专利名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒株及组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的2种减毒株，和包含一种或多种减毒的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)株的免疫原性组合物。
背景技术：
PRRS于1987年首次在美国被识别。它迅速传播遍及北美所有主要的猪生产区。它随后出现在欧洲，并且今天PRRSV具有几乎全世界的分布。许多猪生产者、政府官员和兽医相信PRRS是目前全世界的猪产业面临的最严重的经济威胁之一。
如其名称所暗示的，PRRS的临床特征在于其能够引起怀孕母猪繁殖失败，特别是当妊娠晚期开始感染时，和所有年龄的猪中的呼吸道疾病，但在小猪中最常见也最严重。还认为PRRSV感染加强其他猪病原体的作用。在回顾性血清研究的基础上，显而易见的是许多感染PRRSV的猪是亚临床的或产生较不明显的临床症状。因此PRRSV通常在其存在被首次检测之前进入猪群并广泛传播。
该病毒能够在受感染的宿主上持续至少数月。此类“带毒者”永久感染并使得疾病的控制变得极为困难。因此，用于减少PRRSV的经济影响的最有效方法是在潜在的易感染猪暴露于野生毒株(virulentfield strain)之前对其进行接种疫苗(免疫接种)。
由PRRSV的单个病毒株制备的减毒疫苗(由BoehingherIngelheim制造)是商购可得的。一种批准在3至18周的猪中用于预防呼吸道疾病(Gorcyca等人，1995)。一种批准用于育种前。
另一种减毒疫苗已描述用于预防繁殖失败(Hesse等人，1996)。它由PRRSV的单个病毒株制备而成并且已测试只针对PRRSV的单个病毒株。基于已接种疫苗的小母猪在攻击后的既往应答(anamnesticresponse)，将攻击病毒株描述为异种的；然而，没有提出其他证据以确定2种病毒株(即一种用于接种疫苗，和另一种用于免疫攻击)在遗传学上或抗原上不同。
存在2种已知的PRRSV的主要血清型(Done等人，1996)。一种(原型Lelystad)代表已在西欧分离到的至少大多数病毒株。另一种(原型ATCC 2332)代表至少在北美和亚洲分离到的大多数病毒株。在原型内还存在抗原变体(Meng等人，1995)，并且在北美分离到的病毒株中的碱基序列差异已允许用于其区分(Wesley等人，1996)。
发明概述本发明的目的是提供保护猪免于由PRRSV引起的临床疾病的免疫原性组合物。该免疫原性组合物来源于在美国从感染PRRSV的猪分离到的2种PRRSV病毒株。
本发明的另一目的是提供PRRSV的减毒株，它在针对PRRS的多价疫苗中将是有用的。
本发明不限于上文表达的目的，因为由于下列描述本发明的其他目的和优点将是显而易见的。
生物材料的保藏根据布达佩斯条约于2004年11月4日将减毒株PP5和LC13保藏在弗吉尼亚Manassas的美国典型培养物保藏中心并已分别指定保藏号ATCC PTA-6282和ATCC PTA-6281。根据37 C.F.R.§1.808，该生物材料在下面2种情况下可获得。首先，在专利申请审查过程中该保藏物将是可获得的，请求人可以向保藏委员会根据37 C.F.R.§1.14和35 U.S.C. §122确定的保藏机构获得该生物材料；其次，有一个例外，在该专利授权后，保藏人对公众获得该保藏材料所作的限制将不可避免地取消。
发明详述“免疫原性组合物”在本文中在其广义上指能够刺激动物免疫应答的可施用形式的任何类型的生物试剂。为了本发明的目的，免疫原性组合物可以包括病毒自身或病毒的免疫原性(抗原性)组分作为病毒试剂。
由下列2种PRRSV减毒株中的任何一种或多种制备本发明的免疫原性组合物PP5和LC13。单独测试每种病毒株诱导免疫应答的安全性和能力，并且考虑包括2种病毒株的多价疫苗将至少和每种单价组合物一样安全有效并且可以提供针对PRRSV野生毒株的更广泛的免疫。
选择2种PRRSV病毒株(病毒株PP5和LC13)用于开发免疫原性组合物和疫苗。
