专利名称：一种来源于植物秸秆料的纤维素酶解助剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种纤维素酶解助剂，特别涉及一种来源于植物秸秆料的纤维素酶解助剂。
背景技术：
天然纤维素是地球上储量最丰富的可再生资源。在我国储量也很丰富，每年产量是11.45亿吨；其中，仅秸秆、皮壳产量就达7亿吨之多；此外，来源于林业副产品、城市垃圾和工业废物中的天然纤维素数量也很可观。但这些资源长期未得到合理的开发，除极少量用作造纸、饲料外，其余大都被焚烧。这既是对天然资源的巨大浪费，又造成了环境的严重污染。纤维素水解代表了全球碳循环的最大物质流之一，其在植物生物量转化成能源和化工产品过程中的潜在重要性早被人们认识到。
纤维素酶水解工艺具有条件温和、副产物少、无污染等优点，是降解天然纤维素的高效途径，并得到了广泛重视和深入研究。因此纤维素酶是打开天然纤维素可再生资源的钥匙。
植物细胞壁由纤维素、半纤维素和木质素组成，它们之间通过氢键和各种化学键形成了致密的超分子结构。这种致密的聚集态也使纤维素酶与其很难接近，降低了天然纤维素的降解效率。而且目前纤维素酶的比活力普遍较低，生产技术不够成熟，从而使酶的生产成本过高，也阻碍了天然纤维素资源的大规模利用。因此，植物细胞壁组分之间氢键的断裂和高效廉价纤维素酶的生产是天然纤维素降解的瓶颈随着近年来试验技术的进步，人们发现植物细胞壁除了多糖和多聚酚类物质外，还含有上百种蛋白，其含量约占细胞壁重量的10％。对植物生长调控分子机制的研究表明，细胞壁蛋白与植物细胞生长和发育、细胞壁结构和膨胀、对生物和非生物压力、新陈代谢和胞外刺激响应等诸多方面有关。分析表明，植物细胞壁蛋白可能参与了纤维素、半纤维素和木质素之间及内部氢键的断裂。
发明内容
本发明涉及的目的在于提供一种来源于植物秸秆料的纤维素酶解助剂。
本发明的技术方案如下本发明提供的来源于植物秸秆料的纤维素酶解助剂，其特征在于，使用下述方法制备1、制备植物秸秆细胞壁将经超微粉碎后的植物秸秆料加入清水中进行清洗，每次清洗后用尼龙滤布过滤，收集滤布上的滤渣，该滤渣即为植物秸秆细胞壁；2、细胞壁蛋白的浸提按植物秸秆细胞壁与NaOH溶液的质量份配比为1∶6-1∶10的比例，在步骤1制得的植物秸秆细胞壁中加入含20-50mM L-抗坏血酸VC(维生素C)、质量百分比为0.1-0.5％巯基乙醇、1-5mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和5-10mM乙二胺四乙酸(EDTA)的0.1-0.5mol/L的NaOH溶液；在30-70℃温度下保温10-30小时，并每隔3-5小时添加一次苯甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度为1-5mM进行提取；提取完成后，1000-3000转/min离心5-15min，收集所得上清液；该上清液即为植物秸秆细胞壁蛋白提取液；3、制备纤维素酶解助剂将步骤2中获得的植物秸秆细胞壁蛋白提取液用盐酸调pH至4.5～5.5，并加入1-2倍体积的-20℃的95％V/V的酒精充分摇匀，在4℃下放置1-3小时；3000-10000转/min离心10-20min获得沉淀物，将该沉淀物进行低温真空干燥，便制得植物秸秆细胞壁蛋白，该植物秸秆细胞壁蛋白即为本发明的纤维素酶解助剂。
