核糖核酸化合物及低聚核酸化合物的液相合成法的制作方法

专利名称：核糖核酸化合物及低聚核酸化合物的液相合成法的制作方法
技术领域：
本发明涉及对于液相合成可作为治疗药、诊断药或研究试剂使用的低聚RNA非常重要的磷酸三酯化的新的核糖核酸化合物。
背景技术：
低聚核酸化合物目前在治疗和诊断的方法中起着重要的作用。作为低聚核酸化合物的制法，一般已知的有3种方法。可例举Reese开发的磷酸三酯法(Tetrahedron 1978，34，3143)及Beaucage开发的亚磷酰胺法(amidite method，ァミダィト法)(Methods in Molecular BiologyProtocols forOligonucleotides and Analogs；Agrawal，ed.；Humana PressTotowa，1993，Vol.20，33-61)以及Froehler的H-磷酸酯法(Methods in MolecularBiologyProtocols for Oligonucleotides and Analogs；Agrawal，ed.；Humana PressTotowa，1993，Vol.20，63-80)。磷酸三酯法主要被用于液相合成，亚磷酰胺法及H-磷酸酯法主要被用于固相合成。
目前，在低聚核酸化合物的制备中所用的方法是固相法。固相法虽然容易实现低聚物的制备，但反应需在树脂上进行，这样对反应场所就有所限制，所以很难实现规模化。
为了供给大量的低聚核酸化合物，必须要开发出通过液相合成低聚核酸化合物的方法，但目前可大量供给的低聚核酸化合物只有低聚DNA，还未找到适合制备大量的低聚RNA的液相合成法。
为了进行低聚RNA的液相合成，必须能够大量供给被高度保护的核糖核酸化合物，它是可作为磷酸三酯法的原料使用的构成单体，其核糖3’位羟基为磷酸三酯体，而且在阶段性低聚物化的最终阶段，所有的保护基都能够很容易地脱保护。
作为低聚RNA合成所必须的构成单体的被高度保护的核糖核酸化合物的各官能团的保护基的必要条件如下所示。(1)低聚RNA可在缩合反应条件下稳定地存在；(2)分子内存在其它保护基时，各保护基可在不同条件下选择性地脱保护；(3)在低聚RNA可稳定地存在的条件下，能够容易地仅将保护基脱保护。
作为核糖2’位羟基的保护基，可例举例如叔丁基二甲基甲硅烷基等硅保护基，2-四氢呋喃基、2-四氢吡喃基等缩醛保护基。特别是缩醛保护基，可在低聚RNA的脱保护工序中，于不引发磷酸根移转及伴随该移转的短链化等副反应的pH2～4的温和的水性酸性条件下除去。
另一方面，作为核糖5’位羟基的保护基，可例举4，4’-二甲氧基三苯甲基、乙酰丙酰基(levulinyl)。作为核糖2’位羟基的保护基使用了缩醛保护基的情况下，在用于制备低聚RNA的最终的缩合工序中，如果作为核糖5’位羟基的保护基使用4，4’-二甲氧基三苯甲基，则在最后的脱保护工序中，可在酸性条件下除去这2种保护基。但是，在制备低聚RNA的中间步骤中，如果作为核糖5’位羟基的保护基使用4，4’-二甲氧基三苯甲基，则很难使缩醛保护基就这样存在，所以最好避免。
在核糖5’位羟基的保护基替换为乙酰丙酰基(CH3-CO-(CH2)2-CO-)的情况下，可通过在缩醛保护基不会脱去的中性条件下用肼进行处理来脱保护。
作为组合了这2种保护基(乙酰丙酰基和四氢呋喃基)的化合物，已知的有可用于低聚RNA的固相合成法的核糖3’位羟基被酰胺化的核糖核酸化合物(例如，参照非专利文献1)。
但是，可用于低聚RNA的液相合成法的核糖2’位羟基被缩醛保护、核糖5’位羟基被乙酰丙酰基化、核糖3’位羟基被磷酸三酯化的核糖核酸化合物还未找到。
以往，已知在核糖5’位羟基导入了乙酰丙酰基的化合物可采用化学方法制得。例如，已知对核糖2’位被四氢呋喃基保护、核糖3’位和5’位为羟基的核糖核酸化合物用乙酰丙酸和碘化2-氯-1-甲基吡啶进行反应的方法(例如，参照非专利文献1)。但是，该方法不能够选择性地仅将核糖5’位羟基乙酰丙酰基化，或者仅有核糖3’位羟基被乙酰丙酰基化，或者核糖3’位和5位两方的羟基都被乙酰丙酰基化。为了对它们进行分离必须实施精制工序等，作为目标的仅核糖5’位羟基被乙酰丙酰基化的化合物只能以低收率(30～68％)获得，要大量获得原料必须付出相当的时间和成本。
另一方面，已知与低聚RNA的合成无关的用脂酶使核糖3’位和5’位为羟基的核糖核酸化合物酰化的方法(例如，参照非专利文献2)。作为脂酶使用南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂酶B(CAL-B)，位置选择性地将核酸化合物的核糖5’位羟基酰化。此外，已知与低聚RNA的合成同样无关的、利用与上述相同的原理、对DNA或核糖2’位羟基用不易脱去的取代基(甲氧基乙氧基、甲基)取代的核酸化合物位置选择性地将核糖5’位羟基乙酰丙酰基化的方法(例如，参照专利文献1)。
但是，未找到对在核糖核酸化合物可稳定存在的条件下可脱保护的化合物用脂酶位置选择性地乙酰丙酰基化的方法，该化合物例如为核糖2’位的羟基具有在0～60℃的任一温度下、于pH2～4的酸性条件下、用24小时可脱离90％或90％以上的保护基的核糖核酸化合物，上述方法对于低聚RNA的合成是必须的。
非专利文献1Tetrahedron Vol.46，No.19，pp.6673-6688，1990非专利文献2Journal of Organic Chemistry Vol.58，No.3，pp.653-660，1993专利文献1WO 02/079215号小册子发明的揭示本发明的主要目的是提供对于低聚RNA的液相合成非常重要的磷酸三酯化的新的核糖核酸化合物。
此外，提供对于核糖2’位的羟基被在0～60℃的任一温度下、于pH2～4的酸性条件下、用24小时可脱离90％或90％以上的保护基保护的核糖核酸化合物，将核糖5’位的羟基位置选择性地乙酰丙酰基化的方法，该方法对于磷酸三酯化的核糖核酸化合物的制备非常重要。
此外，还提供新的低聚RNA的液相合成法。
本发明者进行认真研究后发现，通过用脂酶将核糖5’位羟基乙酰丙酰基化可实现上述目的，从而完成了本发明。
作为本发明，可例举以下的通式(1)表示的核糖核酸化合物(以下称为“本发明化合物”)，
式中，B表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶或者它们的修饰体，R20表示H或可被取代的烷基，R21表示可被取代的芳基或者单环或双环的可被取代的杂环基，R1表示在0～60℃的任一温度下、于pH2～4的酸性条件下、用24小时可脱离90％或90％以上的保护基，较好的是在15～40℃的任一温度下、于pH2～4的酸性条件下、用24小时可脱离90％或90％以上的保护基，更好的可例举2-四氢呋喃基或1，3-二氧戊环-2-基。
R20表示的“烷基”例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷基，可例举例如甲基、乙基、异丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。R20表示的“烷基”可被取代，该取代基例如为选自卤素、烷基、烷氧基、氰基及硝基的1～3个相同或不同的取代基。作为该“烷基”的取代基的“卤素”，可例举例如氟、氯、溴、碘。作为该“烷基”的取代基的“烷基”，例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷基，可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。作为该“烷基”的取代基的“烷氧基”，例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷氧基，可例举例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。R20较好为2-氰基乙基、2，2，2-三氯乙基、2，2，2-三溴乙基。
R21表示的“芳基”例如为碳原子数6～12的芳基，可例举例如苯基、1-萘基、2-萘基、联苯基。该“芳基”可被取代，该取代基例如为选自卤素、烷基、烷氧基、氰基及硝基的1～3个相同或不同的取代基。作为该“芳基”的取代基的“卤素”，可例举例如氟、氯、溴、碘。作为该“芳基”的取代基的“烷基”，例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷基，可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。作为该“芳基”的取代基的“烷氧基”，例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷氧基，可例举甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。其中，较好为2-氯苯基、2-氯-4-叔丁基苯基。
作为R21表示的“单环或双环的可被取代的杂环基”，可例举例如含有1～3个选自氮原子、氧原子和硫原子的杂原子、可具有1～6个不饱和键的5～12元的单环基或稠环基。作为其取代基，可例举例如选自烷基、烷氧基、卤素、硝基的1～3个相同或不同的取代基。作为该“单环或双环的可被取代的杂环基”的取代基的“卤素”，可例举例如氟、氯、溴、碘。作为该“单环或双环的可被取代的杂环基”的取代基的烷基，例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷基，可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。作为该“单环或双环的可被取代的杂环基”的取代基的“烷氧基”，例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷氧基，可例举甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。R21较好为1-苯并三唑基、1-吗啉基。
这里，“修饰体”是指杂环的碱部分被任意的取代基取代的化合物。
B表示的修饰体中的取代基可例举例如选自卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基及硝基的1～3个相同或不同的取代基。
B表示的修饰体中的“烷氧基”例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷氧基，可例举甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。其中，较好的是碳原子数1～4的烷氧基，尤其好的是甲氧基。“烷氧基烷基”中的烷氧基部分可例举与上述B的修饰体涉及的“烷氧基”相同的烷氧基。
B表示的修饰体中的“卤素”可例举例如氟、氯、溴、碘。