PRRSV病毒株PP5从来自患病猪的组织样品获得PRRS病毒的有毒分离物。将来自患病猪的组织匀浆接种到原代肺泡巨噬细胞中并且通过对已接种但非对照的培养物的细胞病变效应检测病毒的存在。随后通过间接免疫荧光法经由与PRRS病毒特异性的单克隆抗体的反应性证实分离的病毒。96孔板的汇合的Marc145细胞在感染病毒后2天用80％丙酮固定10分钟。单细胞层随后与SDOW17或VO17单克隆抗体一起孵育。洗涤后，通过与异硫氰酸荧光素缀合的抗小鼠IgG一起孵育，随后洗涤并通过显微镜检查荧光来检测单克隆抗体与每种病毒的反应性。对于PP5病毒，2种单克隆抗体都观察到阳性荧光。PP5病毒通过在组织培养中连续传代来减毒。该病毒通过接种原代猪肺泡巨噬细胞(SAM)培养物(对于第一代)进行最初的传代，并随后在Marc145细胞中连续传代，共81代。在这个过程中，通过噬斑纯化分离病毒克隆并根据表型性质进行表征。根据在猪肺泡巨噬细胞上的生长阻滞和在小猪和妊娠母猪中疾病诱导的缺乏来选择免疫原性组合物克隆PP5。PP5在Marc145细胞中扩增并作为主要毒种冷冻。
PP5通过其序列的ORF5区域可以与其他分离到的减毒的PRRSV病毒株区分开。PP5 ORF5序列由SEQ ID No.1表示。
PRRSV病毒株LC13从来自患病猪的组织样品获得PRRS病毒的有毒分离物。将来自患病猪的组织匀浆接种到原代肺泡巨噬细胞中并且通过对已接种但非对照的培养物的细胞病变效应检测病毒的存在。随后通过间接免疫荧光法经由与PRRS病毒特异性的单克隆抗体的反应性证实分离的病毒。96孔板的汇合的Marc145细胞在感染病毒后2天用80％丙酮固定10分钟。单细胞层随后与SDOW17或V017单克隆抗体一起孵育。洗涤后，通过与异硫氰酸荧光素缀合的抗小鼠IgG一起孵育，随后洗涤并通过显微镜检查荧光来检测单克隆抗体与每种病毒的反应性。对于LC13病毒，2种单克隆抗体都观察到阳性荧光。LC13病毒通过在组织培养中连续传代来减毒。该病毒首先分离自原代猪肺泡巨噬细胞培养物，并随后在Marc145细胞中连续传代，共67代。在这个过程中，通过噬斑纯化分离病毒克隆并根据表型性质进行表征。根据在猪肺泡巨噬细胞上的生长阻滞和在小猪和妊娠母猪中疾病诱导的缺乏来选择免疫原性组合物克隆(LC13)。LC13在Marc145细胞中扩增并作为主要毒种冷冻。
LC13通过其序列的ORF5区域可以与其他分离到的减毒的PRRSV病毒株区分开。LC13 ORF5序列由SEQ ID No.2表示。
制备组合物病毒用于通过在有效免疫接种剂量中含药学上可接受的载体或稀释剂(例如生理盐水或组织培养基)的制剂施用。表述“有效量”被定义为将在猪中诱导针对PRRSV毒株攻击的免疫性的量。实际剂量的确定将完全在本领域技术人员的范围内。基于下文给出的实施例，预期一个实施方案是大约104.5TCID50/ml的单剂量。
该组合物可以经口、口鼻或通过注射进行施用。如本领域已知的合适的佐剂可以包括在组合物制剂中。如前文所提及的，目的免疫原性组合物或疫苗可以单独使用，或它们可以以任何组合一起组合在多价组合物制剂中。
下列实施例用于举例说明本发明目的的成功获得。没有一个实施例预期限制其适用范围。
实施例使用MARC145作为基质(但也可使用其它支持PRRS病毒生长的细胞系，例如MA104细胞)制备免疫原性组合物。MARC145细胞在合适的组织培养瓶(即850cm2转瓶)中使用Eagle氏极限必需培养基(EMEM)生长至汇合，所述培养基包含5-10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和抗生素(例如30μg/ml庆大霉素)。还可以使用其它能够支持MARC145细胞生长的组织培养基，例如Dulbecco氏改良的必需培养基[DMEM]、Medium 199或其他。以1∶10的感染复数(MOI)(可以使用的MOI范围为1∶5至1∶1000)用PP5或LC13接种汇合的单层MARC145细胞。在37℃孵育3-5天后，通过倾析收集培养上清液。
通过在如上补充的EMEM中制备连续稀释物滴定病毒液并以0.2ml/孔接种到96孔组织培养板中汇合的MARC145或MA104细胞的至少4个重复孔。培养物在增湿室中在37℃、3-5％CO2下孵育5天并观察细胞病变效应。根据Spearman和Karber的方法计算滴定度(50％终点)。
