表甲基、乙基、叔丁基、苯甲基、烯丙基或9-芴基甲基。
5.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述溶剂选自C4-C10醚和氯代C1-C5烷烃。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于所述溶剂是THF。
7.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于TEDA的量为0.1摩尔％-5摩尔％，相对于化学式II的NCA所用摩尔量。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于TEDA的量为0.2摩尔％-1摩尔％，相对于化学式II的NCA所用摩尔量。
9.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于化学式II的NCA与相对于化学式II的NCA所用摩尔量为1.1-1.5倍当量的化学式III的重碳酸盐进行反应。
10.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于将化学式III的重碳酸盐加入到相对于所用重碳酸盐的重量为0.5-2重量份数的溶剂中形成溶液，再将该溶液加入到反应介质中，所述反应介质包含溶剂的其它所需部分即待转化的化学式II的NCA和TEDA。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于在加入重碳酸盐期间，反应介质的温度保持在-20至5℃之间，有利的是在-10至0℃之间。
12.根据权利要求10或11的方法，其特征在于该方法随后包括下列连续步骤i)过滤反应介质；ii)通过减压蒸发除去至少80％、有利的是约90％的溶剂；随后iii)加入等于通过蒸发除去的反应溶剂量的非溶剂化合物，以使得化学式I的UNCA沉淀；和iv)根据需要，在除去所述保护基团后，通过过滤回收化学式I的UNCA。
13.根据权利要求12的方法，其特征在于在15至30℃的温度下通过减压蒸发除去溶剂。
14.根据权利要求12或13的方法，其特征在于所述非溶剂化合物是线型或支化的C5-C10烷烃。
15.根据权利要求12或14的方法，其特征在于随后在低于30℃的温度下真空干燥沉淀物。
全文摘要
本发明涉及制备氨酯保护的α－氨基酸N－羧酸酐的方法。本发明的方法使得能够在催化量的三乙撑二胺的存在下，不加入叔胺型碱而合成氨酯保护的α－氨基酸N－羧酸酐。
文档编号C07D263/44GK1839123SQ200480024157
公开日2006年9月27日 申请日期2004年8月17日 优先权日2003年8月22日
发明者埃尔夫·莱尔米特, 朱利安·格里马, 安托万·帕里斯 申请人:伊索凯姆公司