B表示的修饰体中的“烷基”例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷基，可例举甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。“芳烷基”、“烷氧基烷基”、“一烷基氨基”、“二烷基氨基”的烷基部分也可例举与上述B的修饰体中的“烷基”同样的烷基。B表示的修饰体中的“烷基”可被取代，该取代基可例举例如选自卤素、烷基、烷氧基、氰基及硝基的1～3的相同或不同的取代基。作为该“烷基”的取代基的“卤素”，可例举例如氟、氯、溴、碘。作为该“烷基”的取代基的“烷基”，例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷基，可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。作为该“烷基”的取代基的“烷氧基”，例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷氧基，可例举例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。
B表示的修饰体中的“芳烷基”的“芳基”，例如为碳原子数6～12的芳基，可例举例如苯基、1-萘基、2-萘基、联苯基。B表示的修饰体中的“芳烷基”的“芳基”可被取代，该取代基可例举例如选自卤素、烷基、烷氧基、氰基及硝基的1～3的相同或不同的取代基。作为该“芳基”的取代基的“卤素”，可例举例如氟、氯、溴、碘。作为该“芳基”的取代基的“烷基”，例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷基，可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。作为该“芳基”的取代基的“烷氧基”，例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷氧基，可例举例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。
作为B表示的修饰体中的“酰基”，可例举例如直链状或支链状的碳原子数1～6的烷酰基、碳原子数7～13的芳酰基。可例举例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、己酰基、苯甲酰基、萘甲酰基。B表示的修饰体中的“酰基”可被取代，该取代基可例举例如选自卤素、烷基、烷氧基、氰基及硝基的1～3的相同或不同的取代基。作为该“酰基”的取代基的“卤素”，可例举例如氟、氯、溴、碘。作为该“酰基”的取代基的“烷基”，例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷基，可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。作为该“酰基”的取代基的“烷氧基”，例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷氧基，可例举例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。例如，B为腺嘌呤、胞嘧啶及鸟嘌呤时，通过用酰基取代氨基，酰基起到保护基的作用。具体来讲，对于腺嘌呤、胞嘧啶，可例举例如4-茴香酰基，对于鸟嘌呤，可例举例如异丁酰基。
本发明也可直接使用，还可通过常规方法以盐的形式使用。该“盐”可例举例如钠盐、钾盐等碱金属盐，钙盐等碱土金属盐或三乙胺、吡啶等有机叔胺盐。
作为本发明化合物的具体例，可例举以下(1)～(8)的核糖核酸化合物。
(1)5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯(2)5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷-3’-基磷酸2-氯苯酯(3)5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯(4)5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷-3’-基磷酸2-氯苯酯(5)5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯(6)5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷-3’-基磷酸2-氯苯酯(7)5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯(8)5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷-3’-基磷酸2-氯苯酯此外，本发明例如还可例举具有以下(A)～(C)中的任一工序、位置选择性地将核糖5’位的羟基乙酰丙酰基化的核糖核酸化合物的制法。
(A)以下的通式(3)表示的核糖核酸化合物的制法，该制法的特征是，通过使乙酰丙酰基化试剂和脂酶与以下的通式(2)表示的核糖核酸化合物反应，位置选择性地将5’位的羟基乙酰丙酰基化， 式中，B、R1如前所述。
(B)通过使磷酸化试剂作用于以下的通式(3)表示的核糖核酸化合物而制得以下的通式(1a)表示的核糖核酸化合物的方法，该通式(3)表示的核糖核酸化合物的制备所使用的制法的特征在于，具有通过使乙酰丙酰基化试剂和脂酶与以下的通式(2)表示的核糖核酸化合物反应、位置选择性地将5’位的羟基乙酰丙酰基化的工序，
式中，B、R1、R21如前所述。
(C)通过使磷酸化试剂及保护磷酸基的试剂作用于以下的通式(3)表示的核糖核酸化合物而制得以下的通式(1b)表示的核糖核酸化合物的方法，该通式(3)表示的核糖核酸化合物的制备所使用的制法的特征在于，具有通过使乙酰丙酰基化试剂和脂酶与以下的通式(2)表示的核糖核酸化合物反应、位置选择性地将5’位的羟基乙酰丙酰基化的工序， 式中，B、R1、R21如前所述，R22表示可取代的烷基。
作为R22表示的“烷基”及其取代基，可例举例如与前述R20相同的基团。
作为本发明所述的“脂酶”，可例举例如适合于各种底物的脂酶。较好的是南极假丝酵母脂酶B(Novozym435Novo·Nordisk公司制)、产碱杆菌属三酰甘油脂酶(Alcaligenes triacylglycerol lipase)(LIPASE-QL名糖产业株式会社制)。
本发明中的“乙酰丙酰基化试剂”可例举例如乙酰丙酸、乙酰丙酸酐、乙酰丙酸酯、乙酰丙酰卤化物。该“乙酰丙酸酯”可例举例如乙酰丙酸甲酯、乙酰丙酸乙酯、乙酰丙酸乙烯酯。该“乙酰丙酰卤化物”可例举乙酰丙酰氟、乙酰丙酰氯、乙酰丙酰溴、乙酰丙酰碘。其中，较好的是乙酰丙酸酐。
本发明中的“磷酸化试剂”可例举例如2-氯苯基偶磷三唑(phosphoroditriazolide)、2-氯苯基-O，O-双(1-苯并三唑基)磷酸酯或2-氯-4-叔丁基苯基偶磷三唑。
作为“保护磷酸基的试剂”，可例举例如3-羟基丙腈或2，2，2-三氯乙醇。
此外，本发明可例举例如具有以下的(a)～(f)工序的下述通式(4)表示的低聚核酸化合物的液相合成法，
式中，各Bx独立地表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶或它们的修饰体，q表示1～100的范围内的整数，q较好为10～50范围内的整数，更好为15～30范围内的整数，各R’中至少一个为羟基，除此以外独立地表示H或羟基。
Bx表示的修饰体中的取代基可例举例如选自卤素、烷基、芳烷基、烷氧基、羟基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基及硝基的1～3个相同或不同的取代基。
Bx表示的修饰体中的“卤素”、“烷基”、“烷氧基”、“芳烷基”中的“芳基”与前述B相同。
(a)通过使乙酰丙酰基化试剂和脂酶作用于以下的通式(2)表示的核糖核酸化合物，位置选择性地将5’位的羟基乙酰丙酰基化，制备以下的通式(3)表示的核糖核酸化合物的工序， 式中，B、R1如前所述，“脂酶”和“乙酰丙酰基化试剂”也如前所述。
(b)通过使磷酸化试剂作用于利用上述(a)的工序制得的核糖核酸化合物(3)，将3’位的羟基磷酸化，制备以下的通式(1a)表示的核糖核酸化合物的工序，
式中，B、R1、R21如前所述，“磷酸化试剂”也如前所述。
(c)与上述(b)不同，通过使磷酸化试剂和保护磷酸基的试剂作用于利用上述(a)的工序制得的核糖核酸化合物(3)，制备以下的通式(1b)表示的核糖核酸化合物的工序， 式中，B、R1、R21、R22、“磷酸化试剂”和“保护磷酸基的试剂”如前所述。
(d)除去利用上述工序(c)制得的核糖核酸化合物(1b)的保护核糖5’位的羟基的乙酰丙酰基，制备以下的通式(5)表示的核糖核酸化合物的工序， 式中，B、R1、R21、R22如前所述，本发明中的“除去乙酰丙酰基的试剂”可例举例如0.5M肼一水合物/吡啶-乙酸(4∶1)溶液。
(e)将通过上述(b)或(d)的工序制备的核糖核酸化合物(1a)或(5)中的至少一种作为构成单体使用的阶段性低聚物化的工序。
“构成单体”是指构成低聚核酸化合物的脱氧核糖核酸化合物、核糖核酸化合物或其修饰体。
“构成单体”中的“修饰体”可例举与前述同样的修饰体。
“阶段性低聚物化”包括用于制备核酸聚合度为2～101的低聚核酸化合物或核酸聚合度为2～100的低聚核酸嵌段的缩合工序和选择性脱保护工序，缩合工序可例举核酸单体嵌段间的缩合工序、核酸单体嵌段和核酸聚合度为2～100的低聚核酸嵌段间的缩合工序或者核酸聚合度为2～99的不同的低聚核酸嵌段间的缩合工序。具体来讲，根据作为目标的低聚核酸化合物的核酸聚合度，通过将任意选择的核酸单体嵌段或低聚核酸嵌段缩合，可制得低聚核酸化合物。例如，制备核酸聚合度为30的低聚核酸时，可考虑使用核酸单体嵌段和核酸聚合度为29的低聚核酸嵌段的制法，或者核酸聚合度为5的低聚核酸嵌段和核酸聚合度为25的低聚核酸嵌段的制法。
“核酸单体嵌段”是指用于制备低聚核酸化合物的脱氧核糖核酸化合物、核糖核酸化合物或它们的修饰体。“修饰体”可例举与前述相同的化合物。
“低聚核酸嵌段”是指以用于合成低聚核酸化合物的脱氧核糖核酸化合物、核糖核酸化合物或它们的修饰体作为构成单体的核酸聚合度为2～100的化合物。“修饰体”可例举与前述相同的化合物。
“核酸聚合度”表示构成低聚核酸化合物的核酸单体的总数。
本发明所用的“核酸单体嵌段”、“低聚核酸嵌段”可例举以下的通式(8)和(9)的化合物。
以下的通式(8)表示的化合物表示核酸单体嵌段(m＝0)或低聚核酸嵌段(m＝1～99)， 式中，各B’独立地表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶或它们的修饰体，各B’表示的“修饰体”中的取代基可例举与前述B相同的基团，R2表示酰基、可被取代的磷酸基，各Rk1独立地表示可被取代的芳基或单环或双环的可被取代的杂环基，Rk1表示的“芳基”、其取代基、“单环或双环的可被取代的杂环基”及其取代基可例举与前述R21相同的基团，m表示0～99范围内的整数。