为了制备灭活的免疫原性组合物或灭活的疫苗制剂，病毒液与化学灭活试剂例如甲醛、戊二醛、二元乙烯亚胺或β-丙内酯一起孵育。病毒液随后贮存于4℃直至配制到免疫原性组合物。通过将病毒液(包含105-109TCID50病毒；基于预-灭活滴定度)与生理学上可接受的稀释剂(例如EMEM、Hank′s Balanced Salt Solution、磷酸盐缓冲盐水)和免疫-刺激佐剂(例如矿物油、植物油、氢氧化铝、皂角苷、非离子型去污剂、角鲨烯或本领域已知的其他化合物，单独或组合使用)混合来制备免疫原性组合物。免疫原性组合物剂量一般为1-5ml。
对于活的免疫原性组合物或活疫苗制剂，病毒液(减毒病毒)在-50℃或以下冷冻贮存直至使用。病毒液(一般包含106.0TCID50/剂量，但在103.0和107.0TCID50/剂量范围内)用生理学上合适的稀释剂(例如EMEM、Hank′s Balanced Salt Solution、磷酸盐缓冲盐水)和生理学上合适的用于稳定病毒的化合物的混合物稀释。本领域已知的可以单独或组合用于稳定病毒的化合物包括蔗糖、乳糖、N-Z胺、谷胱甘肽、新蛋白胨(neopeptone)、明胶、葡聚糖和胰蛋白胨。疫苗冷冻贮存(-50℃或以下)或冻干贮存于4℃直至使用。免疫原性组合物或疫苗一般具有2ml的剂量大小(范围为1-5ml)。
为了针对PRRS诱导的疾病的预防，通过皮内、肌内、皮下、鼻内或口服施用一个剂量的疫苗用活的或灭活的免疫原性组合物对猪进行疫苗接种。在初次免疫接种后2-4周可以施用加强疫苗接种。为了预防PRRS相关疾病，接种方案一般在育种前最多6周开始并且可以迟至育种后1周时给予。为了预防小猪中的呼吸系统疾病，可以在早在3周大时给予疫苗接种。
减毒株的实例及其诱导免疫应答的能力PP5实验PRRS血清反应阴性的母猪在妊娠85天时鼻内(3ml/鼻孔)接种主要的种疫苗株PP5(104.5TCID50/ml)。所有母猪在其预期时间生产小猪。
表1提供了PP5 PRRS病毒株实验的结果。第一组PP5-WT是野生型病毒或有毒/疾病对照。组PP5-MSV是减毒的PP5病毒株的主要毒种。PP5-BP表示来自PP5-MSV的第5代(猪传代)，以察看是否发生了到野生型病毒的任何回复变异。
来自PP5实验的结果总结于表2中。与分别仅导致16％的分娩死亡率和19％的分娩死亡率的PP5-MSV和PP5-BP相比，PP5-WT导致69％的分娩死亡率。
表1PP5母猪 Blisa死亡率％@组 #抗体 出生PP5-WT 40 NT 100％PP5-WT 165 0.9 85％PP5-WT 313 1.3 67％PP5-WT 1138 1.2 25％PP5-WT 1156 1.2 45％PP5-WT总数 69％PP5-MSV 1344 0.51120％PP5-MSV 1347 0.0020％PP5-MSV 1348 1.00540％PP5-MSV 1350 1.15115％PP5-MSV 1353 0.8990％PP5-MSV 1355 1.18813％PP5-MSV总数 16％PP5-BP 1345 0.93238％PP5-BP 1346 0.56 13％PP5-BP 1349 0.51533％PP5-BP 1351 0.5690％PP5-BP 1352 1.17427％PP5-BP 1354 0.6240％PP5-BP总数 19％
表2PP5的总结死亡率％@出生野生型病毒 69％ PP5-WT主要毒种 16％ PP5-MSV后代病毒 19％ PP5-BPLC13实验PRRS 血清反应阴性的母猪在妊娠85天时鼻内(3ml/鼻孔)接种主要的种疫苗株LC13(104.5TCID50/ml)。所有母猪在其预期时间生产小猪。
表3提供了LC13 PRRS病毒株实验的结果。第一组LC13-WT是野生型病毒或有毒/疾病对照。组LC13-MSV是减毒的LC13病毒株的主要毒种。LC13-BP表示来自LC13-MSV的第5代(猪传代)，以察看是否发生了到野生型病毒的任何回复变异。
来自LC13实验的结果总结于表4中。LC-WT导致86％的分娩死亡率，而LC13-MSV和LC13-BP分别仅导致12％的分娩死亡率和15％的分娩死亡率。