所述的超微粉碎后的植物秸秆料的粒度为40～60目；清洗1-3次所述的植物秸秆料为玉米秸秆料、麦草料、高粱秸秆料或玉米秸秆与高梁秸秆的混合秸秆料。
所制得的纤维素酶解助剂(植物秸秆细胞壁蛋白)的产量约占植物秸秆细胞壁干重的1-4％。
尽管植物秸秆细胞壁蛋白自身没有明显的降解纤维素的活力，但对真菌纤维素酶活力却有明显的增效作用。而农作物秸秆是储量非常丰富的、成本低廉的可再生资源，从植物秸秆中提取细胞壁蛋白，可实现细胞壁蛋白的大规模生产。
本发明的来源于植物秸秆料的纤维素酶解助剂具有以下优点1、本发明首次提出了以秸秆细胞壁蛋白作为纤维素酶解助剂的新理念；每毫克秸秆细胞壁粗蛋白对纤维素酶滤纸酶活力的增效率高达90％，是一种理想的纤维素酶解助剂，可大幅度降低纤维素酶的使用量和成本；2、秸秆细胞壁蛋白的提取率达到3.54％；同时避免使用液氮冷冻，超声波震荡、LiCl等高成本操作和试剂，使生产成本大大降低。
3、为植物秸秆的高质化利用开辟了一条新的途径。细胞壁蛋白占秸秆细胞壁干重的10％，含量极其丰富。但到目前为止，细胞壁蛋白并没有得到任何利用。而每年植物通过光合作用合成的生物质就达亿万吨(100×109t)，由于种种原因，大量的生物质资源被浪费了，其中就包括农作物的秸秆。本发明以农作物秸秆为原料，利用细胞壁蛋白的纤维素酶增效特性，制备新型的纤维素酶解助剂，所得纤维素酶解助剂(植物秸秆细胞壁蛋白)可用于促进天然生物质资源的生物转化。这实际上为充分利用秸秆这种可再生的生物质资源，开辟了广阔的应用前景。
4、本发明所使用的原料是农作物秸秆，在我国秸秆资源丰富且价格低廉，这保证了细胞壁蛋白生产的低成本和充足的原料供应。
具体实施例方式
实施例1将玉米秸秆超微粉碎50目，按玉米秸秆料与清水的质量份配比为1∶10的比例，将玉米秸秆料加入水中，进行清洗2次；每次清洗后用尼龙滤布过滤，最后滤布上的滤渣即是制得的细胞壁。
在细胞壁中按细胞壁与NaOH溶液的质量份配比为1∶8的比例加入0.1NNaOH溶液(该NaOH溶液中含30mM L-抗坏血酸VC、质量百分比为0.3％巯基乙醇、3mM PMSF和8mM EDTA)，在50℃温度条件下保温20小时，并每隔4小时添加一次PMSF至终浓度3mM；提取完成后，2000转/min离心10min取上清液；上清液用盐酸调PH至4，并加入1.5倍体积的-20℃的95％V/V的酒精充分摇匀，在4℃下放置2小时；8000转/min离心15min以获得沉淀物，沉淀物经低温真空干燥后，便制得玉米秸秆细胞壁蛋白——纤维素酶解助剂；其产量约占玉米秸秆细胞壁干重的3％。
取10ml的具塞刻度试管若干，分别加入1，纤维素酶；2，纤维素酶+细胞壁蛋白；3，细胞壁蛋白。并用50mM醋酸缓冲液(PH＝4.8)将各试管的溶液体积补至3.0ml。再在各试管中加入50mg新华1号滤纸。将试管置于50℃恒温水浴中反应60min。取出后，分别在各试管中加入0.75mlDNS溶液，摇匀后沸水浴5min，冷却后用蒸馏水定溶，至10ml，充分混匀。在520nm波长下测光密度值来检测酶解后释放的还原糖。
结果表明细胞壁蛋白自身没有酶活力，但能够使纤维素滤纸酶活力提高90％。
实施例2将麦草超微粉碎自40目，按麦草料与清水的质量份配比为1∶6的比例，将麦草料加入水中，进行清洗1次；每次清洗后用尼龙滤布过滤，最后滤布上的滤渣即是制得的细胞壁。