R2表示的“酰基”例如为直链状或支链状的碳原子数1～6的烷酰基、碳原子数7～13的芳酰基，可例举例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、己酰基、苯甲酰基、萘甲酰基。R2表示的“酰基”可被取代，该取代基可例举选自卤素、烷基、烷氧基、氰基及硝基的1～3的相同或不同的取代基。作为该“酰基”的取代基的“卤素”，可例举例如氟、氯、溴、碘。作为该“酰基”的取代基的“烷基”，例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷基，可例举甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。作为该“酰基”的取代基的“烷氧基”，例如为直链状或支链状的碳原子数1～4的烷氧基，可例举例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。
作为R2表示的“可被取代的磷酸基”的取代基，可例举可被取代的芳基、单环或双环的可被取代的杂环基或可被取代的烷基。“芳基”、其取代基、“单环或双环的可被取代的杂环基”及其取代基可例举与前述R21相同的基团。作为“烷基”及其取代基，可例举与前述R22相同的基团。各R表示H或被保护基取代的羟基，该保护基在0℃～60℃的任一温度下、于pH 2～4的酸性条件下、用24小时可脱离90％或90％以上。更好的是H、被2-四氢呋喃基或1，3-二氧戊环-2-基取代的羟基。
以下的通式(9)表示的化合物为核酸单体嵌段(n＝1)或低聚核酸嵌段(n＝2～100)， 式中，各B’、各R如前所述，各Rk2独立地表示可被取代的芳基或者单环或双环的可被取代的杂环基，Rk2表示的“芳基”、其取代基、“单环或双环的可被取代的杂环基”及其取代基可例举与前述R21相同的基团，R3表示乙酰丙酰基或4，4’-二甲氧基三苯甲基，n表示1～100范围内的整数。
“缩合工序”可分为以下的4种。
(i)核酸单体嵌段和核酸单体嵌段的缩合工序核酸单体嵌段的至少一方为核糖核酸化合物(1a)或(5)的核酸单体嵌段间的缩合工序。
(ii)核酸单体嵌段和核酸聚合度为2～100的低聚核酸嵌段的缩合工序(1)核酸单体嵌段为核糖核酸化合物(1a)或(5)，核酸聚合度为2～100的低聚核酸嵌段为化合物(8)或(9)的核酸单体嵌段和核酸聚合度为2～100的低聚核酸嵌段的缩合工序。
(iii)核酸单体嵌段和核酸聚合度为2～100的低聚核酸嵌段的缩合工序(2)核酸单体嵌段为化合物(8)或(9)，核酸聚合度为2～100的低聚核酸嵌段(8)或(9)作为构成单体包含核糖核酸化合物(1a)或(5)的至少一方的核酸单体嵌段和核酸聚合度为2～100的低聚核酸嵌段的缩合工序。
(iv)核酸聚合度为2～99的不同的低聚核酸嵌段间的缩合工序核酸聚合度为2～99的低聚核酸嵌段(8)或(9)作为构成单体包含核糖核酸化合物(1a)或(5)的至少一方的核酸聚合度为2～99的不同的低聚核酸嵌段(8)和(9)的缩合工序。
上述(i)～(iv)表示的缩合工序是使缩合试剂作用于核酸单体嵌段或低聚核酸嵌段的5’位羟基与在其它的核酸单体嵌段或低聚核酸嵌段的3’位羟基上取代的磷酸基而进行缩合的工序。
本发明的“缩合试剂”可例举例如1-(2-均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1，2，4-三唑、2，4，6-三甲基苯磺酰基四唑或1-(2，4，6-三异丙基苯磺酰基)-3-硝基-1，2，4-四唑。
“选择性脱保护工序”是指除去在通过缩合工序制得的低聚核酸化合物中的5’位末端构成单体的5’位羟基取代的保护基、例如乙酰丙酰基或者在3’末端构成单体的3’位羟基取代的磷酸基的保护基、例如氰乙基的工序。
“除去乙酰丙酰基的试剂”如前所述。
本发明中的“除去氰乙基的试剂”可例举例如吡啶-三乙胺-水(3∶1∶1)溶液，所述氰乙基为在核糖3’位羟基取代的磷酸基上的保护基。
作为制得的被保护的低聚核酸化合物的具体例，可例举例如以下的通式(6)表示的化合物，
式中，各B’分别独立，其含义如前所述；各R0独立地表示H、可被取代的芳基或者单环或双环的可被取代的杂环基，较好的是独立地表示H、可被取代的苯基或者单环或双环的可被取代的杂环基，更好的是2-氯苯基或2-氯-4-叔丁基苯基，R0表示的“芳基”、“单环或双环的可被取代的杂环基”及其取代基可例举与前述R21相同的基团，R3a表示H、乙酰丙酰基或4，4’-二甲氧基三苯甲基，q如前所述；各R1a中至少一个为被在0℃～60℃的任一温度下于pH 2～4的酸性条件下用24小时可脱离90％或90％以上的保护基取代的羟基，除此以外独立地表示H或被在0℃～60℃的任一温度下于pH 2～4的酸性条件下用24小时可脱离90％或90％以上的保护基取代的羟基，较好的是H或被在15℃～40℃的任一温度下于pH 2～4的酸性条件下用24小时可脱离90％或90％以上的保护基取代的羟基，更好的是H、被2-四氢呋喃基或1，3-二氧戊环-2-基取代的羟基；R2a表示酰基或以下的通式(7)表示的磷酸基， 式中，R2aa表示可被取代的芳基或者单环或双环的可被取代的杂环基，R2ab表示H或可被取代的烷基，R2aa表示的“芳基”、其取代基、“单环或双环的可被取代的杂环基”及其取代基可例举与前述R21相同的基团。较好的是2-氯苯基或2-氯-4-叔丁基苯基，R2ab表示的“烷基”及其取代基可例举与前述R22相同的基团；R2a表示的“酰基”可例举与前述R2相同的基团。
(f)将通过上述(e)的工序制得的被保护起来的低聚核酸化合物(6)的保护基全部除去的工序。
用于除去各保护基的试剂如下所述1)N1，N1，N3，N3-四甲基胍及吡啶-2-醛肟(pyridine-2-carboxaldoxime)，2)浓氨水，3)乙酸缓冲液(pH＝3～4)，4)80％乙酸水溶液，5)稀盐酸溶液(pH2～4)。
但是，对于3)～5)的试剂，使用其中1种即可，较好的是使用3)。
“乙酸缓冲液”可例举例如乙酸钠-乙酸缓冲液或四甲基乙二胺-乙酸缓冲液。
实施发明的最佳方式本发明可以如下进行实施。
以下的制法中，在原料具有不想让其反应的取代基(例如，羟基、氨基、羧基)时，一般预先通过公知的方法用保护基(例如，苯甲酰基或4-茴香酰基)对原料进行保护后再将其用于反应。反应后，可通过催化还原、碱处理、酸处理等公知方法除去保护基。
工序(a)(将核糖核酸的核糖5’位羟基乙酰丙酰基化的制法) 式中，B、R1、“脂酶”和“乙酰丙酰基化试剂”如前所述。
本发明的在核糖核酸5’位的羟基导入乙酰丙酰基的方法中，通过将化合物(2)和过量的乙酰丙酰基化试剂悬浮于适当的溶剂中，使其与脂酶反应，能够选择性地获得将所希望的核糖5’位羟基乙酰丙酰基化的生成物(3)。
乙酰丙酰基化试剂的用量较好为化合物(2)的1～20倍摩尔量，更好为1～10倍摩尔量。
所用溶剂只要不会影响到反应即可，无特别限定，可例举例如四氢呋喃、乙醚、1，4-二烷等醚类，N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺等酰胺类，乙腈、丙腈等腈类，苯、甲苯等烃类或它们的混合溶剂。
上述反应的反应温度为酶活性的最适温度，较好为20～50℃。反应时间根据所用原料的种类、反应温度有所不同，通常较好为30分钟～100小时。
工序(b)(将核糖核酸的核糖3’位羟基磷酸衍生物化的制法1)
式中，B、R1、R21、“磷酸化试剂”如前所述。
本发明中，通过使磷酸化试剂在有机碱存在下作用于核糖核酸化合物(3)可制得被高度保护的核糖核酸化合物(1a)。所用溶剂只要不会影响到反应即可，无特别限定，可例举例如四氢呋喃、乙醚、1，4-二烷等醚类，乙腈、丙腈等腈类，苯、甲苯等烃类或它们的混合溶剂。磷酸导入试剂的用量为化合物(3)的1～20倍摩尔量，更好为1～10倍摩尔量。
反应温度例如较好为-20℃～100℃，更好为0℃～80℃，特别好为5℃～30℃。反应时间根据所用原料的种类和反应温度有所不同，通常较好为30分钟～100小时。
工序(c)(将核糖核酸的核糖3’位羟基磷酸衍生物化的制法2) 式中，B、R1、R21、R22、“磷酸化试剂”、“保护磷酸基的试剂”如前所述。
本发明中，通过使磷酸化试剂和保护磷酸基的试剂在有机碱存在下作用于核糖核酸化合物(3)可制得被高度保护的核糖核酸化合物(1b)。所用溶剂只要不会影响到反应即可，无特别限定，可例举例如四氢呋喃、乙醚、1，4-二烷等醚类，乙腈、丙腈等腈类，苯、甲苯等烃类或它们的混合溶剂。磷酸导入试剂的用量为化合物(3)的1～20倍摩尔量，更好为1～10倍摩尔量。保护磷酸基的试剂的用量为化合物(3)的1～20倍摩尔量，更好为1～10倍摩尔量。反应温度例如较好为-20℃～100℃，更好为0℃～80℃，特别好为5℃～30℃。反应时间根据所用原料的种类和反应温度有所不同，通常较好为30分钟～100小时。
工序(d)(除去保护核糖5’位羟基的乙酰丙酰基的工序) 式中，B、R1、R21、R22、“除去乙酰丙酰基的试剂”如前所述。
通过在化合物(1b)中加入除去乙酰丙酰基的试剂，可制得化合物(5)。本反应在无溶剂条件下或适当的溶剂中进行。所用溶剂只要不会影响到反应即可，无特别限定，可例举例如甲醇、乙醇等醇类，四氢呋喃、乙醚、1，4-二烷等醚类，乙腈、丙腈等腈类，N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺等酰胺类，乙腈、丙腈等腈类，苯、甲苯等烃类或它们的混合溶剂。用于除去乙酰丙酰基的试剂的用量为化合物(1b)的1～20倍摩尔量，更好为1～10倍摩尔量。反应温度例如较好为-20℃～100℃，更好为0℃～80℃，特别好为15℃～65℃。反应时间根据所用原料的种类和反应温度有所不同，通常较好为30分钟～100小时。
低聚核酸化合物的液相合成法如下所示。
工序(e)(阶段性低聚核酸的制备方法1)本工序是在低聚核酸化合物的阶段性制备过程中、作为构成单体使用通式(1a)或(5)表示的核糖核酸化合物中的至少一方的阶段性低聚物化。阶段性低聚物化由缩合工序和选择性脱保护工序组成。
缩合工序中，通过使缩合试剂作用，可制得低聚核酸化合物或低聚核酸嵌段。通常在适当的溶剂中，在过量的有机胺存在下进行反应。所用溶剂只要不会影响到反应即可，无特别限定，可例举例如四氢呋喃、乙醚、1，4-二烷等醚类，乙腈、丙腈等腈类，苯、甲苯等烃类，吡啶等有机胺类或它们的混合溶剂。有机胺可例举吡啶等。缩合试剂的用量为(1a)、(5)表示的核糖核酸化合物或(8)、(9)表示的核酸单体嵌段或低聚核酸嵌段的1～20倍摩尔量，更好为1～10倍摩尔量。上述反应中的反应温度例如较好为-20℃～100℃，更好为0℃～80℃，特别好为5℃～30℃。反应时间根据所用原料的种类和反应温度有所不同，通常较好为30分钟～100小时。