表3LC13母猪 Elisa 死亡率％@组 #抗体 出生LC13-WT 187 1.375％LC13-WT 309 NT 100％LC13-WT 518 0.8100％LC13-WT 858 1.288％LC13-WT 1041 1.256％LC13-WT总数 86％LC13-MSV843 1.00％
LC13-MSV 845 0.7 8％LC13-MSV 846 0.0 0％LC13-MSV 848 1.1 25％LC13-MSV 850 1.0 11％LC13-MSV总数 12％LC13-BP 844 ＜0.1 0％LC13-BP 847 ＜0.1 31％LC13-BP 849 ＜0.1 10％LC13-BP 851 ＜0.1 11％LC13-BP 853 ＜0.1 0％LC13-BP总数 13％表4LC13的总结死亡率％@出生野生型病毒 86％LC13-WT主要毒种12％LC13-MSV后代病毒13％LC13-BP在表1和3中找到的酶联免疫吸附测定(Elisa)抗体数据表示来自对猪的Elisa抗体测定的结果。ELISA是用于检测针对PRRS的抗体的最常使用的测试。由IDEXX Laboratories Inc.制造的HerdChekPRRS ELISA用于检测来自猪血清或血浆的抗-PRRSV核壳体(N)蛋白抗体。基于样品/阳性(S/P)值确定测试结果阳性＝S/P比＞0.4、阴性＝S/P比＜0.4。如表1和3中所示结果，LC13-MSV和PPS-MSV产生了针对PRRS的抗体。所产生的数据提供了免疫原性组合物的证据。
本申请中给出的数据清楚地表明减毒的PRRS病毒株PP5和LC13都是安全的并能诱导免疫应答。
权利要求
1.用于诱导针对由猪繁殖与呼吸综合征引起的疾病的免疫应答的免疫原性组合物，其包含有效量的减毒的PRRS病毒，其选自减毒的PRRS病毒ATCC PTA-6281、减毒的PRRS病毒ATCC PTA-6282及其组合；和药学上可接受的载体或稀释剂。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述病毒是减毒的PRRS病毒ATCC PTA-6281。
3.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述病毒是减毒的PRRS病毒ATCC PTA-6282。
4.用于诱导针对由猪繁殖与呼吸综合征引起的疾病的免疫应答的多价免疫原性组合物，其包含有效量的2种或更多种减毒的病毒，包括PRRS病毒ATCC PTA-6281和PRRS病毒ATCC PTA-6282。
5.权利要求1的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
6.减毒的猪繁殖与呼吸综合征病毒PP5，其ATCC保藏号为PTA-6282。
7.减毒的猪繁殖与呼吸综合征病毒LC13，其ATCC保藏号为PTA-6281。
8.用于保护猪免于猪繁殖与呼吸综合征的方法，其包括用有效量的减毒的PRRS病毒接种所述猪，所述减毒的PRRS病毒选自减毒的PRRS病毒ATCC PTA-6281、减毒的PRRS病毒ATCC PTA-6282及其组合，其中所述减毒的PRRS病毒配制于药学上可接受的载体或稀释剂中。
9.权利要求8的方法，其中所述病毒是减毒的PRRS病毒ATCCPTA-6281。
10.权利要求8的方法，其中所述病毒是减毒的PRRS病毒ATCCPTA-6282。
11.权利要求9的方法，其中所述制剂进一步包含佐剂。
13.减毒的猪繁殖与呼吸综合征病毒，其具有SEQ ID NO1或SEQID NO2所示的ORF5。
全文摘要
本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的2种减毒株，和包括一种或多种减毒的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)株的免疫原性组合物。
文档编号C07K14/08GK101084011SQ200580043842
公开日2007年12月5日 申请日期2005年11月9日 优先权日2004年11月19日
发明者R·赫西 申请人:英特威国际有限公司