在细胞壁中按细胞壁与NaOH溶液的质量份配比为1∶6的比例加入0.1NNaOH溶液(该NaOH溶液中含20mM L-抗坏血酸VC、质量百分比为0.1％巯基乙醇、1mMPMSF和5mM EDTA)，在30℃温度条件下保温10小时，并每隔3小时添加一次PMSF至终浓度1mM；提取完成后，1000转/min离心5min取上清液；上清液用盐酸调PH至4.5，并加入1倍体积的-20℃的95％(V/V)的酒精充分摇匀，在4℃下放置1小时；3000转/min离心10min以获得沉淀物，沉淀物经低温真空干燥后，便制得麦草细胞壁蛋白——纤维素酶解助剂；其产量约占麦草细胞壁干重的1％。
取10ml的具塞刻度试管若干，分别加入1，纤维素酶；2，纤维素酶+细胞壁蛋白；3，细胞壁蛋白。并用50mM醋酸缓冲液(PH＝4.8)将各试管的溶液体积补至3.0ml。再在各试管中加入50mg新华1号滤纸。将试管置于50℃恒温水浴中反应60min。取出后，分别在各试管中加入0.75mlDNS溶液，摇匀后沸水浴5min，冷却后用蒸馏水定溶，至10ml，充分混匀。在520nm波长下测光密度值来检测酶解后释放的还原糖。
结果表明细胞壁蛋白自身没有酶活力，但能够使纤维素滤纸酶活力提高50％。
实施例3将高梁秸秆超微粉碎自60目，按高梁秸秆料与清水的质量份配比为1∶12的比例，将高梁秸秆料加入水中，进行清洗3次；每次清洗后用尼龙滤布过滤，最后滤布上的滤渣即是制得的细胞壁。
在细胞壁中按细胞壁与NaOH溶液的质量份配比为1∶10的比例加入0.5NNaOH溶液(该NaOH溶液中含50mM L-抗坏血酸VC、质量百分比为0.5％巯基乙醇、5mM PMSF和10mM EDTA)，在70℃温度条件下保温30小时，并每隔5小时添加一次PMSF至终浓度5mM；提取完成后，3000转/min离心15min取上清液；上清液用盐酸调PH至5.5，并加入2倍体积的-20℃的95％(V/V)的酒精充分摇匀，在4℃下放置3小时；10000转/min离心20min以获得沉淀物，沉淀物经低温真空干燥后，便制得高梁秸秆细胞壁蛋白——纤维素酶解助剂；其产量约占高梁秸秆细胞壁干重的1.5％。
取10ml的具塞刻度试管若干，分别加入1，纤维素酶；2，纤维素酶+细胞壁蛋白；3，细胞壁蛋白。并用50mM醋酸缓冲液(PH＝4.8)将各试管的溶液体积补至3.0ml。再在各试管中加入50mg新华1号滤纸。将试管置于50℃恒温水浴中反应60min。取出后，分别在各试管中加入0.75mlDNS溶液，摇匀后沸水浴5min，冷却后用蒸馏水定溶，至10ml，充分混匀。在520nm波长下测光密度值来检测酶解后释放的还原糖。
结果表明细胞壁蛋白自身没有酶活力，但能够使纤维素滤纸酶活力提高80％。
实施例4将玉米秸秆和高梁秸秆的混合秸秆料超微粉碎自60目，按混合秸秆料与清水的质量份配比为1∶9的比例，将混合秸秆料加入水中，进行清洗3次；每次清洗后用尼龙滤布过滤，最后滤布上的滤渣即是制得的细胞壁。
在细胞壁中按细胞壁与NaOH溶液的质量份配比为1∶9的比例加入0.3NNaOH溶液(该NaOH溶液中含40mM L-抗坏血酸VC、质量百分比为0.5％巯基乙醇、4mM PMSF和9mM EDTA)，在60℃温度条件下保温24小时，并每隔4小时添加一次PMSF至终浓度4mM；提取完成后，3000转/min离心15min取上清液；上清液用盐酸调PH至5.5，并加入1.5倍体积的-20℃的95％(V/V)的酒精充分摇匀，在4℃下放置3小时；8000转/min离心20min以获得沉淀物，沉淀物经低温真空干燥后，便制得混合秸秆料细胞壁蛋白——纤维素酶解助剂；其产量约占混合秸秆料细胞壁干重的2.5％。