选择性脱保护工序是采用脱保护试剂对由上述缩合工序制得的低聚核酸嵌段进行脱保护处理使其可用于其后的缩合工序，制得被选择性地脱保护的低聚核酸嵌段的工序。具体来讲，它是除去在上述缩合工序制得的低聚核酸嵌段中在5’末端的核酸分子5’位羟基取代的保护基、例如乙酰丙酰基，或者在3’末端的核酸分子3’位羟基取代的磷酸基上的保护基、例如氰乙基的工序。
“除去乙酰丙酰基的试剂”、“除去氰乙基的试剂”如前所述。
特别是在最终的核糖核酸化合物的制备工序中，较好是在缩合过程中使用R3具备4，4-二甲氧基三苯甲基这样的脂溶性非常高的保护基的通式(8)、(9)表示的核酸单体嵌段或低聚核酸嵌段。反应结束后，较好是在精制过程中进行与来自核酸化合物的杂质分离的工序，由于在脱保护工序中，能够在与各核糖2’位的保护基相同的条件下进行脱保护，所以具备可减少工序的优点。
工序(f)(阶段性低聚核酸的制备方法2) 式中，各Bx、R’、R0、R1a、R2a、R3a、q如前所述。
通过在化合物(6)中加入除去各保护基的试剂，并进行反应，能够获得化合物(4)。所用溶剂只要不会影响到反应即可，无特别限定，可例举例如四氢呋喃、乙醚、1，4-二烷等醚类，吡啶等有机胺类，28％氨水溶液或它们的混合溶剂。作为有机胺可例举吡啶等。上述反应中的反应温度例如较好为-20℃～100℃，更好为0℃～80℃，特别好为10℃～60℃。反应时间根据所用原料的种类和反应温度有所不同，通常较好为30分钟～100小时。
可通过采用通常的分离精制方法，例如萃取、浓缩、中和、过滤、离心分离、重结晶、硅胶柱色谱法、薄层色谱法、反相ODS柱色谱法、疏水柱色谱法、离子交换柱色谱法、凝胶过滤柱色谱法、透析、超过滤等方法从上述反应混合物中分离精制得到本发明的化合物。
实施例以下，揭示参考例和实施例，对本发明进行更详细的说明，但本发明并不仅限于此。
参考例12’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷工序1 3’，5’-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-三甲基甲硅烷基-N4-(4-茴香酰基)胞苷的合成将20.0g胞苷悬浮于200ml无水吡啶中，滴加1，3-二氯-1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷27.2g并搅拌10分钟后，将温度回复至室温，搅拌90分钟。于0℃在反应液中滴加20.6g氯化三甲基硅烷，室温下搅拌2小时。然后，滴加4-茴香酰氯28.1g，室温下搅拌1.5小时后，在反应液中加入60ml冰水，搅拌10分钟后加入25ml氨水，室温下搅拌30分钟。将反应液注入400ml水中，用二氯甲烷萃取，用饱和碳酸氢钠水溶液及饱和食盐水对二氯甲烷层进行洗涤，干燥，浓缩。所得残渣用硅胶柱色谱法(正己烷∶乙酸乙酯＝3∶1～1∶1)精制，获得上述化合物39.5g。
工序2 3’，5’-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷的合成将39.5g 3’，5’-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-三甲基甲硅烷基-N4-(4-茴香酰基)胞苷溶于200ml二氯甲烷和200ml甲醇中，加入7.2g对甲苯磺酸吡啶，于65℃搅拌3小时。加入三乙胺进行中和，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(正己烷∶乙酸乙酯＝1∶2～1∶4)精制，获得上述化合物34.0g。
工序3 3’，5’-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷的合成将30.0g 3’，5’-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷和10.2g 2，3-二氢呋喃溶于150ml无水四氢呋喃，于0℃每次少量地加入总量为5.62g的樟脑磺酸，室温下搅拌1小时。注入饱和碳酸氢钠水溶液中后，用乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤后干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(正己烷∶乙酸乙酯＝1∶3)精制，获得上述化合物31.5g。
工序4 2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷的合成将33.2g 3’，5’-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷溶于80ml无水四氢呋喃，用15分钟滴加1M氟化四正丁基铵/四氢呋喃溶液97ml，室温下搅拌1小时。浓缩反应液，加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取，用饱和食盐水洗涤后干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(3％甲醇/二氯甲烷～5％甲醇/二氯甲烷)精制，获得目标化合物7.11g。
参考例2胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰胸苷3’-乙酸酯工序1 3’-O-乙酰基胸苷的合成将2.0g 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷和吡啶共沸后，于0℃加入0.75g乙酸酐，室温下搅拌21小时。浓缩后溶于氯仿，用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩。残渣用正己烷洗涤，干燥，获得5’-(4，4-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-乙酰基胸苷1.84g。
将1.84g上述5’-(4，4-二甲氧基三苯甲基)-3’-O-乙酰基胸苷溶于30ml二氯甲烷，于O℃滴加0.38M苯磺酸/甲醇16.5ml，搅拌15分钟。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取，干燥，浓缩。残渣用乙醚洗涤，干燥，获得上述化合物0.32g。
工序2 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷-3’-基磷酸2-氯苯酯三乙胺盐的合成将2.0g 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷和吡啶共沸后，加入0.28M的2-氯苯基偶磷三唑/二烷溶液20ml，室温下搅拌1小时。然后，加入50％吡啶水溶液8ml浓缩。在残渣中加入0.2M碳酸氢三乙铵水溶液20ml，用二氯甲烷萃取。二氯甲烷层用20ml 0.2M碳酸氢三乙铵洗涤2次，干燥，浓缩。残渣用乙酸乙酯、正己烷重结晶，干燥，获得上述化合物1.88g。
工序3 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰胸苷3’-乙酸酯的合成将5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷-3’-基磷酸2-氯苯酯三乙胺盐及3’-O-乙酰基胸苷和吡啶共沸后，将其溶于3ml无水吡啶，加入1-(2-均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)0.71g，室温下搅拌1小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(2％甲醇/氯仿～4％甲醇/氯仿，含有0.1％吡啶)精制，获得上述化合物1.06g。
工序4胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰胸苷3’-乙酸酯的合成将1.05g 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰胸苷3’-乙酸酯溶于10ml二氯甲烷，于0℃滴加0.38M苯磺酸/甲醇溶液5.2ml，搅拌30分钟。反应液用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩，获得目标化合物0.69g。
参考例35’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷-3’-基磷酸2-氯苯酯三乙胺盐工序1 N2-异丁酰基鸟苷的合成将20.0g鸟苷悬浮于540ml氯仿和70ml吡啶，滴加异丁酰氯48ml，室温下搅拌2小时。冰水冷却搅拌下，在反应液中加入1N盐酸，用二氯甲烷萃取。有机层用水洗涤后再用1N碳酸钠水溶液洗涤。然后，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩。残渣用甲苯共沸后，将其溶于54ml甲醇，冰水冷却搅拌下慢慢滴加28％甲醇钠/甲醇溶液54ml，搅拌10分钟。反应液用离子交换树脂Dowex(H型)中和后，过滤，除去Dowex，用甲醇充分洗涤。接着，合并母液和洗液，减压下浓缩。将残渣溶于少量甲醇，再将其慢慢滴入丙酮中，形成粉末。收集所得粉末，获得上述化合物17.9g。
MS m/z354[MH]+工序2 3’，5’-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-N2-异丁酰基鸟苷的合成将16.9g N2-异丁酰基鸟苷溶于100ml吡啶，冰水冷却搅拌下滴加1，3-二氯-1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷16.6g，室温下搅拌4小时。将反应液滴加入水中，收集所得结晶，干燥。粗结晶用乙醇重结晶，获得上述化合物30.3g。
熔点179～183℃MS m/z596[MH]+工序3 2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷的合成将30.0g 3’，5’-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-N2-异丁酰基鸟苷溶于330ml四氢呋喃，再加入2，3-二氢呋喃7.83g和(+)-樟脑磺酸6.49g，室温下搅拌2小时后，在冰水冷却搅拌下滴加1M氟化四正丁基铵/四氢呋喃溶液55.0ml，搅拌10分钟。减压下浓缩反应液后，用硅胶柱色谱法(1％甲醇/二氯甲烷～2％甲醇/二氯甲烷)精制，获得上述化合物20.2g。
熔点178～180℃MS m/z424[MH]+
工序4 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷的合成将0.70g 2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷和吡啶共沸后，将其悬浮于15ml四氢呋喃和1.34ml吡啶中，在冰水冷却搅拌下，加入4，4’-二甲氧基三苯甲基氯0.61g，室温下搅拌4小时。将反应液注入饱和碳酸氢钠水溶液中，用二氯甲烷萃取。有机层用饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(二氯甲烷～1％甲醇/二氯甲烷)精制，获得上述化合物1.00g。
工序5 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷-3’-基磷酸2-氯苯酯三乙胺盐的合成使用参考例2的工序2合成的化合物来替代参考例2的工序2中的5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷，进行同样的反应，获得目标化合物。
实施例15’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷将7.0g 2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷悬浮于280ml无水四氢呋喃中，加入10.1g的乙酰丙酸酐和2.78g的Novozym435，室温下振荡25小时。然后，追加3.0g的乙酰丙酸酐和1.0g的Novozym435，室温下振荡72小时。反应液用硅藻土过滤，再用二氯甲烷洗涤，在滤液中加入饱和碳酸氢钠水溶液搅拌15小时后分液，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(2％甲醇/二氯甲烷)精制，获得目标化合物6.02g。
实施例25’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯在3.0g 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷中加入0.56M的2-氯苯基偶磷三唑/二烷溶液19.5ml溶解。然后，加入1-甲基咪唑0.90g，室温下搅拌1小时。加入3-羟基丙腈1.56g，室温下搅拌2小时。于0℃加入50％吡啶水溶液5ml搅拌5分钟后，将反应液注入饱和碳酸氢钠水溶液中，用二氯甲烷萃取，用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤后干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(正己烷∶乙酸乙酯＝20∶80～15∶85)，精制，获得目标化合物3.16g。
MS m/z789.3[MH]+实施例3
5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷-3’-基磷酸2-氯苯酯三乙胺盐在3.0g 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷中加入0.56M的2-氯苯基偶磷三唑/二烷溶液19.5ml溶解。然后，加入1-甲基咪唑0.90g，室温下搅拌1小时。于0℃加入50％吡啶水溶液10ml搅拌10分钟后浓缩，在残渣中加入0.2M碳酸氢三乙铵水溶液35ml，用二氯甲烷萃取，用15ml 0.2M碳酸氢三乙铵水溶液对二氯甲烷层洗涤2次，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(10％甲醇/二氯甲烷～15％甲醇/二氯甲烷)精制，获得目标化合物4.03g。
实施例45’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷将5.70g 2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷悬浮于270ml丙腈，加入乙酰丙酸酐8.66g和2.40g的Novozyme AS，室温下搅拌15小时。过滤反应液，除去Novozyme AS，用二氯甲烷充分洗涤。合并母液和洗液，加入几乎同体积的饱和碳酸氢钠水溶液，彻夜剧烈搅拌。有机层用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，再用饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩。将残渣溶于少量的二氯甲烷，将其慢慢滴加入正己烷和乙醚的等量混合溶剂中，形成粉末。收集所得粉末，用正己烷和乙醚的等量混合溶剂洗涤，获得上述化合物6.80g。
MS m/z522[MH]+实施例55’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯用5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷替代实施例2的5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷，进行同样的反应，获得目标产物。
实施例65’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷-3’-基磷酸2-氯苯酯三乙胺盐用5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷替代实施例3的5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷，进行同样的反应，获得目标产物。
实施例75’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯用5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷替代实施例2的5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷，进行同样的反应，获得目标产物。
实施例85’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷-3’-基磷酸2-氯苯酯三乙胺盐用5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷替代实施例3的5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷，进行同样的反应，获得目标产物。
实施例95’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6(4-茴香酰基)腺苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯用5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷替代实施例2的5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷，进行同样的反应，获得目标产物。
实施例105’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷-3’-基磷酸2-氯苯酯三乙胺盐用5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷替代实施例3的5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷，进行同样的反应，获得目标产物。
实施例11腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胸苷酰-[3’→5’]-胸苷(A)低聚核酸嵌段A(2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯)工序1 2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯的合成在3.16g 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯中加入0.5M肼/吡啶-乙酸(4∶1)溶液40ml溶解，室温下搅拌20分钟。于0℃加入丙酮10ml搅拌5分钟后，用200ml乙酸乙酯稀释，将其注入饱和碳酸氢钠水溶液中分液。乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(二氯甲烷～5％甲醇/二氯甲烷)精制，获得上述化合物2.43g。
工序2 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]的合成将1.95g 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷-3’-基磷酸2-氯苯酯三乙胺盐及1.38g 2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯和吡啶共沸后，将其溶于3ml无水吡啶中，加入1-(2-均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)1.42g，室温下搅拌1小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(2％甲醇/氯仿～4％甲醇/氯仿，含有0.1％吡啶)精制，获得上述化合物2.21g。
工序3 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-[O-(2-氯苯基)磷酸酯]三乙胺盐的合成在2.2g实施例11(A)的工序2合成的化合物中加入吡啶-三乙胺-水(3∶1∶1)的溶液32ml，室温下搅拌30分钟。浓缩反应液，干燥，获得上述化合物2.43g。
工序4 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯基)磷酸基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯的合成使用实施例11(A)工序3的化合物和参考例3的化合物，与实施例11(A)工序2同样地进行反应，获得目标产物。
工序5 2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯基)磷酸基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯的合成用5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯基)磷酸基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯替代实施例11(A)工序1的5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯，进行同样的反应，获得目标产物。