取10ml的具塞刻度试管若干，分别加入1，纤维素酶；2，纤维素酶+细胞壁蛋白；3，细胞壁蛋白。并用50mM醋酸缓冲液(PH＝4.8)将各试管的溶液体积补至3.0ml。再在各试管中加入50mg新华1号滤纸。将试管置于50℃恒温水浴中反应60min。取出后，分别在各试管中加入0.75mlDNS溶液，摇匀后沸水浴5min，冷却后用蒸馏水定溶，至10ml，充分混匀。在520nm波长下测光密度值来检测酶解后释放的还原糖。
结果表明细胞壁蛋白自身没有酶活力，但能够使纤维素滤纸酶活力提高60％。
权利要求
1.一种来源于植物秸秆料的纤维素酶解助剂，其特征在于，使用下述方法制备1)制备植物秸秆细胞壁将经超微粉碎的植物秸秆料加入清水进行清洗，每次清洗后用尼龙滤布过滤，收集滤布上的滤渣，该滤渣即为植物秸秆细胞壁；2)植物细胞壁蛋白的浸提按植物秸秆细胞壁与NaOH溶液的质量份配比为1∶6-1∶10的比例，在步骤1)制备的植物秸秆细胞壁中加入含20-50Mm L-抗坏血酸VC、质量百分比为0.1-0.5％巯基乙醇、1-5mM苯甲基磺酰氟和5-10mM乙二胺四乙酸的0.1-0.5mol/L的NaOH溶液；在30-70℃温度条件下保温10-30小时，并每隔3-5小时添加一次苯甲基磺酰氟至终浓度为1-5mM进行提取；提取完成后，1000-3000转/min离心5-15min，收集所得上清液；该上清液即为植物秸秆细胞壁蛋白提取液；3)纤维素酶解助剂将步骤2中获得的植物秸秆细胞壁蛋白提取液用盐酸调pH至4.5～5.5，并加入1-2倍体积的-20℃的95％V/V的酒精充分摇匀，在4℃下放置1-3小时；3000-10000转/min离心10-20min获得沉淀物，将该沉淀物进行低温真空干燥，便制得植物秸秆细胞壁蛋白，该植物秸秆细胞壁蛋白即为纤维素酶解助剂。
2.按权利要求1所述的来源于植物秸秆料的纤维素酶解助剂，其特征在于，所述的经超微粉碎的植物秸秆料的颗粒度为40-60目。
3.按权利要求1所述的来源于植物秸秆料的纤维素酶解助剂，其特征在于，所述的植物秸秆料为玉米秸秆料、麦草料、高粱秸秆料或玉米秸秆与高梁秸秆的混合秸秆料。
全文摘要
本发明涉及用下述方法制备的来源于植物秸秆料的纤维素酶解助剂将植物秸秆粉料进行水清洗、过滤得细胞壁滤渣；按配比加入含20－50mM抗坏血酸VC、质量百分比0.1－0.5％巯基乙醇、1－5mM PMSF、5－10mM EDTA的0.1－0.5mol/L NaOH溶液；30－70℃温度下保温10－30小时，并每隔3－5小时添加一次PMSF至终浓度为1－5mM进行提取；提取完成后，离心并收集上清液；将上清液用盐酸调pH，并加入酒精充分摇匀，经放置再离心获沉淀物，再进行低温真空干燥，得占秸秆细胞壁干重10％的纤维素酶解助剂。本发明原料充足，成本低廉，为植物秸秆的高质化利用开辟了新途径。
文档编号C07K2/00GK101092447SQ20061009013
公开日2007年12月26日 申请日期2006年6月23日 优先权日2006年6月23日
发明者陈洪章, 卢迪, 韩业君 申请人:中国科学院过程工程研究所