(B)低聚核酸嵌段B(5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯])工序1 2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯的合成使用5’-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯替代实施例11(A)工序1的5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯，进行同样的反应，获得目标产物。
工序2 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]的合成使用实施例10中合成的化合物和实施例11(B)工序1中合成的化合物，进行与实施例11(A)工序2同样的反应，获得目标产物。
工序3 2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]的合成使用5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]替代实施例11(A)工序1中的5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯，进行同样的反应，获得目标产物。
工序4 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]的合成将0.33g实施例11(B)工序3中的合成的化合物和吡啶共沸后，将其溶于1.3ml四氢呋喃，加入吡啶0.22ml和4，4’-二甲氧基三苯甲基氯0.19g，室温下搅拌。2小时后，再加入4，4’-二甲氧基三苯甲基氯0.19g，搅拌1小时。将反应液注入饱和碳酸氢钠水溶液中，用乙酸乙酯萃取。有机层用饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(二氯甲烷～2％甲醇/二氯甲烷)精制，获得上述化合物0.42g。
(C)腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胸苷酰-[3’→5’]-胸苷工序1完整保护体的合成在0.035g低聚核酸嵌段B中加入吡啶和三乙胺及水的混合溶剂(3∶1∶1，0.22ml)，室温下搅拌20分钟。减压浓缩反应液，与吡啶共沸后，加入0.030g低聚核酸嵌段A，与吡啶共沸。将残渣溶于吡啶0.06ml，加入1-(2-均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)0.055g，室温下搅拌1小时。冰水冷却搅拌下，在反应液中加入55％吡啶水溶液2ml，加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取，再用饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩。用硅胶柱色谱法(二氯甲烷～2％甲醇/二氯甲烷)精制，将所得无色泡状物溶于少量的二氯甲烷，将其滴加入乙醚中，形成粉末。收集所得粉末，用乙醚洗涤，获得5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯0.029g。
熔点179～183℃工序2脱保护·精制工序在0.005g实施例11(C)工序1中合成的化合物中加入0.30M的吡啶-2-醛肟和N1，N1，N3，N3-四甲基胍的50％二烷水溶液，室温下搅拌40小时。减压浓缩反应液后，溶于1ml吡啶，加入28％氨水溶液2ml，密封后于55℃放置15小时。放冷后减压浓缩，在残渣中加入丙酮，离心后获得淡黄色的粉末。用反相ODS柱色谱法(乙腈/0.05M-TEAA缓冲液)对所得粉末进行精制。
在所得淡黄色粉末化合物中加入0.1M的乙酸-四甲基乙二胺缓冲液(pH3.88)0.05ml，于60℃放置30分钟。用0.30ml 0.05M-TEAA缓冲液稀释反应液，使其通过反相ODS(Sep-Pak VaC 2g，水，然后是50％氨水溶液)，获得作为目标化合物的腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胸苷酰-[3’→5’]-胸苷，OD(A260)为50.4。
实施例12
胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胸苷酰-[3’→5’]-胸苷工序1 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]的合成将1.32g 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷-3’-基磷酸2-氯苯酯三乙胺盐和0.77g 2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷-3’-基磷酸2-氰乙酯2-氯苯酯与吡啶共沸后，将其溶于4ml无水吡啶，加入1-(2-均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)0.99g，室温下搅拌1小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(1％甲醇/二氯甲烷～5％甲醇/二氯甲烷，含有0.1％吡啶)精制，获得上述化合物1.39g。
工序2 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯的合成在90mg实施例12工序1合成的化合物中加入吡啶-三乙胺-水(3∶1∶1)的溶液0.5ml，室温下搅拌30分钟。浓缩反应液后，加入胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯30mg，与吡啶共沸。将其溶于0.5ml无水吡啶，加入1-(2-均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)38mg，室温下搅拌1小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(2％甲醇/二氯甲烷～5％甲醇/二氯甲烷，含有0.1％吡啶)精制，获得上述化合物77mg。
工序3 2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]的合成在550mg实施例12工序1合成的化合物中加入0.5M肼/吡啶-乙酸(4∶1)溶液6ml溶解，室温下搅拌30分钟。于0℃加入丙酮1ml，搅拌5分钟后用乙酸乙酯稀释，将其注入饱和碳酸氢钠水溶液中分液。乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(2％甲醇/二氯甲烷～5％甲醇/二氯甲烷)精制，获得上述化合物465mg。
工序4 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]的合成在726mg实施例12工序1合成的化合物中加入吡啶-三乙胺-水(3∶1∶1)的溶液6ml，室温下搅拌15分钟。浓缩反应液后，加入实施例12工序3合成的化合物450mg，与吡啶共沸。将其溶于2ml无水吡啶，加入1-(2-均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)302mg，室温下搅拌2小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(2％甲醇/二氯甲烷～5％甲醇/二氯甲烷，含有0.1％吡啶)精制，获得上述化合物860mg。
工序5 2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯的合成在实70mg施例12工序2合成的化合物中加入0.5M肼/吡啶-乙酸(4∶1)溶液0.34ml溶解，室温下搅拌20分钟。于0℃加入丙酮1ml，搅拌5分钟后用乙酸乙酯稀释，将其注入饱和碳酸氢钠水溶液中分液。乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(2％甲醇/二氯甲烷～5％甲醇/二氯甲烷)精制，获得上述化合物57mg。
工序6 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯的合成在113mg实施例12工序4合成的化合物中加入吡啶-三乙胺-水(3∶1∶1)的溶液2ml，室温下搅拌15分钟。浓缩反应液后，加入55mg实施例12工序5合成的化合物，与吡啶共沸。将其溶于0.5ml无水吡啶，加入1-(2-均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)25mg，室温下搅拌2小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(2％甲醇/二氯甲烷～8％甲醇/二氯甲烷，含有0.1％吡啶)精制，获得上述化合物90mg。
工序7 2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]的合成在240mg实施例12工序4合成的化合物中加入0.5M肼/吡啶-乙酸(4∶1)溶液1ml溶解，室温下搅拌30分钟。于0℃加入丙酮0.5ml，搅拌5分钟后用乙酸乙酯稀释，将其注入饱和碳酸氢钠水溶液中分液。乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(2％甲醇/二氯甲烷～5％甲醇/二氯甲烷)精制，获得上述化合物185mg。
工序8 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4(4-茴香酰基)胞苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]的合成在288mg实施例12工序4合成的化合物中加入吡啶-三乙胺-水(3∶1∶1)的溶液4ml，室温下搅拌15分钟。浓缩反应液后，加入实施例12工序7合成的化合物180mg，与吡啶共沸。将其溶于0.5ml无水吡啶，加入1-(2-均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)63mg，室温下搅拌1.5小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(2％甲醇/二氯甲烷～6％甲醇/二氯甲烷，含有0.1％吡啶)精制，获得上述化合物339mg。
工序9 2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯的合成在90mg实施例12工序6合成的化合物中加入0.5M肼/吡啶-乙酸(4∶1)溶液1ml溶解，室温下搅拌20分钟。于0℃加入丙酮0.5ml，搅拌5分钟后用乙酸乙酯稀释，将其注入饱和碳酸氢钠水溶液中分液。乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(2％甲醇/二氯甲烷～6％甲醇/二氯甲烷)精制，获得上述化合物60mg。
工序10 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯的合成在105mg实施例12工序8合成的化合物中加入吡啶-三乙胺-水(3∶1∶1)的溶液2ml，室温下搅拌15分钟。浓缩反应液后，加入实施例12工序9合成的化合物58mg，与吡啶共沸。将其溶于0.5ml无水吡啶，加入1-(2-均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)25mg，室温下搅拌2小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(2％甲醇/二氯甲烷～6％甲醇/二氯甲烷，含有0.1％吡啶)精制，获得上述化合物80mg。
工序11 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]的合成将107mg 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷-3’-基磷酸2-氯苯酯三乙胺盐和175mg实施例12工序7中合成的化合物与吡啶共沸后，将其溶于1ml无水吡啶，加入1-(2-均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)61mg，室温下搅拌1.5小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(2％甲醇/二氯甲烷～6％甲醇/二氯甲烷，含有0.1％吡啶)精制，获得上述化合物225mg。
工序12 2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯的合成在55mg实施例12工序10合成的化合物中加入0.5M肼/吡啶-乙酸(4∶1)溶液1ml溶解，室温下搅拌15分钟。于0℃加入丙酮0.5ml，搅拌5分钟后用二氯甲烷稀释，将其注入饱和碳酸氢钠水溶液中分液。二氯甲烷层用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(2％甲醇/二氯甲烷～6％甲醇/二氯甲烷)精制，获得上述化合物44mg。
工序13 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-O-乙酸酯的合成在27mg实施例12工序11合成的化合物中加入吡啶-三乙胺-水(3∶1∶1)的溶液2ml，室温下搅拌15分钟。浓缩反应液后，加入实施例12工序12合成的化合物44mg，与吡啶共沸。将其溶于0.5ml无水吡啶，加入1-(2-均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)5mg，室温下搅拌3小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取，干燥，浓缩。残渣用硅胶柱色谱法(2％甲醇/二氯甲烷～6％甲醇/二氯甲烷，含有0.1％吡啶)精制，获得上述化合物42mg。
工序14脱保护及精制工序在20mg实施例12工序13合成的化合物中加入0.30M的吡啶-2-醛肟和N1，N1，N3，N3-四甲基胍的50％二烷水溶液，室温下搅拌72小时。减压浓缩反应液后，溶于1ml吡啶，加入28％氨水溶液5ml，密封后于55℃放置7小时，然后于室温彻夜放置。浓缩反应液，在残渣中加入丙酮，离心，获得淡黄色的粉末。用反相ODS柱色谱法(乙腈/0.05M-TEAA缓冲液)对所得粉末进行精制。在精制后产物中加入0.1M的乙酸-四甲基乙二胺缓冲液(pH 3.88)0.05ml，于60℃放置1小时。用反相ODS对反应液进行脱盐处理，获得作为目标化合物的胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胸苷酰-[3’→5’]-胸苷。
MALDI TOF MS计算值6344.86，实测值6345.69实施例135’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯用实施例12工序3的化合物替代实施例12工序11中的实施例12工序7合成的化合物，合成三聚体嵌段。然后，用先前合成的三聚体嵌段替代实施例12工序13中的实施例12工序11合成的化合物，用实施例12工序5的化合物替代实施例12工序12合成的化合物，进行同样的反应，合成作为目标产物的低聚核酸化合物。
实施例145’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯采用与实施例13同样的方法，使用2’位羟基的保护基为2-四氢吡喃基的核酸单体嵌段，合成作为目标产物的低聚核酸化合物。
实施例15作为试验化合物，采用2’位羟基的保护基为2-四氢呋喃基的实施例13的化合物和2’位羟基的保护基为2-四氢吡喃基的实施例14的化合物，按照以下所示的方法进行处理，通过比较探讨脱保护反应。
在18mg试验化合物中加入0.3M的N1，N1，N3，N3-四甲基胍及吡啶-2-醛肟的二烷/水(1/1)溶液(2ml)，室温下彻夜搅拌。浓缩反应液后，溶于吡啶(2ml)和浓氨水(10ml)，于55℃彻夜搅拌。浓缩反应液后加入丙酮，离心分离生成的沉淀并收集，用丙酮洗涤3次，干燥。在1mg干燥品中加入0.1M乙酸钠-乙酸缓冲液(pH 3.82)(1ml)，在各脱保护条件下进行反应，利用反相HPLC追踪反应。经过脱保护的化合物的收率(HPLC峰面积值)示于表1。
表1

从上述结果看出，作为2’位羟基的保护基使用了2-四氢呋喃基的情况下，在所有条件下都几乎定量地获得了经过脱保护的化合物。但是，在2’位羟基的保护基使用了2-四氢吡喃基的情况下，脱保护的化合物的生成不充分，这样可明显看出2’位羟基的保护基采用2-四氢呋喃基比较有效。
实施例16利用脂酶的乙酰丙酰基化5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷将50mg 2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷溶于2.5ml无水乙腈，再加入乙酰丙酸酐140mg和各种脂酶28mg，于室温下搅拌16小时，再使用反相HPLC求得作为反应生成物的5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷的收率。
结果示于表2。
表2

n.d.未检出从上述结果可看出，Novozym435(南极假丝酵母脂酶BNovo·Nordisk公司制)及LIPASE-QL(产碱杆菌属三酰基甘油脂酶，Alcaligenestriacylglycerol lipase名糖产业株式会社制)消耗了所有的原料化合物，仅生成5’位羟基被乙酰丙酰基化的化合物。
实施例17腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胸苷酰-[3’→5’]-胸苷工序1二聚体嵌段的合成采用与实施例12工序1同样的方法，分别合成5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]8.24g(MS(EI)m/z＝1321.2[M+Na])、5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]6.88g(MS(EI)m/z＝1382.4[M+Na])、5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]3.60g(MS(EI)m/z＝1273.4[M+Na])、5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]16.12g(MS(EI)m/z＝1454.5[M+Na])、5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]5.10g(MS(EI)m/z＝1164.3[M+Na])、5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]8.30g(MS(EI)m/z＝1454.5[M+Na])、5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]6.00g(MS(EI)m/z＝1297.4[M+Na])。
此外，合成作为参考例3的化合物的胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯3.31g。
工序2四聚体嵌段的合成采用实施例17工序1中合成的二聚体嵌段，按照与实施例12工序2同样的方法，合成5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯6.49g(MS(EI)m/z＝2062.0[M+H])，与实施例12工序4同样地合成5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]4.20g(MS(EI)m/z＝2492.7[M+H])、5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]2.30g(MS(EI)m/z＝2383.3[M+H])、5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]7.00g(MS(EI)m/z＝2429.2[M+Na])、5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]8.38g(MS(EI)m/z＝2562.1[M+Na])。
工序3 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氢基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-[O-(2-氰乙基)(2-氯苯基)磷酸酯]的合成使用实施例17工序2合成的化合物和实施例10的化合物，按照与实施例11(B)同样的方法，获得上述化合物3.70g。
工序4 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯的合成使用实施例17工序2合成的化合物和5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯，按照与实施例12工序5及工序6同样的方法，合成上述化合物6.04g。
工序5 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氢基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-(2-氯苯氢基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯的合成使用实施例17工序2合成的化合物和实施例17工序4合成的化合物，按照与实施例12工序5及工序6同样的方法，合成上述化合物7.04g。
工序6 5’-O-乙酰丙酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯的合成使用实施例17工序2合成的化合物和实施例17工序5合成的化合物，按照与实施例12工序5及工序6同样的方法，合成上述化合物3.60g。
工序7 5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N2-异丁酰基鸟苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)尿苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基-2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N6-(4-茴香酰基)腺苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基2’-O-(2-四氢呋喃基)-N4-(4-茴香酰基)胞苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基-胸苷3’-(2-氯苯氧基)磷酰基胸苷3’-乙酸酯的合成使用实施例17工序3合成的化合物和实施例17工序6合成的化合物，按照与实施例12工序12及工序13同样的方法，合成上述化合物4.27g。
工序8脱保护及精制工序在100mg实施例17工序7合成的化合物中加入0.30M的吡啶-2-醛肟和N1，N1，N3，N3-四甲基胍的50％二烷水溶液，室温下搅拌44小时。减压浓缩反应液后，溶于3ml吡啶，加入28％氨水溶液15ml，密封后于55℃放置11小时，然后于室温放置12小时。接着，于55℃放置11小时，再于室温放置12小时。浓缩反应液后加入丙酮，离心分离生成的沉淀，收集沉淀，用丙酮洗涤3次，干燥。用反相ODS柱色谱法(乙腈/0.05M-TEAA缓冲液)对所得粉末进行精制。在22mg精制后产物中加入0.1M的乙酸钠-乙酸缓冲液(pH 3.82)2ml，于60℃放置1小时。用反相ODS对反应液进行脱盐处理后冷冻干燥，再用离子交换柱色谱法(0→0.4M NaCl/10mM磷酸缓冲液)精制。用反相ODS对反应液进行脱盐处理并冷冻干燥后，获得作为目标化合物的腺苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-胸苷酰-[3’→5’]-胸苷12mg。
MALDI TOF MS计算值6615.07，实测值6615.34产业上利用的可能性作为本发明化合物的新的核糖核酸化合物是核糖2’位羟基被保护基保护，核糖3’位被磷酸三酯化，核糖5’位被乙酰丙酰基化的化合物，所述保护基在0℃～60℃的任一温度下、于pH2～4的酸性条件下、用24小时可脱离90％或90％以上。本发明化合物对于液相合成低聚RNA非常有用，是很重要的化合物。
此外，提供对于核糖2’位的羟基被保护基保护的核糖核酸化合物，利用脂酶易将核糖5’位的羟基位置选择性地乙酰丙酰基化的方法，所述保护基在0～60℃的任一温度下、于pH2～4的酸性条件下、用24小时可脱离90％或90％以上，该方法对于磷酸三酯化的核糖核酸化合物的制备非常重要。
另外，提供新的低聚RNA的液相合成法。
权利要求
1.以下的通式(1)表示的核糖核酸化合物或其盐， 式中，B表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶或者它们的修饰体，R1表示在0℃～60℃的任一温度下、于pH2～4的酸性条件下、用24小时可脱离90％或90％以上的保护基，R20表示H或可被取代的烷基，R21表示可被取代的芳基或者单环或双环的可被取代的杂环基。
2.如权利要求1所述的核糖核酸化合物或其盐，其中，R1为2-四氢呋喃基或1，3-二氧戊环-2-基。
3.如权利要求1或2所述的核糖核酸化合物或其盐，其中，R20为H、2-氰乙基或2，2，2-三氯乙基，R21为2-氯苯基或2-氯-4-叔丁基苯基。
4.以下的通式(3)表示的核糖核酸化合物的制法，其特征在于，通过使乙酰丙酰基化试剂和脂酶与以下的通式(2)表示的核糖核酸化合物反应，位置选择性地将5’位的羟基乙酰丙酰基化， 式中，B表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶或者它们的修饰体，R1表示在0℃～60℃的任一温度下、于pH2～4的酸性条件下、用24小时可脱离90％或90％以上的保护基。
5.以下的通式(1a)表示的核糖核酸化合物的制法，其特征在于，使磷酸化试剂作用于以下的通式(3)表示的核糖核酸化合物，该通式(3)表示的核糖核酸化合物利用具有使乙酰丙酰基化试剂和脂酶作用于以下的通式(2)表示的核糖核酸化合物而位置选择性地将5’位的羟基乙酰丙酰基化的工序的方法制得， 式中，B表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶或者它们的修饰体，R1表示在0℃～60℃的任一温度下、于pH2～4的酸性条件下、用24小时可脱离90％或90％以上的保护基，R21表示可被取代的芳基或者单环或双环的可被取代的杂环基。
6.以下的通式(1b)表示的核糖核酸化合物的制法，其特征在于，使磷酸化试剂及保护磷酸基的试剂作用于以下的通式(3)表示的核糖核酸化合物，该通式(3)表示的核糖核酸化合物利用具有使乙酰丙酰基化试剂和脂酶作用于以下的通式(2)表示的核糖核酸化合物而位置选择性地将5’位的羟基乙酰丙酰基化的工序的方法制得， 式中，B表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶或它们的修饰体，R1表示在0℃～60℃的任一温度下、于pH2～4的酸性条件下、用24小时可脱离90％或90％以上的保护基，R21表示可被取代的芳基或者单环或双环的可被取代的杂环基，R22表示可取代的烷基。
7.如权利要求4～6中任一项所述的核糖核酸化合物的制法，其特征在于，R1为2-四氢呋喃基或1，3-二氧戊环-2-基。
8.如权利要求4～7中任一项所述的核糖核酸化合物的制法，其特征在于，乙酰丙酰基化试剂为乙酰丙酸、乙酰丙酸酐、乙酰丙酸酯或乙酰丙酰卤化物。
9.如权利要求5～8中任一项所述的核糖核酸化合物的制法，其特征在于，磷酸化试剂为2-氯苯基偶磷三唑、2-氯苯基-O，O-双(1-苯并三唑基)磷酸酯或2-氯-4-叔丁基苯基偶磷三唑。
10.如权利要求6～9中任一项所述的核糖核酸化合物的制法，其特征在于，保护磷酸基的试剂为3-羟基丙腈或2，2，2-三氯乙醇。
11.具有以下的(a)～(f)工序的下述通式(4)表示的低聚核酸化合物的液相合成法， 式中，各Bx独立地表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶或者它们的修饰体，q表示1～100的范围内的整数，各R’中至少一个为羟基，除此以外独立地表示H或羟基；(a)通过使乙酰丙酰基化试剂和脂酶作用于以下的通式(2)表示的核糖核酸化合物，位置选择性地将5’位的羟基乙酰丙酰基化，制备以下的通式(3)表示的核糖核酸化合物的工序， 式中，B表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶或者它们的修饰体，R1表示在0℃～60℃的任一温度下、于pH2～4的酸性条件下、用24小时可脱离90％或90％以上的保护基；(b)通过使磷酸化试剂作用于利用上述(a)的工序制得的核糖核酸化合物(3)，将3’位的羟基磷酸化，制备以下的通式(1a)表示的核糖核酸化合物的工序， 式中，B、R1如前所述，R21表示可被取代的芳基或者单环或双环的可被取代的杂环基；(c)与上述(b)不同，通过使磷酸化试剂和保护磷酸基的试剂作用于利用上述(a)的工序制得的核糖核酸化合物(3)，制备以下的通式(1b)表示的核糖核酸化合物的工序， 式中，B、R1、R21如前所述，R22表示可被取代的烷基；(d)对于利用上述工序(c)制得的核糖核酸化合物(1b)，将乙酰丙酰基脱保护，制备以下的通式(5)表示的核糖核酸化合物的工序， 式中，B、R1、R21、R22如前所述；(e)通过将利用上述(b)或(d)的工序制备的核糖核酸化合物(1a)或(5)中的至少一种作为构成单体使用的阶段性低聚物化，制备以下的通式(6)表示的低聚核酸化合物的工序， 式中，各B’分别独立地表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶或者它们的修饰体，各R0独立地表示H、可被取代的芳基或者单环或双环的可被取代的杂环基，R3a表示H、乙酰丙酰基或4，4’-二甲氧基三苯甲基，q如前所述，各R1a中至少一个为被在0℃～60℃的任一温度下于pH2～4的酸性条件下用24小时可脱离90％或90％以上的保护基取代的羟基，除此以外独立地表示H或被在0℃～60℃的任一温度下于pH2～4的酸性条件下用24小时可脱离90％或90％以上的保护基取代的羟基，R2a表示酰基或以下的通式(7)表示的磷酸基， 式中，R2aa表示可被取代的芳基或者单环或双环的可被取代的杂环基，R2ab表示H或可被取代的烷基；(f)将利用上述(e)的工序制得的低聚核酸化合物(6)的保护基全部除去的脱保护工序。
12.如权利要求11所述的低聚核酸化合物的液相合成法，其特征在于，R1为2-四氢呋喃基或1，3-二氧戊环-2-基。
13.如权利要求11或12所述的低聚核酸化合物的液相合成法，其特征在于，q为1～100的范围内的整数。
14.如权利要求11～13中任一项所述的低聚核酸化合物的液相合成法，其特征在于，q为10～50的范围内的整数。
15.如权利要求11～14中任一项所述的低聚核酸化合物的液相合成法，其特征在于，乙酰丙酰基化试剂为乙酰丙酸、乙酰丙酸酐、乙酰丙酸酯或乙酰丙酰卤化物。
16.如权利要求11～15中任一项所述的低聚核酸化合物的液相合成法，其特征在于，磷酸化试剂为2-氯苯基偶磷三唑、2-氯苯基-O，O-双(1-苯并三唑基)磷酸酯或2-氯-4-叔丁基苯基偶磷三唑。
17.如权利要求11～16中任一项所述的低聚核酸化合物的液相合成法，其特征在于，保护磷酸基的试剂为3-羟基丙腈或2，2，2-三氯乙醇。
全文摘要
本发明提供对于液相合成低聚RNA非常重要的被磷酸三酯化的新的核糖核酸化合物。作为本发明可例举的通式表示的核糖核酸化合物，式中，B表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶或者它们的修饰体，R
文档编号C07H19/20GK1910193SQ20058000303
公开日2007年2月7日 申请日期2005年1月26日 优先权日2004年1月27日
发明者大木忠明, 上田稔浩, 丸山泰史, 增田博文 申请人:日本新药株式会社